PT1398369E - Bactérias bifidobacterium longum e preparações que as contêm - Google Patents

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Leone Gabriele Rotini
Giuseppe Claudio Viscomi
Lorenzo Morelli
Maria Rosaria Pantaleo
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Description

ΕΡ 1 398 369 /PT
DESCRIÇÃO "Bactérias Bifidobacterium longvm e preparações que as contêm" 0 presente invento refere-se à utilização de microorganismos não patogénicos do género Bifidobacterium longum para ajudar na saúde gastrointestinal e em particular para prevenir e/ou tratar as indisposições do tracto gastrointestinal, em particular do intestino. Há muito tempo que se conhecem muitos tipos de bactérias utilizadas como agentes de fermentação para a conservação de alimentos ou para a preparação de alimentos lácteos tal como iogurte ou outros produtos lacticínios; essas bactérias são denominadas pelo termo geral "bactérias do ácido láctico" e compreendem muitos géneros tais como Lactococcus, Lactobacillus, Streptococcus, Bifidobacterium e Pediococcus.
Mais recentemente, essas bactérias tornaram-se objecto de maior atenção porque, quando engolidas, mostraram propriedades notáveis no Homem e em animais; em particular estirpes de Lactobacillus ou Bifidobacterium, algumas vezes administradas juntas em combinações, mostraram eficácia na colonização da mucosa intestinal e na ajuda à saúde de pessoas, prevenindo a colonização de outros microorganismos patogénicos, conforme foi referido nas patentes US 5494664 e 6241983 e nos Pedidos de Patentes Internacionais WO 0033854 e WO 0110453.
Esses microorganismos são também denominados "probióticos" e um requisito fundamental para o seu efeito benéfico é que possam atingir a mucosa intestinal em número e com vitalidade suficientes para que consigam persistir e colonizar o intestino, sendo portanto necessário que resistam adequadamente ao pH baixo do estômago. A suposição de produtos probióticos é recomendada no caso de indisposições intestinais, tais como obstipação ou diarreia e após períodos de tratamento com antibióticos, i.e. em particular em todas aquelas circunstâncias que conduzem a um empobrecimento da flora bacteriana intestinal e também em todas aquelas circunstâncias em que uma alimentação pobre em 2
ΕΡ 1 398 369 /PT fibras, condições ambientais, ou stress diminuem a vitalidade da flora bacteriana intestinal. 0 objectivo dessa administração é o restabelecimento dos níveis adequados de microorganismos naturalmente presentes na flora bacteriana intestinal através da utilização de estirpes bacterianas bem caracterizadas e extraídas da flora de pessoas saudáveis. A actividade de colonização de microorganismos exógenos no intestino depende da sua concentração, da sua capacidade em colonizar e das condições ambientais que eles encontram no intestino, pois a administração de uma maior quantidade, uma elevada capacidade de colonização e condições ambientais adequadas ajudam o seu efeito protector e curativo através da colonização de grandes porções no intestino sem efeitos colaterais visto serem produtos de origem natural. Em particular, deve salientar-se que a possível presença de fibras alimentares, como por exemplo inulina ou fruto-oligossacáridos, ajuda principalmente a colonização porque esses compostos são um substrato para o probiótico e, deste modo, aumentam as possibilidades de colonização. Os referidos oligossacáridos foram também denominados "pré-bióticos" devido à sua acção sinergética com o probiótico. A US 5494664 refere-se a uma cultura biologicamente pura de uma estirpe seleccionada do grupo que consiste em Bifidobacterium breve CNCM 1-1226, Bifidobacterium infantis CNCM 1-1227, e Bifidobacterium longum CNCM 1-1228.
