EA017558B1

EA017558B1 - ШТАММ БАКТЕРИЙ Е.Mundtii ST4SA, СПОСОБНЫЙ ПРОДУЦИРОВАТЬ АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫЙ ПЕПТИД ST4SA, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЕПТИДА ST4SA И ПРИМЕНЕНИЕ ШТАММА БАКТЕРИЙ Е.Mundtii ST4SA И ПЕПТИДА

Info

Publication number: EA017558B1
Application number: EA200802409A
Authority: EA
Inventors: Леон Милнер Теодоре Дикс; Светослав Димитров Тодоров; Хенриетте Кноетзе; Марелизе Бринк
Original assignee: Сипла Медпро Ресеч Энд Девелопмент (Пти) Лтд.
Priority date: 2006-05-28
Filing date: 2007-05-25
Publication date: 2013-01-30
Also published as: AU2007266675B2; KR101521123B1; AU2007266675A1; CN101454440B; JP2009538614A; US20110268703A1; AP2841A; AP2008004626A0; IL195520A0; NO20084577L; NZ571619A; CA2647161A1; WO2007138538A2; IL250634A0; EA200802409A1; EP2021457A2; WO2007138538A3; US7951385B2; CN101454440A; EP2021457B1

Abstract

Изобретение относится к пептиду, получаемому из штамма E.mundtii, и к пробиотической композиции штамма E.mundtii. В частности, изобретение относится к пептиду, получаемому из штамма E.mundtii, гену, который кодирует упомянутый пептид, а также к различным применениям пробиотической композиции, пептида и штамма, из которого получается пептид, в частности, для лечения бактериальной инфекции в организме животного или человека. Штамм бактерий E.mundtii ST4SA АТСС РТА-7278, способный при брожении в питательной среде, содержащей усвояемые источники углерода, азота и неорганические вещества, продуцировать антибактериальный пептид ST4SA, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:12 или последовательность, которая более чем на 75% гомологична указанной, в извлекаемом количестве. Способ получения изолированного антибактериального пептида ST4SA, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:12 или последовательность, которая более чем на 75% гомологична указанной, согласно которому штамм бактерий E.mundtii ST4SA по п.1 культивируют в питательной среде при микроаэрофильных условиях и температуре от 10 до 45°C до получения извлекаемого количества упомянутого пептида, после чего пептид извлекают, при этом в качестве питательной среды используют один или несколько из перечисленных ниже вариантов: кукурузный ликер; сухая сырная сыворотка; бульон MRS (Манна-Рогоза); дрожжевой экстракт; меласса.

Description

Изобретение относится к пептиду, получаемому из штамма Е.типбЫ. и к пробиотической композиции штамма Е.типбйЕ В частности. изобретение относится к пептиду. получаемому из штамма Е.типбШ. гену. который кодирует упомянутый пептид. а также к различным применениям пептида и штамма. из которого получается пептид.

Предпосылки создания изобретения

Молочнокислые бактерии играют важную роль в поддержании здоровой микрофлоры желудочнокишечного тракта. Диеты. стресс. микробные инфекции и желудочно-кишечные заболевания нарушают микробный баланс. что часто вызывает уменьшение количества жизнеспособных молочнокислых бактерий (особенно лактобактерий и бифидобактерий) в желудочно-кишечном тракте. Результат - бесконтрольное стремительное развитие популяций патогенных бактерий. которое может вызвать диарею и другие клинические заболевания - рак. воспаления. язвенный колит.

Одним из ключевых свойств пробиотических молочнокислых бактерий является адгезия - способность клеток прикрепляться к клеткам эпителия или кишечной слизи. Для этого требуется тесное взаимодействие между рецепторными молекулами клеток эпителия и поверхностью бактерий. Адгезия клеток пробиотика предотвращает прикрепление патогенов. а также стимулирует иммунную систему. Последнее достигается за счет взаимодействия со слизистыми оболочками. в результате чего активируются лимфоциты. Другое важное свойство пробиотиков - выживание при низком значении рН и высокой концентрации солей желчных кислот.

