JP2009538614A - プロバイオティクス菌株及びこれに由来する抗菌性ペプチド - Google Patents
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Abstract
【選択図】 図1
Description
下記アミノ酸配列:
MSQVVGGKYYGNGVSCNKKGCSVDWGKAIGIIGNNSAANLATGGAAGWKS(配列番号12)、
そのフラグメントであって、抗菌活性を有するフラグメント、
そのムテイン及び誘導体であって、抗菌活性を有するムテイン及び誘導体、
その共有結合架橋体であって、抗菌活性を有する共有結合架橋体、又は、
前記アミノ酸配列に対して約95%を超える相同性、好ましくは85%を超える相同性、最も好ましくは約75%を超える相同性を有する配列であって、抗菌活性を有する配列、
を有する、細菌エンテロコッカス・ムンドティ由来の単離されたペプチドが提供される。
下記ヌクレオチド配列:
ATGTCACAAGTAGTAGGTGGAAAATACTACGGTAATGGAGTCTCATGTAATAAAAAAGGGTGCAGTGTTGATTGGGGAAAAGCTATTGGCATTATTGGAAATAATTCTGCTGCGAATTTAGCTACTGGTGGAGCAGCTGGTTGGAAAAGT(配列番号11)、
その相補体、
そのフラグメントであって、その発現後に、抗菌活性を有するペプチドを産生することができるフラグメント、又は、
厳密なハイブリダイゼーション条件下でそれとハイブリダイズするヌクレオチド配列、
を含むことができる。
動物又はヒトにおける細菌感染状態を治療する方法であって、動物又はヒトの感染領域を、
本発明のエンテロコッカス・ムンドティ株の薬学的有効量、及び
本発明の抗菌性ペプチドの薬学的有効量、
のいずれか1つ又は複数を含む群から選択される物質又は組成物に曝すステップを含む方法が提供される。
細菌エンテロコッカス・ムンドティ由来の単離されたトランスポーターペプチドであって、
配列番号14のアミノ酸配列、
そのフラグメント、
そのムテイン及び誘導体、又は、
前記アミノ酸配列に対して約90%を超える相同性、好ましくは80%を超える相同性、最も好ましくは約70%を超える相同性を有する配列であって、抗菌活性を有する配列、
を有するペプチドが提供される。
配列番号13のヌクレオチド配列、
その相補体、
そのフラグメント、又は、
厳密なハイブリダイゼーション条件下でそれとハイブリダイズするヌクレオチド配列、
を含むことができる。
細菌エンテロコッカス・ムンドティ由来の単離された免疫ペプチドであって、
配列番号16のアミノ酸配列、
そのフラグメント、
そのムテイン及び誘導体、又は、
前記アミノ酸配列に対して約90%を超える相同性、好ましくは80%を超える相同性、最も好ましくは約70%を超える相同性を有する配列であって、抗菌活性を有する配列、
を有するペプチドが提供される。
配列番号15のヌクレオチド配列、
その相補体、
そのフラグメント、又は、
厳密なハイブリダイゼーション条件下でそれとハイブリダイズするヌクレオチド配列、
を含むことができる。
配列番号1及び配列番号2を含むプライマー対、
配列番号3及び配列番号4を含むプライマー対、
配列番号5及び配列番号6を含むプライマー対、
配列番号7及び配列番号8を含むプライマー対、並びに
配列番号9及び配列番号10を含むプライマー対、
から選択されるプライマー対を包含する。
表2は、ST4SA株の示差的特徴を示す。
表3は、ペプチドST4SAに対する、酵素、温度、pH及び変性剤の影響を示す。
表4は、ペプチドST4SAの活性スペクトルを示す。
表5は、ペーパーディスクにおけるペプチドST4SAの活性を示す。
表6は、一般に使用される抗生物質とのペプチドST4SAの活性の比較を示す。
表7は、病原体へのペプチドST4SAの接着を示す。
表8は、病原体をペプチドST4SAで処理した後に記録された細胞外DNAを示す。
表9は、病原体をペプチドST4SAで処理した後に記録されたβ−ガラクトシダーゼ活性を示す。
表10は、(コンピューター化された)GIMの操作を示す。
表11は、GIMにおけるST4SA株の生存及びペプチドST4SAの産生を示す。リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)が標的生物(病原体)として使用された。値は3回の試験の平均値である。使用された栄養物は、それぞれ、NAN Pelargon(Nestle)及びMRS(De Man Rogosa培地、Biolab)であった。
表12は、ST4SA株の抗生物質抵抗性を示す。
表13は、異なる濃度のトリメトプリム−スルファメトキサゾール(TMP−SMX)及びメトロニダゾールの存在下におけるST4SA株の成長を示す。
表14は、アッセイされた毒性因子を示す。
表15は、平板計数によるCaco−2細胞系へのST4SA株の接着を示す(コントロール)。
表16は、ST4SA株及びL.モノサイトゲネスの競合的排除を示す。
表17は、ST4SA株、Lactovita又は非補充の水が投与されたラットについての体重値を示す。
表18は、(A)107日のLactovitaでの研究の期間中、及び(B)50日のST4SA株での研究の期間中における雄性Wistarラットの便サンプルにおけるβ−グルクロニダーゼ活性を示す。値は、2時間当たりの放出されたmMでのp−ニトロフェノールである。標準誤差値がかっこ内に示される。
表19は、MRSf(MRSろ液)培地中のペプチドST4SAの精製を示す。
表20は、ペプチドST4SAの産生のための成長培地として試験された純粋なCSL、廃糖蜜及びCWpについての結果を示す。
表21は、どの培地がペプチドST4SAの産生に対して最も著しい影響が有ったかを明らかにするための成分としてのCSL及びCWpに関する全要因設計(FFD)を示す。
表22は、ST4SA活性の最適化のためにMRS成分が補充されたCSLの結果を示す。
表23は、MRS成分及びCSLの高濃度及び低濃度を示す。
表24は、210−5FrFD設計を示す。
表25は、210−5FrFD設計についての分散分析表を示す。
表26は、CSL及びYEの濃度を決定するための3中心点による22FFDを示す。
表27は、発酵期間中の炭素取り込みを示す。
表28は、抗菌剤及び抗炎症性薬物に対するE.ムンドティ ST4の抵抗性試験の結果を示す。