Em Microbial Ecology in Health and Disease 1999; 11: 41-46 apresentam-se os efeitos da administração de iogurte de Bifidobacterium longum BB536 sobre o meio intestinal de adultos saudáveis. A US 6306638 apresenta uma estirpe mutante isolada de Bifidobacterium que se desenvolve aerobicamente, que é cerca de 10 vezes mais tolerante ao ácido clorídrico do que a Bifidobacterium a um pH de aproximadamente 1,5-4,5, e que é tolerante a bílis de bovino a aproximadamente 0,3% (p/v num meio de cultura). 3
ΕΡ 1 398 369 /PT
DESCRIÇÃO DO INVENTO 0 objecto do presente invento são culturas biologicamente puras de uma estirpe de Bifidobacterium longum denominada Wll depositada no Belgian Coordinated Collections of
Microorganisms - BCCM LMG-Collection que a registou com o número de matricula LMG P-21586, a sua utilização como probióticos nas preparações de tipo farmacêutico ou alimentar e nas preparações de tipo farmacêutico ou alimentar que a contenha úteis para ajudar na saúde gastrointestinal e na prevenção e tratamento de patologias intestinais. A estirpe Bifidobacterium longum Wll foi isolada da flora bacteriana intestinal de um homem saudável e foi seleccionada entre muitas outras estirpes de Bifidobacterium longum isoladas ao mesmo tempo porque mostrou uma capacidade de colonização na flora bacteriana intestinal e uma capacidade de aderência às células intestinais, caracteristicas que a tornam um agente probiótico muito bom, capaz de ajudar a boa saúde do trato gastrointestinal e a restabelecer a sua funcionalidade alterada de gastrenterite de várias origens. A cultura bacteriana objecto do presente invento foi produzida primeiro em laboratório e depois em preparações industriais e é constituída por estirpes puras que cresceram durante 20 horas, a 37°C, num meio de cultura adequado,, denominado TPY contendo como componentes principais peptona de caseína tríptica, peptona de soja, extracto de levedura e glucose em adição a sais de potássio, cálcio, magnésio e zinco. A partir dessas culturas primárias prepararam-se subculturas subsequentes com o objectivo de aumentar o número de células de estirpes puras até se obterem as culturas mãe que foram utilizadas como inoculação para a produção industrial das culturas bacterianas do probiótico de Bifidobacterium longum Wll. O processo de produção industrial da referida cultura bacteriana proporciona os seguintes passos: 1. fermentação a um pH controlado entre 5,5 e 7,5; 4
ΕΡ 1 398 369 /PT 2. separação da biomassa bacteriana do caldo de cultura por centrifugação; 3. liofilização da biomassa bacteriana, após a adição de crioprotectores adequados seleccionados de proteídos, hidratos de carbono e sais minerais para salvaguardar a vitalidade das células ao longo do passo de congelação e liofilização, possivelmente também com a adição de um precipitado proteico com a intenção de aumentar a resistência da estirpe à degradação enzimática e a condições de pH ácido; 4. moagem e granulação da cultura liofilizada. 0 produto assim preparado contém uma média de cerca de lxlO10 a cerca de lxlO12 células vivas de Bifidobacterium longum Wll para cada grama de produto final, analisado em conformidade com os métodos microbiológicos de contagem de bactérias conhecidos dos peritos na especialidade, como por exemplo os referidos em Ison A. P. and Matthew G. B., Applied Microbial Physiology a practical approach, Rhodes P. M. and Stanbury P.F. Editors - IRL Press Oxford, 103-130, 1997. A cultura bacteriana foi verificada em testes de colonização do intestino de ratinhos com resultados positivos, assim como a contagem da quantidade de carga bacteriana de
Bifidobacterium longum LMG P-21586 mostrou um valor superior a lxlO6 de células vivas para cada grama de fezes de ratinho.