Известно. что некоторые штаммы бифидобактерий. лактобактерий и энтерококков. характерные для кишечника человека и животных. вырабатывают бактериоцины (антимикробные пептиды). Роль этих пептидов и их вклад в регулирование популяций патогенных бактерий в желудочно-кишечном тракте пока неясны. Однако последние исследования указывают на активность бактериоцинов в отношении грамотрицательных бактерий. что свидетельствует о возобновлении интереса к этим пептидам и механизму их взаимодействия с кишечными патогенами. Большинство таких бактериоцинов вырабатываются молочнокислыми бактериями. которые обычно присутствуют в желудочно-кишечном тракте. а именно бактериями группы БасЮйасШих ааборйПих. БасЮйасШих геиЮп. БасЮйасШих сахе1. БасЮйасШих ГегтеШит. БасЮйасШих р1ап!агит. Ьас1оЬасШих реШохих. БасЮйасШих рагасахе1 подвид рагасахе1 и Етегососсих Гаесайх.

Изобретение относится к штамму Е.типШй. который устойчив к стрессовым условиям желудочнокишечного тракта (низкий уровень рН. желчные соли. соли. панкреатические ферменты и т.п.) и продуцирует антимикробный пептид широкого спектра действия (пептид 8Т48А).

Краткое описание изобретения

Настоящее изобретение предусматривает штамм бактерий Е.ишпбШ 8Т48А АТСС РТА-7278. способный при брожении в питательной среде. содержащей усвояемые источники углерода. азота и неорганические вещества. продуцировать антибактериальный пептид 8Т48А. имеющий аминокислотную последовательность 8ЕО ΙΌ N0:12 или последовательность. которая более чем на 75% гомологична указанной. в извлекаемом количестве.

Также данное изобретение предусматривает способ получения изолированного антибактериального пептида 8Т48А. имеющего аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0:12 или последовательность. которая более чем на 75% гомологична указанной.

согласно которому штамм бактерий Е.типШй 8Т48А по п.1 культивируют в питательной среде при микроаэрофильных условиях и температуре от 10 до 45°С до получения извлекаемого количества упомянутого пептида. после чего пептид извлекают. при этом в качестве питательной среды используют один или несколько из перечисленных ниже вариантов: кукурузный ликер; сухая сырная сыворотка; бульон МКБ (Манна-Рогоза); дрожжевой экстракт; меласса.

Способ получения изолированного антибактериального пептида 8Т48А может дополнительно включать получение фрагментов указанного пептида. обладающих антибактериальной активностью.

Штамм бактерий Е.ишпШп 8Т48А используют в способе лечения бактериальной инфекции в организме животного или человека. на одной из стадий которого инфицированный участок организма человека или животного подвергают воздействию композиции. содержащей терапевтически эффективное количество вышеописанного штамма бактерий Е.ишпШп 8Т48А. В предпочтительном варианте указанный штамм используют в концентрации от 10⁶ до 10⁹ КОЕ (колониеобразующих единиц) на 1 мл композиции.

Изолированный антибактериальный пептид 8Т48А настоящего изобретения используют в способе лечения бактериальной инфекции в организме животного или человека. на одной из стадий которого инфицированный участок организма человека или животного подвергают воздействию композиции. содержащей терапевтически эффективное количество изолированного антибактериального пептида 8Т48А или его фрагмента. полученных согласно вышеописанному способу. В предпочтительном варианте указанный пептид или его фрагмент используют в концентрации от 100000 до 300000 УЕ на 1 мл композиции.

- 1 017558

В другом варианте изолированный антибактериальный пептид 8Т48Л настоящего изобретения используют в способе лечения бактериальной инфекции в организме животного или человека, на одной из стадий которого инфицированный участок организма человека или животного подвергают воздействию композиции, содержащей терапевтически эффективное количество штамма бактерий Ε.ιηιιπάΙίί 8Т48Л и изолированного антибактериального пептида 8Т48Л или его фрагмента, полученных согласно вышеописанному способу. Предпочтительно использовать указанный штамм в концентрации от 10⁶ до 10⁹ КОЕ (колониеобразующих единиц) на 1 мл композиции или использовать указанный пептид или его фрагмент в концентрации от 100000 до 300000 УЕ на 1 мл композиции.

Данное изобретение также предусматривает композицию для лечения бактериальной инфекции в организме животного или человека, содержащую штамм бактерий Ε.ιηιιπάΙίί 8Т48Л по настоящему изобретению, выполненную в виде жидкого препарата, мази, лосьона, крема, геля, жидкого спрея, лиофилизированного порошка, лиофилизированного спрея, жидкости для полоскания рта или горла.