表29は、Caco−2細胞へのST4SAの接着に対する抗菌剤及び抗炎症性医薬品の影響を示す。
〔ST4SA株の単離及び種レベルへの同定〕
無菌の蒸留水に4時間浸けたダイズから得られるダイズ抽出物を連続希釈し、真菌の成長を防止するために50mg/lのナタマイシン(Delvocid(登録商標)、Gist−brocades,B.V.、Delft、オランダ)が補充されたMRS寒天(Biolab、Biolab Diagnostics、Midrand、SA)に置床した。平板を30℃及び37℃で2日間インキュベーションした。
配列番号1:フォワードプライマー:AACGAGCGCAACCC
配列番号2:リバースプライマー:GACGGGCGGTGTGTAC
抗菌活性を無細胞上清1ml当たりの任意単位(AU)として表した。1AUは、成長阻害の明瞭な領域を示す最大希釈の逆数として定義され、下記のように計算される。
ab×100
式中、「a」は希釈倍数を表し、「b」は、直径が少なくとも2mmである阻害域をもたらす最終希釈を表す。活性は、100を乗じることによって1ml当たりで表される。ラクトバチルス・カセイLHSを指示菌として使用した。
ST4SA株をMRSブロス(Biolab)において30℃で24時間及び48時間培養した。細胞を集め(8000×g、4℃、15分)、無細胞上清を6MのNaOHによりpH6.0に調節した。それぞれの上清の1mlを、0.1mg/ml(最終濃度)でのカタラーゼ(Boehringer Mannheim)、並びに1mg/ml及び0.1mg/ml(最終濃度)でのプロテイナーゼK(Roche、Indianopolis、IN、米国)、プロナーゼ、パパイン、ペプシン及びトリプシン(Boehringer Mannheim GmbH、ドイツ)によりそれぞれ処理した。インキュベーション後、酵素を熱不活化し(100℃で3分)、前に記載したように抗菌活性について試験した。結果が表3に示される。
ST4SA株の24時間培養物をMRSブロス(Biolab)に接種した(2%、v/v、OD600nm=8.0)。インキュベーションを、撹拌することなく、37℃で20時間行った。細胞を集め(8000×g、10分、4℃)、ペプチドを80%飽和の硫酸アンモニウムにより無細胞上清から沈殿させた。沈殿物を1/10体積の25mM酢酸アンモニウム(pH6.5)に再懸濁し、1000Daカットオフの透析メンブレン(Spectrum Inc.、CA、米国)を使用することによって蒸留水に対して脱塩し、SepPak C18カラム(Water Millipore、MA、米国)にロードした。カラムを25mM酢酸アンモニウム(pH6.5)中20%(v/v)のイソプロパノールにより洗浄し、バクテリオシンを25mM酢酸アンモニウム(pH6.5)中40%のイソプロパノールにより溶出した。真空下で乾燥した後(Speed−Vac;Savant)、フラクションをプールし、50mMリン酸塩緩衝液(pH6.5)に溶解した。活性のあるフラクションを、AKTApurifier(Amersham)に連結されたSuperdex(商標)75カラム(Amersham Pharmacia Biotech)でのゲルろ過クロマトグラフィーによってさらに分離した(図4)。カラムからのペプチドの溶出を50mMリン酸塩緩衝液及び400mM NaCl(pH6.5)により行った。ペプチドを254nm及び280nmでそれぞれ検出した。活性のあるペプチドを含有するフラクションを集め、真空下で乾燥し、−20℃で保存した。活性試験を、寒天スポット方法を使用することによって行った。
ST4SA株をMRSブロス(Biolab)において30℃で20時間成長させた。細胞を遠心分離(8000×g、10分、4℃)によって集め、ペプチドST4SAを80%飽和の硫酸アンモニウムにより無細胞上清から沈殿させた。沈殿物を1/10体積の25mM酢酸アンモニウム(pH6.5)に再懸濁し、1000Daカットオフの透析メンブレン(Spectrum Inc.、CA、米国)を使用することによって蒸留水に対して脱塩し、トリシン−SDS−PAGEによって分離した(図5A)。2.35kDaから46kDaに及ぶサイズを有する低分子量マーカー(Amersham International、英国)を使用した。活性なバクテリオシンの位置を明らかにするために、ゲルを固定し、一方の半分を、脳心臓浸出物(BHI)寒天(Biolab)に埋め込まれたL.casei LHS(106cfu/ml)により覆った(図5B)。
ペプチドST4SAが細胞毒性的性質を有するかどうかを明らかにするために、コンフルエントな単層のサル腎臓Vero細胞(1組3ウェル)を組織培養プレートで48時間成長させ、その後、様々な濃度の抗菌性ペプチドに曝した。48時間のインキュベーションの後、細胞の生存能を、細胞をテトラゾリウム塩MTT[3−(4,5−ジメチルチアゾール−2−ガンマ−2,5−ジフェニルテトラゾリウムブロミド](Sigma)で処理することによって試験した。コハク酸デヒドロゲナーゼによるMTTの切断の後で形成する青色生成物(ホルマザン)の生成を記録した。
総DNAを単離した。プラスミドDNAを単離し、その後、DNAをCsCl密度勾配遠心分離によってさらに精製した。DNAをアガロースゲルで分離した(図6)。EcoRI及びHindIIIにより消化されたラムダDNA(Promega、Madison、米国)を分子量マーカーとして使用した。
キュアリング実験を行った。Ent.ムンドティ ST4SAの細胞をノボビオシン(1μgml−1〜25μgml−1)の存在下において37℃で72時間インキュベーションした。最高濃度のノボビオシンにおいて成長した培養物を無菌の生理的食塩水により連続希釈し、MRS寒天平板に置床した。37℃での一晩のインキュベーションの後、コロニーをレプリカ置床し、元となった平板をエンテロコッカス・フェカリスLMG13566の細胞により覆った。37℃でさらに16時間インキュベーションした後、コロニーを抗菌活性の喪失について調べた。