Outro objectivo do presente invento, resultando estritamente do objectivo principal, é a utilização da cultura biologicamente pura obtida das estirpes de Bifidobacterium longum Wll como probiótico em preparações de tipo farmacêutico ou alimentar úteis na ajuda na saúde gastrointestinal e na prevenção e tratamento de patologias intestinais como a diarreia, a gastrenterite de várias origens, a obstipação, intestino irritável, doença de diverticulose e doenças inflamatórias crónicas do intestino. A eficácia das culturas bacterianas contendo a Bifidobacterium longum Wll a ajudar na saúde gastrointestinal pode ser aumentada adicionando às preparações de tipo farmacêutico ou alimentar que as contenham, fibras alimentares na forma de oligossacáridos indigestas, por exemplo fruto- 5 ΕΡ 1 398 369 /PT oligossacáridos ou inulina, que não são absorvidas nem hidrolisadas no primeiro trato do intestino e fortalecem a actividade e estimulam o metabolismo das estirpes de Bifidobacterium longum LMG P-21586 para desvantagem das bactérias patológicas. Os oligossacáridos preferidos na realização do presente invento são misturas de fruto-oligossacáridos constituídos por uma unidade básica que consiste numa molécula de glicose (G) ligada a uma cadeia de moléculas de frutose (F) de fórmula geral GFn, com n^4, possuindo um grau de polimerização, i.e. um número de unidades de monossacáridos, entre 2 e 20. Os fruto-oligossacáridos usados como pré-bióticos associados com os dois tipos de probióticos objecto do presente invento possuem um grau de polimerização entre 2 e 10, de preferência entre 3 e 6. A preparação objecto do presente invento pode conter, junto com vários excipientes como edulcorantes, por exemplo aspartame, manitol ou sorbitol, substâncias aromatizantes e corantes, vitaminas, preferencialmente vitaminas dos grupos E, Bl, B2, B6 e B12, possuindo a intenção de ajudar ainda a saúde restabelecendo a componente vitamínica que sofre uma forte diminuição durante as patologias do trato intestinal. O objecto do presente invento são as preparações farmacêuticas e os produtos alimentares contendo culturas bacterianas de Bifidobacterium longum denominadas Wll e registadas com o número de referência LMG P-21586, opcionalmente em associação com pré-bióticos, de preferência fruto-oligossacáridos ou inulina, e/ou vitaminas, de preferência vitaminas dos grupos E, Bl, B2, B6 e B12.
As preparações farmacêuticas são preferencialmente constituídas por composições administráveis por via oral na forma de cápsulas, comprimidos, saquetas, pastilhas, suspensões líquidas, suplementos orais secos, suplementos orais líquidos, frascos e alguns mais contendo uma carga bacteriana de células vivas de Bifidobacterium longum Wll entre lxlO7 e lxlO11 no final do período de estabilidade.
As referidas preparações farmacêuticas podem também conter agentes pré-bióticos como os fruto-oligossacáridos ou a inulina, de preferência de 0,5 a 5 g de fruto-oligossacáridos 6
ΕΡ 1 398 369 /PT por cada dose, com maior preferência de 1 a 3 g, e/ou vitaminas, de preferência vitaminas dos grupos E, Bl, B2, B6 e B12 .
Podem ser incorporadas quantidades de probiótico de lxlO7 a lxlO11 células vivas de Bifidobacterium longum também no fabrico de muitos tipos de produtos alimentares como o leite, iogurte, queijos frescos do tipo ricotta, stracchino e mozzarella (tipos de queijo Italiano), gelados, produtos feitos de leite fermentado, produtos feitos de cereais fermentados, leites em pó, produtos para crianças e produtos para animais domésticos
Os testes para a verificação do número de bactérias mostrou que a estirpe de Bifidobacterium longum objecto do presente invento é resistente, de modo que não sofre mortalidade notável quer durante os processos tecnológicos de produção das preparações farmacêuticas ou alimentares, quer ao longo do período normal do seu armazenamento. De facto, essas preparações bacterianas foram submetidas a testes de estabilidade que mostraram uma resistência extremamente boa das duas estirpes bacterianas à temperatura ambiente, de modo que se pode continuar a sua venda durante não menos de dois anos após o seu fabrico.
Os exemplos aqui seguidamente referidos são úteis para uma posterior ilustração do invento e não devem ser considerados como limitações suas. EXEMPLO 1 Método de fabrico da cultura bacteriana da estirpe Bifidobacterium longum Wll A "cultura primária" da estirpe de Bifidobacterium longum Wll utilizada como inoculação nas fermentações industriais é exactamente a mesma que a depositada no Belgian Coordinated Collections of Microorganisms - BCCM LMG-Collection Laboratorium voor Microbiologie, Universidade de Gent, que na aceitação da estirpe despachada ratificou a pureza e a vitalidade da estirpe e a registou com o número de referência LMG P-21586. 7
ΕΡ 1 398 369 /PT
Para obter esta "cultura primária", fez-se crescer a referida estirpe num meio de cultura denominado TPY possuindo a seguinte composição quando referida a um litro: • 10 g de peptona tríptica de caseína • 5 g de peptona de soja • 5 g de extracto de levedura • 10 g de glucose • 2 g de K2HP04 anidro • 0,5 g de MgCÍ2.6H20 • 0,25 g de ZnS04.7H20 • 0,15 g de CaCl2.2H20 • 1 ml de Tween 80 • 0,5 g de cloridrato de cisteína • q.s. a 1000 ml de água destilada duas vezes
Efectuou-se o crescimento a 37°C durante 20 horas e depois dividiu-se a cultura, com a adição de crioprotectores adequados seleccionados de proteídos, hidratos de carbono e sais minerais, em frascos congelados e guardados em azoto líquido a -196°C.