Данное изобретение также предусматривает композицию для лечения бактериальной инфекции в организме животного или человека, содержащую изолированный антибактериальный пептид 8Т48Л или его фрагмент, полученные согласно способу по настоящему изобретению, выполненную в виде жидкости, мази, лосьона, крема, жидкого спрея, лиофилизированного спрея, жидкости для полоскания рта или горла. Композиция может быть использована для местного лечения таких заболеваний, как, например, ушные инфекции (например, воспаления среднего уха), горловые, глазные и кожные инфекции; жидкий препарат можно также применять в качестве жидкой пищевой добавки, растворов для промывки контактных линз либо в составе самих линз. Кроме того, пептид можно использовать в качестве антимикробного средства в составе спрея для лечения таких болезней, как носовые инфекции, синусит, тонзиллит, горловые инфекции, ринит. Также пептид может применяться в виде лиофилизированного порошка. Пептид может применяться в качестве антимикробного средства в составе упаковочного материала, например пластмассы, при производстве стерильных упаковочных материалов.

Бактериальная инфекция может быть представлена любой из перечисленных ниже инфекций либо любой их комбинацией: Лсте1оЬас1ег Ьаитапл; ВасШик сегеик; С1ок1пбшт (угоЬШупсит; Еп1егоЬас1ег с1оасае; ЕксНепсЫа сой; К1еЬк1е11а рпеитошае; Ык1епа 1ппосиа; Ркеиботопак атидшока; 81арЬу1ососсик аигеик; 81арйу1ососсик сагпокик; 81гер1ососсик сарппик; 81гер1ососсик (Етегососсик) ГаесаНк или 81тер1ососсик рпеитошае.

Данное изобретение также предусматривает пробиотическую композицию, содержащую терапевтически эффективное количество штамма бактерий Ε.ιηιιπάΙίί 8Т48Л по настоящему изобретению в концентрации от 10⁵ до 10⁹ жизнеспособных клеток (КОЕ) на 1 мл пробиотической композиции. Пробиотическая композиция может быть выполнена в виде жидкости, таблеток или капсул, конфет, жевательной резинки или в иной съедобной форме.

Указанную пробиотическую композицию применяют в способе сокращения числа патогенных бактерий или вирусов в организме животного или человека, на одной из стадий которого в организм животного или человека вводят терапевтически эффективное количество вышеописанной пробиотической композиции. Предпочтительно, чтобы конечная концентрация жизнеспособных клеток бактерий (КОЕ), вводимых в организм животного или человека, составляла от 10³ до 10⁶ КОЕ/мл пробиотической композиции, желательно от 10⁵ до 10⁶ КОЕ/мл, наиболее предпочтительно - около 3х10⁵ КОЕ/мл.

Пробиотическая композиция может применяться в виде порошка, жидкости, геля, таблеток либо в составе продуктов питания. Пробиотическая композиция в жидком виде может использоваться как жидкая пищевая добавка.

Также изобретение предусматривает способ подавления роста бактерий, на одной из стадий которого бактерии подвергаются воздействию эффективного количества антимикробного пептида настоящего изобретения. Бактерии могут быть представлены любыми бактериями из перечисленных ниже: Лсте1оЬас1ег Ьаитапл; ВасШик сегеик; С1ок1пбшт (угоЬШупсит; Еп1егоЬас1ег с1оасае; ЕксйепсЫа сой; К1еЬк1е11а рпеитошае; Ык1епа шпосиа; Ркеиботопак агцДпока; 81арйу1ососсик аитеик; 81арйу1ососсик сагпокик; 81гер1ососсик сартшик; 81тер1ососсик (Епегососсик) ГаесаНк или 81тер1ососсик рпеитошае. Способ может включать в себя стадию, на которой бактерии подвергаются воздействию антимикробного пептида настоящего изобретения в концентрации от 100000 до 300000 УЕ/мл, желательно около 200000 УЕ/мл.

- 2 017558

Краткое описание чертежей

В дальнейшем приводится подробное описание изобретения и примеров его осуществления со ссылкой на приложенные чертежи и таблицы, на которых приведены:

фиг. 1 - изображение клеточной морфологии штамма 8Т48А Е.типбЫ. полученное с помощью сканирующей электронной микроскопии (СЭМ);

фиг. 2 - фотография агарозного геля. показывающая результат полимеразной цепной реакции ПЦР (фрагмент ДНК). полученный с помощью родоспецифических праймеров. В результате был получен родоспецифический фрагмент ДНК длиной в 112 кб (килобаз. тысяч нуклеотидов). специфичный для энтерококков (Ейегососсш);