フィルターかけ合わせ実験を行った。Ent.ムンドティ ST4SA及びEnt.フェカリス FA2−2の一晩成長させた培養物(0.25ml)を4.5mlのMRSに加え、混合し、0.45μmの細孔サイズの無菌メンブレンフィルター(HAWP、Millipore)でろ過した。メンブレンをMRS寒天平板に置き、37℃で一晩インキュベーションした。細胞をフィルターから1mlのMRSに洗い出し、連続希釈し、25μgml−1のフシジン酸、25μgml−1のリファンピシン及び2000AUml−1の粗ペプチドST4SAを含有するMRS寒天平板に置床した。実験を、Ent.フェカリス OGX1を受容菌として用いて繰り返した。この場合、選択を、1mgml−1のストレプトマイシン及び2000AUml−1の粗ペプチドST4SAを含有する平板で行った。コロニーを無作為に選択し、前に記載したように、ペプチドST4SAの産生について調べ、また、プラスミド含有量についてスクリーニングした。pST4SAを含有した、Ent.フェカリス OGX1の接合細胞のコロニーを培養し、無細胞上清を、前に記載したように活性試験に供した。
総DNAを単離した。構造遺伝子、トランスポーター遺伝子及び免疫遺伝子(これらは下記に示される)をPCRによって増幅するために使用されたDNAプライマーを、他の抗菌性ペプチドについて発表された部分配列に基づいて設計した。配列決定をABIPrism(商標)377DNA Sequencer(PE Applied Biosystem、Foster City、米国)においてABIPrism(商標)BigDye(商標)Terminator Cycle Sequencing Ready Reactionキットにより行った。データベース検索を、National Center for Biotechnology Information(NCBI)(Bethesda、MD20894、米国)のBLASTNプログラム及びBLASTXプログラムを使用することによって行った。
配列番号3:SG−a:TGAGAGAAGGTTTAAGTTTTGAAGAA(フォワード)
配列番号4:SG−b:TCCACTGAAATCCATGAATGA(リバース)
配列番号5:ABC1−a:TGATGGATTTCAGTGGAAGT(フォワード)
配列番号6:ASC1−b:ATCTCTTCTCCGTTTAATCG(リバース)
配列番号7:ABC2−a:GTCATTGTTGTGGGGATTAT(フォワード)
配列番号8:ABC2−b:TCTAGATACGTATCAAGTCC(リバース)
配列番号9:Immun−a:TTCCTGATGAACAAGAACTC(フォワード)
配列番号10:Immun−b:GTCCCCACAACCAATAACTA(リバース)
ST4SA株の18時間培養物を、MRSブロス、BHIブロス及びM17ブロス(Merck、Darmstadt、ドイツ)にそれぞれ接種した(2%、v/v)。インキュベーションを、撹拌することなく、28時間、30℃及び37℃でそれぞれ行った。サンプルを1時間毎に採取し、細菌の成長(600nmでのOD)、培養物pHにおける変化、及びL.casei LHSに対する抗菌活性(AU/ml)について調べた。寒天スポット試験方法を、前に記載したように使用した。
ST4SA株を10mlのMRSブロスにおいて30℃で18時間成長させ、細胞を遠心分離(8000×g、10分、4℃)によって集め、ペレットを10mlの無菌のペプトン水に再懸濁した。この細胞懸濁物の4mlを使用して、下記培地の200mlに接種した。(a)MRSブロス(De Man、Rogosa及びSharpe)で、有機栄養分を含まず、トリプトン(20.0g/l)、肉抽出物(20.0g/l)、酵母抽出物(20.0g/l)、トリプトン(12.5g/l)+肉抽出物(7.5g/l)、トリプトン(12.5g/l)+酵母抽出物(7.5g/l)、肉抽出物(10.0g/l)+酵母抽出物(10.0g/l)、又はトリプトン(10.0g/l)、肉抽出物(5.0g/l)及び酵母抽出物(5.0g/l)の組合せがそれぞれ補充されたもの;(b)MRSブロス(Biolab)、すなわち、20.0g/lのグルコースを含むもの;(c)MRSブロス(De Man、Rogosa及びSharpe)で、グルコースを含まず、20.0g/lのフルクトース、スクロース、ラクトース、マンノース及びマルトースがそれぞれ補充されたもの;(d)MRSブロスで、0.1〜40.0g/lのフルクトースを唯一の炭素源として含むもの;(e)MRSブロス(De Man、Rogosa及びSharpe)で、2.0〜50.0g/lのK2HPO4又は2.0〜50.0g/lのKH2PO4を含むもの;及び(f)MRSブロス(De Man、Rogosa及びSharpe)で、0〜50.0g/lのグリセロールが補充されたもの。別個の実験において、シアノコバラミン(Sigma、St.Louis、Mo)、L−アスコルビン酸(BDH Chemicals Ltd、Poole、英国)、チアミン(Sigma)、DL−6,8−チオクト酸(Sigma)及びビタミンK1(Fluka Chemie AG、CH−9471 Buchs、スイス)の各ビタミンをフィルター滅菌し、MRSブロスに1.0mg/ml(最終濃度)で加えた。すべての試験のためのインキュベーションは30℃で20時間であった。ペプチドST4SAの活性レベルを、前に記載したように測定した。すべての実験を3連(triplicate)で行った。
配列番号16:フォワードプライマー:AACGAGCGCAACCC
配列番号17:リバースプライマー:GACGGGCGGTGTGTAC
エンテロコッカス・ムンドティST4SAの生存を、コンピューター化された胃腸モデル(GIM、これは図25に示される)において評価した。
ST4SA株をプロバイオティクス菌として開発するためには、これに伴う何らかの毒性因子が存在するかを知ることが重要である。プライマーが、下記の毒性因子をコードする遺伝子について設計されている。バンコマイシン抵抗性(VanA/VanB);ゼラチナーゼ(Gel)の産生;凝集物質(AS);腸球菌由来のコラーゲンのアドヘシン(Ace);腸球菌表面タンパク質(Esp);溶血素/バクテリオシン(Cyl)及び非細胞溶解素β溶血素の遺伝子。ST4SA株のDNAが後者のプライマーにより増幅されたことにより、この菌株は、バンコマイシン抵抗性、ゼラチナーゼ活性、凝集物質及びコラーゲン接着をコードする遺伝子を有しないことが示された。これらの結果に基づけば、ST4SA株は病原性でなく、また、アルルギー反応を、摂取されたときに引き起こさないはずである。
ポリエチレン(PE)に対するペプチドST4SAの結合を試験した。PEフィルムを5×5cmの切片に切断し、60%イソプロパノール及びペプチドST4SAの溶液(活性レベル:102400AU/ml)に1時間浸した。PE切片を風乾し(60℃で20分間)、標準的な寒天拡散方法を使用することによって抗菌活性についてアッセイした。平板にL.サケイ DSM20017を播種した後、平板を30℃で24時間インキュベーションし、成長阻害域について調べた。