Partindo da "cultura primária", com um percentagem de inoculação de 3%, prepararam-se 3 subculturas com o objectivo de aumentar o número de células da estirpe bacteriana.
Utilizou-se a última subcultura de cerca de 10 litros, denominada "cultura mãe", para inocular o reactor da "cultura intermediária" possuindo uma capacidade de cerca de 300 litros. 0 processo subsequente de fabrico industrial da cultura biologicamente pura de Bifidobacterium longum Wll compreende os seguintes passos: 1. fermentação a um pH controlado entre 6,5 e 7,0; 2. separação da biomassa bacteriana do caldo de cultura; 3. protecção da biomassa bacteriana por meio de uma solução de crioprotectores seleccionados de proteídos, hidratos de carbono e sais minerais com o objectivo de salvaguardar a vitalidade das células durante os subsequentes passos de congelação e liofilização, e possivelmente também incluindo um precipitado proteico 8
ΕΡ 1 398 369 /PT com o objectivo de também conferir à estirpe uma resistência à degradação enzimática e a condições de pH ácido; 4. liofilização; 5. moagem e granulação da cultura liofilizada; 6. mistura da cultura liofilizada; 7. empacotamento. 0 produto obtido contém cerca de 8 - ΙΟχΙΟ10 células vitais por cada grama. EXEMPLO 2
Testes in vivo de colonização
Realizaram-se os testes em 4 grupos de 2 ratinhos, cada ratinho recebeu duas doses, a segunda 16 horas após a primeira, de uma solução de glucose contendo Bifidobacterium longum LMG P-21586 a uma concentração igual a 1,6x109 CFU/60 μΐ.
Verificou-se a capacidade da estirpe em colonizar o intestino desses ratinhos calculando a quantidade de
Bifidobacterium longum presentes nas fezes: a primeira recolha de amostras foi efectuada antes do inicio das administrações, ao passo que as subsequentes recolhas de amostras foram efectuadas respectivamente 2, 4, 8, 24, 48 horas após a segunda administração. A quantidade da estirpe de Bifidobacterium longum encontrada nas fezes foi na região de 106 CFU/g, mostrando assim a ocorrência de colonização. Em particular, verificou-se que a Bifidobacterium longum resultou ser o principal componente da flora bacteriana relativamente a todas as estirpes de bifidobactérias encontradas nas fezes. EXEMPLO 3
Formulação em saquetas em associação com fruto-oligossacáridos e vitaminas
Como exemplo, refere-se a preparação em saquetas, pesando cada uma 3 g, para se dissolverem em água ou em leite e contendo 250 mg de cultura bacteriana biologicamente pura, o 9
ΕΡ 1 398 369 /PT que corresponde a cerca de 2xl010 células vivas de
Bifidobacterium longum Wll, 2500 mg de fruto-oligossacáridos e vitaminas dos grupos Bl, B2, B6 e B12.
Em particular, utilizou-se como fruto-oligossacáridos o produto comercialmente disponível denominado Actilight® 950P feito de uma mistura de fruto-oligossacáridos formada por uma cadeia de moléculas de frutose unida a uma molécula de glucose de fórmula geral GFn com n < 4 e com um grau de polimerização entre 2 e 10 A composição qualitativa e quantitativa detalhada das saquetas é a seguinte:
Componente mg Bifidobacterium longum Wll 250 Actilight® 950P 2500 Vitamina Bl 1,4 Vitamina B2 1,6 Vitamina B6 2 Vitamina B12 0,001 Aroma de tangerina 20 Aspartame 20 Sílica gel 10 Sorbitol 195 Método de Preparação
Efectua-se um primeiro passo de mistura das vitaminas com uma parte alíquota de Actilight® 950P seguido de peneiração num crivo com 0,5 mm de abertura de malha. Junta-se esta primeira mistura com uma segunda parte alíquota de Actilight® 950P e efectua-se um segundo passo de mistura. Finalmente, adicionam-se a cultura bacteriana de Bifidobacterium longum Wll, a restante parte alíquota de Actilight® 950P e os outros componentes da formulação ainda com mistura seguida de uma peneiração final num crivo de 0,8 mm. 10
ΕΡ 1 398 369 /PT
Divide-se então o produto em saquetas de alumínio pesando 3 g. O processo tecnológico de preparação das saquetas não causa quaisquer danos à vitalidade da estirpe.