エンテロコッカス・ムンドティST4SAの生存を、示されるようなコンピューター化された胃腸モデルにおいて評価した。この段階はプロバイオティクス菌としてのST4SA株のさらなるインビトロ評価及びインビボ評価を含んでいた。粘膜及び上皮細胞に対する接着を、ヒト細胞株を用いてインビトロで調べた。インビボ研究をラットにおいて行った。
毒性因子の存在、すなわち、バンコマイシン抵抗性(VanA/VanB/VanC1/VanC2/VanC3)の存在、ゼラチナーゼ(Gel)の産生、凝集物質(AS)、腸球菌由来のコラーゲンのアドヘシン(Ace)、腸球菌表面タンパク質(Esp)、溶血素/バクテリオシン(Cyl)及び非細胞溶解素β溶血素の遺伝子を、インビトロ検査及び/又はPCRスクリーニングによって調べた。DNAを標準的な方法に従ってE.ムンドティST4から抽出した。後者の遺伝子を増幅するために設計されたプライマーは記載の通りであった。結果が表14に示される。
ASの産生を性フェロモンの存在下での集塊形成アッセイで調べた。性フェロモンを、フェロモン産生菌(エンテロコッカス・フェカリスJH2−2)をMRSブロスにおいて37℃で18時間成長させることによって得た。フェロモン産生菌(E.フェカリス OG1X)の上清をマイクロタイタープレートでの集塊形成アッセイにおいて使用した。200マイクロリットルをST4SA株とともに接種し(0.5%、v/v)、2時間後、4時間後、8時間後及び24時間後に細胞の集塊形成について顕微鏡で調べた。細胞の集塊形成が全く認められなかった。
ゼラチナーゼの産生を、30g/lのゼラチンを含有するMRS寒天で調べた。37℃で18時間後においてコロニーを取り囲む透明域を、陽性の反応であると見なした。ゼラチナーゼの産生が全く検出されなかった。
β−溶血素の産生が、血液寒天平板においてコロニーを取り囲む透明域の形成によって示された。血液寒天平板を、Columbia血液寒天基剤を5%のヒツジ血液とともに使用して調製した。β−溶血素の産生が全く認められなかった。
ST4SA株を一晩培養した培養物を10μl、0.5%(w/v)のタウロデオキシコール酸(TCDA)のナトリウム塩及び0.37g/LのCaCl2が補充されたMRS寒天平板にスポットすることによってBSH活性について試験した。平板を嫌気ジャーにおいて37℃で72時間インキュベーションした。沈殿域の形成を、BSH陽性であると見なした。
E.ムンドティ ST4SAを一晩培養した培養物を1/4強度のリンゲル溶液(QSRS)により2回洗浄し、OD580nmを測定した。等体積の懸濁物及びn−ヘキサデカンを一緒に加え、2分間混合した。相を室温で30分間分離させ、その後、1mlの水相を取り出し、OD580nmを測定した。2回(duplicate)の評価のOD580nmを平均化し、疎水性を計算するために使用した。
%疎水性=[(OD580nm測定値1−OD580nm測定値2)/OD580nm測定値1]×100。
Caco−2細胞(Highveld Biological Sciences)を、コンフルエンスを得るために5×105細胞/ウェルの濃度で播種した。接着性を、100μlの細菌懸濁物(1×105cfu/mlのST4SA株及び1×103cfu/mlのL.モノサイトゲネス)をウェルに加えることによって調べた。37℃で2時間インキュベーションした後、細胞株をPBSにより2回洗浄した。細菌細胞をTriton−X100により溶解し、MRS寒天及びBHI寒天にそれぞれ置床した。接着を初期生菌数及び細胞溶解物から計算した。
インビトロ胃腸モデルにおけるL.モノサイトゲネスに対するST4SAの抗菌活性を求めた。ST4SAを本明細書中、前に記載したような胃容器に接種した。L.モノサイトゲネス(1×104個)をGITの十二指腸容器に接種した。サンプルをそれぞれの容器から採取し、エンテロコッカス特異的培地及びリステリア特異的培地にそれぞれ置床した。コントロールとして、L.モノサイトゲネスのみをGITモデルに接種した。
<材料及び方法>
〔動物〕
体重が318g〜335gの間にある10匹の雄性のWistarラットを、制御された大気(温度、20℃±3℃)において、12時間の明暗サイクルとともにプラスチックケージに5匹ずつの群で収容した。動物には、標準餌、並びにプロバイオティクス菌補充又は非補充のいずれかのオートクレーブ処理された逆浸透水が自由に与えられた。
ST4SA株をMRSブロスにおいて30℃で18時間培養した。光学濃度を600nmにおいて1.8に調節した。細胞を遠心分離によって集め、20mMリン酸塩緩衝液(pH7.5)で洗浄した。洗浄された細胞を100mMスクロースに再懸濁し、液体窒素で凍結し、一晩凍結乾燥した。cfu/ml値を、所与量の細胞を1mlのリン酸塩緩衝液に懸濁し、希釈物をMRS固体培地に展開置床することによって求めた。ST4SA株を約2×108cfu/mlの濃度で飲料水に加えた。
2つの別個の研究を行った。それぞれの研究では、10匹のラットが、それぞれ5匹の2つの群に無作為に分けられた。一方の群はコントロールとして作用し、非補充の水が与えられた。第2の群には、Lactovitaカプセル又は凍結乾燥ST4SA株のいずれかが補充された水が与えられた。それぞれのラットは、研究期間を通して合計で9.89×1011cfuのST4株又は3.1×109cfuのLactovitaのいずれかが与えられた。ラットを毎日、波打った被毛、背中を丸めた姿勢、不安定な動き、震え又は身震い、咳又は呼吸困難、四肢の色を含めて、何らかの異常な活動、行動及び全体的な健康状態についてモニターした。活動を、3点スケール法を使用してモニターした。1=緩慢、ゆっくり動く;2=中程度;3=活発な動き又は探索。生体重量及び消費された水の体積を毎日測定した。ST4SA株での研究を50日にわたって行い、Lactovitaでの研究を108日にわたって行った。結果が表17に示される。