Testes de estabilidade
Realizaram-se os testes de estabilidade nas saquetas medindo a carga bacteriana no instante zero e respectivamente após 1, 2 e 3 meses de armazenagem a 22°C, fixando assim o tempo de meia-vida. A análise dos dados após 1, 2 e 3 meses mostrou como a mortalidade foi muito baixa nesses períodos de tempo, de modo que resultou que após dois anos o número de células vivas para cada dose foi não inferior a 5xl09 células na formulação da saqueta referida anteriormente. O referido resultado mostra que esta preparação é totalmente adequada aos objectivos que o presente invento pretende alcançar. EXEMPLO 4
Formulações de cápsulas de gel mole em associação com vitaminas
Prepararam-se cápsulas de gel mole com a seguinte composição qualitativa e quantitativa:
Componente mg Bifidobacterium longum Wll 125 Mono- e diglicéridos de ácidos gordos 14 Óleo de soja 261,372 Lecitina de soja 5 Tocoferóis naturais (E) 16,418 Mononitrato de tiamina (Bl) 2,072 Cloridrato de Piridoxina (B6) 2,918 Riboflavina (B2) 1, 920 Cianocobalamina 0,1% (B12) 1,300 Gelatina alimentar 116 Glicerol 71 Dióxido de Titânio 4, 140 Óxido de Ferro Amarelo 0,200 11 ΕΡ 1 398 369 /PT efectuando uma suspensão homogénea da cultura bacteriana de Bifidobacterium longum Wll, das vitaminas, da lecitina de soja e dos mono e diglicéridos dos ácidos gordos em óleo de soja, dividindo a referida suspensão em cápsulas ovais de tamanho 7,5 feitas de gelatina alimentar, glicerol, dióxido de titânio e óxido de ferro amarelo e depois secando com um fluxo de ar a uma temperatura de cerca de 21 °C e com cerca de 20% de humidade.
Lisboa,

Claims (8)

  1. ΕΡ 1 398 369 /PT 1/1 REIVINDICAÇÕES 1. Cultura biologicamente pura da estirpe Bifidobacterium longum LMG P-21586.
  2. 2. Utilização da cultura biologicamente pura de acordo com a reivindicação 1 como probiótico para o fabrico de preparações de tipo farmacêutico ou alimentar para ajudar a saúde gastrointestinal e prevenir e tratar patologias intestinais.
  3. 3. Preparações de tipo farmacêutico ou alimentar, contendo uma carga bacteriana entre lxlO7 e lxlO11 de células vivas que resultam de uma cultura biologicamente pura constituída pela estirpe de Bifidobacterium longum LMG P-21586.
  4. 4. Preparações de acordo com a reivindicação 3 caracterizadas por conterem um pré-biótico na forma de oligossacáridos.
  5. 5. Preparações de acordo com a reivindicação 4 caracterizadas por os oligossacáridos serem fruto— oligossacáridos com um grau de polimerização entre 2 e 10 ou inulina.
  6. 6. Preparações de acordo com qualquer das reivindicações 3 a 5 caracterizadas por conterem vitaminas.
  7. 7. Preparações de acordo com a reivindicação 6 caracterizadas por as vitaminas serem as vitaminas E, Bl, B2, B6 e Bl2.
  8. 8. Preparações de acordo com qualquer uma das reivindicações de 3 a 7 caracterizadas por serem seleccionadas entre cápsulas, comprimidos, saquetas, pastilhas, suspensões liquidas, suplementos orais secos, suplementos orais líquidos, frascos, leite, iogurte, queijo fresco, gelados, produtos feitos de cereais fermentados, leites em pó, produtos para crianças e produtos para animais domésticos. Lisboa,
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