ラットを指定のサンプリング点で個別ケージに一晩入れ、24時間の便サンプルを、細菌数及びβ−グルクロニダーゼ活性を求めるために集めた。便サンプルを100mg便/ml緩衝液の濃度で20mMリン酸塩緩衝液においてホモジネートした。サンプルをアッセイまで−20℃で保存した。便サンプルを遠心分離によってペレット化し、1mlのGUS抽出緩衝液(50mM NaHPO4、5mM DTT、1mM EDTA、0.1%TritonX−100)に再懸濁し、混合し、22℃で10分間インキュベーションした。サンプルを−20℃で一晩凍結し、β−グルクロニダーゼ活性を測定する前に解凍した。β−グルクロニダーゼ活性を、100μlの処理された便懸濁物を900μlの反応緩衝液(1mMのp−ニトロフェニルグルクロニドを含有する抽出緩衝液)と37℃で2時間インキュベーションすることによってアッセイした。反応を、2.5mlの1M Tris(pH10.4)を加えることによって停止させた。吸光度を415nmで測定した。標準曲線を、0.1mM、0.2mM、0.5mM、1mM及び10mMのp−ニトロフェノールを使用して構築した。
指定された期間にわたって試験菌株を与えた後、動物をペントバルビトンナトリウムの過剰用量によって安楽死させた。血液サンプルを右心室の心臓穿刺によって得た。それぞれのラットの内臓器官の全体的解剖学を調べ、記録した。肝臓組織、脾臓組織、回腸組織、盲腸組織及び結腸組織のサンプルを切除した。組織サンプルをカセットに集め、4%ホルムアルデヒド(PBS)溶液に入れ、その後、組織学的分析及びFISH研究のためにパラフィンワックスに包埋した。回腸及び結腸の切片を液体窒素で凍結した。血液サンプルをBHI固体培地に展開置床し、37℃で一晩インキュベーションした。
総RNAを、Trizol試薬を使用して回腸及び結腸の凍結サンプルから抽出した。RNAの濃度を、DNase処理が完了した後、260nmでの吸光度を、Nanodrop分光光度計を使用して測定することによって求めた。それぞれのRNAサンプルを42ng/μlの濃度に希釈した。合計で5μgのそれぞれのサンプルを、スロットブロット装置を使用して3連(triplicate)でナイロンメンブレンに移した。その後、メンブレンを、ラットのゲノムDNAから増幅され、DIGにより標識された、腫瘍壊死因子(TNF)、インターフェロンγ(IFN)又はβ−アクチンのいずれかのDNAプローブによりプローブ探査した。メンブレンをX線フィルムに一晩感光させ、現像した。
〔全体的な健康状態及び体重増加〕
研究期間を通して、顕著な行動変化又は活動変化がラットにおいて認められず、また、差を、実験群と、コントロール群との間で何ら認めることができなかった。処理に関連づけられる疾患又は死亡は生じなかった。
β−グルクロニダーゼを含めて、様々な細菌酵素が、変異原、発癌物質及び腫瘍促進因子を、GITにおいて見出される前駆体から生じさせることに関与することが知られており、それらの存在が、細菌菌株の毒性を示す場合があり、従って、可能性のあるプロバイオティクス菌の安全性の目安として使用することができる。ST4SA株及びLactovita懸濁物はともに、β−グルクロニダーゼ活性をインビトロで示さなかった(データは示さず)。しかしながら、Lactovita懸濁物が与えられたラットは、コントロールのラットと比較したとき、β−グルクロニダーゼ活性における増大を便サンプルにおいて示した(表18A)。コントロール動物はまた、56日目での活性と比較したとき、活性における低下を研究の107日目に示し、実験動物は、56日目と比較したとき、わずかに増大した値を107日目に示した。ST4補助物が与えられたラットは、コントロール群と比較したとき、より大きいβ−グルクロニダーゼ活性を示した(表18B)。しかしながら、この活性は、研究の0日目での値と比較したとき、研究終了時においてより低いままであった。コントロール群もまた、0日目と比較したとき、研究終了時においてより低い活性を示した。
菌血症が動物群のいずれにおいても検出されなかった。内臓器官の肉眼検査では、ST4SA株が与えられたラットが、コントロールのラットと比較したとき、著しくより顕著なMLNを有したことが示された。MLNは、コントロールのラットにおいて特定することが極めて困難であった。実験群と比較したとき、コントロール群における脾臓はより狭小であり、筋肉量及び腹部脂肪がともにコントロール群ではより少なかった。Lactovitaが与えられた動物では、コントロール群と比較したとき、MLNがそれほど顕著ではなく、また、脾臓がより小さかった。
ノーザンハイブリダイゼーション研究では、何らかのサイトカイン(TNF又はIFN)の発現が実験ST4SA群又はコントロール群のいずれにおいても示されなかった。RNAがβ−アクチンのDNAプローブによりプローブ探査されたとき、陽性シグナルが検出され、相対的に同じ強度であった。このことはRNAの存在を示している。
1リットルのMRSfにエンテロコッカス・ムンドティST4SAを接種し(OD600nm=1.8)、これを30℃で24時間インキュベーションした。細胞を遠心分離(8000×g、4℃、15分)によって集め、無細胞上清を80℃で10分間インキュベーションした。硫酸アンモニウムを4℃で無細胞上清に静かに加えて60%の飽和レベルにした。4時間ゆっくり撹拌した後、沈殿物を遠心分離(20000×g、1時間、4℃)によって集めた。ペレットを1/10体積の25mM酢酸アンモニウム(pH6.5)に再懸濁し、1.0kDaカットオフのSpectra/Por透析メンブレン(Spectrum Inc.、CA、米国)を使用して無菌のMilliQ水に対して脱塩した。さらなる分離を、本明細書中、前で記載したように、AKTApurifier(Amersham)による1mlのResource Sカラム(Amersham Biosciences)におけるカチオン交換クロマトグラフィーによって行った。
ペプチドST4SAの等電点フォーカシングを、Rotofor(登録商標)エレクトロフォーカシングセル(Bio−Rad、Hercules、California、米国)を使用することによって行った。MRSfで培養されたST4SA株から得られ、前で記載したように調製された1リットルの無細胞上清を凍結乾燥し、製造者の説明書に従ってアンホライト(pH範囲:3〜10、Bio−Rad)とともに50mlの無菌の蒸留水に再懸濁した。12Wの定電流を8℃で5時間加えた。分離後、集められたフラクションのそれぞれからの小体積を3NのNaOH又は3NのHClによりpH7.0に調節し、ラクトバチルス・カセイLHSに対する抗菌活性について試験した。陽性と試験されたフラクションをプールし、50mlの総体積に脱イオン水で再懸濁し、エレクトロフォーカシングに再び供し、フラクションを集め、抗菌活性について試験した。サンプルを−20℃で保存した。
ST4SA株をMRSブロス(Biolab)で培養して、CSL、CWp及び廃糖蜜にそれぞれ接種した(2%v/v)。
発酵を、10mlの培地を含有する試験管で行った。pHを殺菌(121℃、15分間)の前にNaOHにより調節した。NaOHの濃度は培地の緩衝能に依存した。24時間の培養物を接種(2%v/v)のために使用した。回分発酵を試験管において30℃で16時間行った(pH6.5〜7.0)。pHは制御されなかった。光学濃度(OD)を600nmで測定した。
フェノール(5%(v/v)溶液の500μl)及び濃硫酸(2.5ml)を試験管における500μlの希釈サンプルに加えた。溶液を十分に撹拌混合し、吸光度の読み取りを490nmで行った(室温)。糖濃度(gグルコース.l−1)を、標準曲線グラフを使用して計算した。
CarboPac PA100カラムを備えるDionex DX500分析装置を使用して、サンプルをモノマー糖について分析した。使用された溶出液は、1ml.min−1の流速において、250mM NaOH、H2O及び1M NaOAcであった。Dionexはオートサンプラーを備え、注入体積は10μlであった。
12800AUml−1にまで達するペプチドST4SA活性が、10gTS.l−1の濃度で、純粋なCSLにおいて記録された。しかしながら、MRSにおいて記録されたペプチドST4SA活性(51200AU.ml−1)と比較したとき、これは低かった。予備実験において、MRS成分(グルコースを除く)を10gTS.l−1及び40gTS.l−1のCSL及びCWpにそれぞれ加えた(表22)。活性における2倍の増大が、純粋なCSLと比較したとき、補充物を有する10gTS.l−1のCSLについて認められた。対照的に、補充物を有する40gTS.l−1でのCSLは低い活性をもたらした。高濃度のCSLは成長を阻害し(pHにおける小さい低下)、その後に、ペプチドST4SAの産生もまた阻害した。これはCSLにおける阻害性成分のためであり得る。同じ実験をCWpに関して行った(表22)。CWp濃度を(10gTS.l−1から40gTS.l−1に)増大させた場合、ペプチドST4SAの産生に対する影響は何ら記録されなかった。
活性=−1431.2*B+956.2*C+3831.2*D−2781.3*E−2243.8*G−2006.2*K+7668.8[式2]
R2=0.73
CSLは老廃物であるので、CSLの組成が日毎に変化し得る。組成における差は、結果に著しい影響を及ぼす可能性がある。このことを、同じ実験をCSLの第2のバッチで行うことによって調べた。今回のANOVA分析では、YE、CSL、Tween80、MnSO4及び酢酸ナトリウムが、バクテリオシンの産生に対する最も著しい影響を有する成分として特定された(P<0.1)。継続した最適化により、MnSO4は重要でなく、一方、酢酸ナトリウムは活性における低下を引き起こしたことが示された。
CSL培地の糖含有量を発酵の前後で測定した。発酵開始時において、CSLは7.5gTS.l−1の濃度にされた。存在する主なモノマー糖はグルコース及びフルクトースであり、総濃度が3.883g.l−1であった。従って、全糖の約51.8%のみが発酵可能な形態であり、すべての糖が発酵期間中に代謝されるわけではなかった。発酵終了時(一定のOD)において、pHが4.6であり、残っている残存糖が8.8%であった。成長制限は、低いpHのためであって、窒素、ミネラル、ビタミン又は任意の他の栄養分の不足のためではなかった。表27は発酵期間中の炭素の取り込みを示す。
プロバイオティクス菌株を選択するための1つの重要な基準が、上皮細胞への接着である。プロバイオティクス細菌はまた、接着部位について病原性細菌と競合し得る。Caco−2細胞(これはヒト結腸腺癌に由来する)をインビトロモデルとして使用して、上皮細胞に対するE.ムンドティ ST4SAの接着能及び競合的排除能を調べた。
E.ムンドティ ST4SAは、2つの抗生物質(Cefasyn及びUtin)及び炎症性医薬品(Rheugesic、Coxflam及びPynmed)に対する抵抗性を示した。結果が表28に示される。E.ムンドティ ST4SAに対する最大の成長阻害を有する抗生物質が、Promoxil、Cipadur、Roxibidd及びDoximalである。
〔動物〕
体重が150g〜180gの間にある36匹の雄性のWistarラットを、制御された大気(温度、20℃±3℃)において、12時間の明暗サイクルとともにプラスチックケージに6匹ずつの群で収容した。動物には、標準餌が自由に与えられた。
E.ムンドティ ST4SA株をMRSブロスにおいて30℃で18時間培養した。光学濃度を600nmにおいて1.8に調節した。細胞を遠心分離によって集め、20mMリン酸塩緩衝液(pH7.5)で洗浄した。洗浄された細胞を100mMスクロースに再懸濁し、−80℃で凍結し、一晩凍結乾燥した。cfu/ml値を、所与量の細胞を1mlのリン酸塩緩衝液に懸濁し、希釈物をMRS固体培地に展開置床することによって求めた。凍結乾燥された細胞を無菌スキムミルク(10%)に再懸濁し、2×108cfuのST4SA株を胃内胃管栄養法により投与した。
7日間連続して、2つ動物群がST4株を胃内胃管栄養法により受け、2つの群がLactovitaを受け、残る2つのコントロール群が水を受けた。8日目に、両方のコントロール群はリステリア・モノサイトゲネスに胃内胃管栄養法により感染させられ、ST4SA株群からの1つの群及びLactovita群からの1つの群もそれぞれまた、L.モノサイトゲネスに感染させられた。このとき、動物はまた、E.ムンドティ ST4SA株、Lactovita又は水を受けた。プロバイオティクス又は水が9日目及び10日目に再び投与された。コントロール群が症状を示し始めたとき、E.ムンドティ ST4SA株がコントロール群の一方に胃内胃管栄養法により投与された。その後、この群を症状の緩和についてモニターした。
Claims (62)
- 配列番号12、
そのフラグメントであって、抗菌活性を有するフラグメント、
そのムテイン及び誘導体であって、抗菌活性を有するムテイン及び誘導体、
その共有結合架橋体であって、抗菌活性を有する共有結合架橋体、及び、
前記アミノ酸配列に対して約75%を超える相同性を有する配列であって、抗菌活性を有する配列、
を含む群から選択される、単離されたペプチド。 - 前記単離されたペプチドに対して約85%を超える相同性を有するアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の単離されたペプチド。
- 前記単離されたペプチドに対して約95%を超える相同性を有するアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の単離されたペプチド。
- 配列番号11、
その相補体、
そのフラグメントであって、その発現後に、抗菌活性を有するペプチドを産生することができるフラグメント、又は、
厳密なハイブリダイゼーション条件下でそれとハイブリダイズするヌクレオチド配列、
を含む、単離されたヌクレオチド配列。 - 微生物宿主細胞の形質転換に適した組換えプラスミドであって、請求項1に記載の抗菌性ペプチドをコードするヌクレオチド配列が挿入されたプラスミドベクターを含むプラスミド。
- 請求項1に記載の抗菌性ペプチドをコードするヌクレオチド配列が挿入されたプラスミドベクターを含む組換えプラスミドを含む、形質転換された微生物細胞。
- ATCCに寄託され、受託番号がPTA−7278であるエンテロコッカス・ムンドティ(Enterococcus mundtii)ST4SA株の実質的に純粋な培養物であって、資化可能な炭素源、窒素源及び無機物質を含有する栄養培地中で発酵すると、回収可能な量のペプチドST4SAを産生することができる培養物。
- 請求項1に記載のペプチドを製造するための方法であって、エンテロコッカス・ムンドティ(Enterococcus mundtii)ST4SA株を、回収可能な量の前記ペプチドが産生されるまで、微好気条件下、10〜45℃の温度で、栄養培地中で培養するステップと、前記ペプチドを回収するステップと、を含む方法。
- 培養が約37℃の温度で行われる、請求項8に記載の方法。
- 栄養培地が、コーンスティープリカー、チーズホエー粉末、MRSブロス、酵母抽出物及び廃糖蜜を含む群のいずれか1つ又は複数から選択される、請求項8又は9に記載の方法。
- 栄養培地が、10〜20g/lのK2HPO4及び/又は15.0〜20.0g/lのフルクトースを含有するMRSブロスである、請求項10に記載の方法。
- 動物又はヒトの細菌感染症を治療する方法であって、動物又はヒトの感染領域を、
請求項7に記載のエンテロコッカス・ムンドティ株培養物、及び/又は
請求項1に記載の抗菌性ペプチド、
の治療有効量を含む物質又は組成物に曝すステップを含む方法。 - 前記菌株培養物が、約106〜109cfu(コロニー形成単位)/mlの濃度で含まれる、請求項12に記載の方法。
- 前記菌株培養物が、約108cfu(コロニー形成単位)/mlの濃度で含まれる、請求項13に記載の方法。
- 前記ペプチドが、約100000〜300000AU/mlの濃度で含まれる、請求項12〜14のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ペプチドが、200000AU/mlの濃度で含まれる、請求項15に記載の方法。
- 動物又はヒトの細菌感染症を治療する方法において使用される医薬品の製造における、請求項7に記載のエンテロコッカス・ムンドティ株培養物の治療有効量の使用。
- 前記菌株培養物が、106〜109cfu/mlの濃度で投与される、請求項17に記載の使用。
- 前記菌株培養物が、108cfu/mlの濃度で投与される、請求項18に記載の使用。
- 動物又はヒトの細菌感染症を治療する方法において使用される医薬品の製造における、請求項1に記載の抗菌性ペプチドの治療有効量の使用。
- 前記ペプチドが、100000〜300000AU/mlの濃度で投与される、請求項20に記載の使用。
- 前記ペプチドが、200000AU/mlの濃度で投与される、請求項20に記載の使用。
- 動物又はヒトの細菌感染症を治療する方法において使用される物質又は組成物であって、請求項7に記載のエンテロコッカス・ムンドティ株培養物を含み、前記方法が、当該物質又は組成物の治療有効量を動物又はヒトに投与するステップを含む、物質又は組成物。
- 前記菌株培養物が、106〜109cfu/mlの濃度で投与される、請求項23に記載の物質又は組成物。
- 前記菌株培養物が、108cfu/mlの濃度で投与される、請求項24に記載の物質又は組成物。
- 動物又はヒトの細菌感染症を治療する方法において使用される物質又は組成物であって、請求項1に記載の抗菌性ペプチドを含み、前記方法が、当該物質又は組成物の治療有効量を動物又はヒトに投与するステップを含む、物質又は組成物。
- 前記単離されたペプチドが、100000〜300000AU/mlの濃度で投与される、請求項26に記載の物質又は組成物。
- 前記単離されたペプチドが、200000AU/mlの濃度で投与される、請求項27に記載の物質又は組成物。
- 液剤、軟膏剤、ローション剤、クリーム剤、ゲル剤、液体スプレー、凍結乾燥粉末、凍結乾燥スプレー、口腔洗浄剤又は含嗽剤の形態である、請求項23〜28のいずれか一項に記載の物質又は組成物。
- 細菌感染症が、アシネトバクター・バウマニイ(Acinetobacter baumanii)、バチルス・セレウス(Bacillus cereus)、クロストリジウム・チロブチリクム(Clostridium tyrobutyricum)、エンテロバクター・クロアカエ(Enterobacter cloacae)、大腸菌(Escherichia coli)、肺炎桿菌(Klebsiella pneumoniae)、リステリア・イノクア(Listeria innocua)、緑膿菌(Pseudomonas aruginosa)、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)、スタフィロコッカス・カルノサス(Staphylococcus carnosus)、ストレプトコッカス・カプリヌス(Streptococcus caprinus)、ストレプトコッカス(エンテロコッカス)・フェカリス(Streptococcus(Enterococcus) faecalis)又は肺炎連鎖球菌(Streptococcus pneumoniae)、のいずれか1つ又は複数によって引き起こされる感染症である、請求項23〜29のいずれか一項に記載の物質又は組成物。
- 細菌種の成長を阻害する方法であって、細菌種を、請求項1に記載の抗菌性ペプチドの有効量に曝すステップを含む方法。
- 前記細菌種が、100000〜300000AU/mlの濃度の前記抗菌性ペプチドに曝される、請求項31に記載の方法。
- 前記細菌種が、200000AU/mlの濃度の前記抗菌性ペプチドに曝される、請求項32に記載の方法。
- 前記細菌種が、アシネトバクター・バウマニイ(Acinetobacter baumanii)、バチルス・セレウス(Bacillus cereus)、クロストリジウム・チロブチリクム(Clostridium tyrobutyricum)、エンテロバクター・クロアカエ(Enterobacter cloacae)、大腸菌(Escherichia coli)、肺炎桿菌(Klebsiella pneumoniae)、リステリア・イノクア(Listeria innocua)、緑膿菌(Pseudomonas aruginosa)、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)、スタフィロコッカス・カルノサス(Staphylococcus carnosus)、ストレプトコッカス・カプリヌス(Streptococcus caprinus)、ストレプトコッカス(エンテロコッカス)・フェカリス(Streptococcus(Enterococcus) faecalis)及び肺炎連鎖球菌(Streptococcus pneumoniae)、を含む群から選択される、請求項19に記載の方法。
- 液剤、軟膏剤、ローション剤、クリーム剤、液体スプレー、凍結乾燥スプレー、口腔洗浄剤又は含嗽剤の形態の抗菌剤の製造における、請求項1に記載の単離されたペプチドの使用。
- 副鼻腔感染症、副鼻腔炎、鼻炎、扁桃炎又は咽頭感染症を治療するための抗菌スプレーの製造における、請求項1に記載の単離されたペプチドの使用。
- 請求項1に記載の単離されたペプチドの抗菌有効量が組み入れられたポリマー。
- 請求項1に記載の単離されたペプチドが、100000〜300000AU/mlの濃度で含まれる、請求項37に記載のポリマー。
- 請求項1に記載の単離されたペプチドが、200000AU/mlの濃度で含まれる、請求項38に記載のポリマー。
- 包装材、インプラント、医療デバイス、イヤーグロメット、カテーテル、オストミーチューブ、オストミーポーチ、ステント、縫合材、衛生用品、コンタクトレンズ、コンタクトレンズ洗浄液及び創傷被覆材に組み入れられる、請求項37〜39のいずれか一項に記載のポリマー。
- 請求項7に記載のエンテロコッカス・ムンドティST4SA株の生物学的に純粋な培養物の治療有効濃度を含むプロバイオティクス組成物。
- 前記菌株が、プロバイオティクス組成物1ml当たり生細胞約105〜109個(cfu)の濃度で含まれる、請求項41に記載のプロバイオティクス組成物。
- 前記菌株が、プロバイオティクス組成物1ml当たり生細胞約2×108個(cfu)の濃度で含まれる、請求項42に記載のプロバイオティクス組成物。
- 液体、錠剤、カプセル、菓子、チューインガム又は他の食品の形態である、請求項41〜43のいずれか一項に記載のプロバイオティクス組成物。
- 動物又はヒトにおける病原性細菌又は病原性ウイルスのレベルを低減させる方法であって、請求項41〜44のいずれか一項に記載のプロバイオティクス組成物の治療有効量を動物又はヒトに投与するステップを含む方法。
- 前記プロバイオティクス組成物が、103〜106cfu/mlの最終濃度で動物又はヒトに投与される、請求項45に記載の方法。
- 前記プロバイオティクス組成物が、105〜106cfu/mlの最終濃度で動物又はヒトに投与される、請求項46に記載の方法。
- 前記プロバイオティクス組成物が、約3×105の最終濃度で動物又はヒトに投与される、請求項47に記載の方法。
- 動物又はヒトにおける病原性細菌又は病原性ウイルスのレベルを低減させる方法において使用されるプロバイオティクスの製造における、請求項7に記載のエンテロコッカス・ムンドティ株の生物学的に純粋な培養物の使用。
- 前記菌株培養物が、106〜109cfu/mlの濃度で投与される、請求項49に記載の使用。
- 前記菌株培養物が、108cfu/mlの濃度で投与される、請求項50に記載の使用。
- 配列番号1〜配列番号10からなる群から選択されるプライマー。
- 配列番号1及び配列番号2を含むプライマー対。
- エンテロコッカス・ムンドティ(Enterococcus mundtii)の同定における、配列番号1及び配列番号2のプライマー対の使用。
- 配列番号3及び配列番号4を含むプライマー対。
- 配列番号5及び配列番号6を含むプライマー対。
- 配列番号7及び配列番号8を含むプライマー対。
- 配列番号9及び配列番号10を含むプライマー対。
- 細菌エンテロコッカス・ムンドティ(Enterococcus mundtii)由来の単離されたトランスポーターペプチドであって、
配列番号14、
そのフラグメント、
そのムテイン及び誘導体、又は、
前記アミノ酸配列に対して約90%を超える相同性、好ましくは80%を超える相同性、最も好ましくは約70%を超える相同性を有する配列であって、抗菌活性を有する配列、
を含むペプチド。 - 細菌エンテロコッカス・ムンドティ(Enterococcus mundtii)のST4SAトランスポーターペプチドをコードする、単離されたヌクレオチド配列であって、
配列番号13、
その相補体、
そのフラグメント、又は、
厳密なハイブリダイゼーション条件下でそれとハイブリダイズするヌクレオチド配列、
を含む配列。 - 細菌エンテロコッカス・ムンドティ(Enterococcus mundtii)由来の単離された免疫ペプチドであって、
配列番号16、
そのフラグメント、
そのムテイン及び誘導体、又は、
前記アミノ酸配列に対して約90%を超える相同性、好ましくは80%を超える相同性、最も好ましくは約70%を超える相同性を有する配列であって、抗菌活性を有する配列、
を含むペプチド。 - 細菌エンテロコッカス・ムンドティ(Enterococcus mundtii)のST4SA免疫ペプチドをコードする、単離されたヌクレオチド配列であって、
配列番号15、
その相補体、
そのフラグメント、又は
厳密なハイブリダイゼーション条件下でそれとハイブリダイズするヌクレオチド配列、
を含む配列。
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