фиг. 3 - фотография агарозного геля. на которой показан результат ПЦР (фрагмент ДНК). полученный с помощью видоспецифических праймеров. В результате был получен видоспецифический фрагмент ДНК длиной в 306 п.н. (пар нуклеотидов). специфичный для Ейегососсик типбЫ;

фиг. 4 - графическое изображение пептида 8Т48Л. выделенного гель-фильтрацией (хроматограф АКТЛ-рипйег);

фиг. 5 - фотография полиакриламидного геля с додецилсульфатом натрия. показывающая положение пептида 8Т48А;

фиг. 6А - фотография агарозного геля. на которой виден плазмидный профиль 8Т48А Е.типбЫ;

фиг. 6Б - результат анализа Саузерн-блоттинг. на котором видно положение структурного гена в хромосоме (геноме) штамма 8Т48А;

фиг. 7 - схематичное изображение последовательности аминокислот пептида 8Т48А Е.типЛй;

фиг. 8 - последовательность ДНК структурного гена (А). транспортного гена (В) и гена иммунитета (С) пептида 8Т48А;

фиг. 9А и 9Б показано влияние компонентов питательной среды на получение пептида 8Т4;

фиг. 10 - графическое изображение образования пептида 8Т48А в бульоне МК.8;

фиг. 11 - фотография агарозного геля. где виден фрагмент ДНК. который. возможно. содержит предполагаемый ген адгезии;

фиг. 12 - график. иллюстрирующий стабильность пептида 8Т48А (неочищенный экстракт. взвешенный в стерильной дистиллированной воде) при различных температурах;

фиг. 13 - фотография зон подавления вида Ркеиботоиак в чашке с агаром;

фиг. 14 - фотография 81гер1ососси5 рпеитошае. обработанных пептидом 8Т48А (409600 УЕ/мл). утечка цитоплазмы показана стрелками;

фиг. 15 - график. иллюстрирующий подавление роста 81герЮсосси5 рпеитошае (патоген 27); фиг. 16 - график. иллюстрирующий подавление роста 81герЮсосси5 рпеитошае (патоген 29);

фиг. 17 - график. иллюстрирующий подавление роста К1еЬйе11а рпеитошае (патоген 30); фиг. 18 - график. иллюстрирующий подавление роста изолята из среднего уха (патоген 40);

фиг. 19 - график. иллюстрирующий подавление роста изолята из среднего уха (патоген В\У); фиг. 20 - график. иллюстрирующий подавление роста изолята из среднего уха (патоген Е);

фиг. 22 - график. иллюстрирующий подавление роста изолята из среднего уха (патоген С\У); фиг. 23 - график. иллюстрирующий подавление роста изолята из среднего уха (патоген Н\У);

фиг. 24 - график. иллюстрирующий рост штамма 8Т48А в присутствии БМепа 1ппосиа ЬМС 13568 и образование пептида 8Т48А.

Обозначения:

*” = рост штамма 8Т48А в присутствии Б.1ппосиа ЬМС 13568;

^_в_ = подавление роста Елппосиа ЬМС 13568;

—·— = изменения рН;

= образование пептида 8Т48А;

фиг. 25 - схематическое представление модели желудочно-кишечного тракта (ЖКМ). разработанной для оценки пробиотического штамма 8Т48А;

фиг. 26 - схема. показывающая блокирование целевого участка липида II ванкомицином и его влияние на механизм действия (антимикробную активность) пептида 8Т48А. % утечки обозначает утечку цитоплазмы. отмеченную по увеличенным уровням активности ДНК и β-галактозидазы;

фиг. 27 - схематическое изображение встроенного в пептид дисульфидного моста. который ковалентно соединяет аминокислоты 9 (цистеин) и 14 (цистеин);

фиг. 28 - кривая гидрофобности 8Т48А;

фиг. 29 - приведены результаты выживания Б.топосуЮдепех при стимуляции 8Т48А в искусственных условиях (модель ЖКТ);

фиг. 30 - кривые роста Е.типбШ 8Т48А в бульоне МК.8 и среде С8Ь (кукурузный ликер);

фиг. 31 - изображены окрашенные гемолизином и эозином срезы: (А) контрольная группа. толстая кишка (Б) прием штамма 8Т48А. толстая кишка (В) контрольная группа. подвздошная кишка (Г) прием штамма 8Т48А. подвздошная кишка (Д) контрольная группа. печень (Е) прием штамма 8Т48А. печень (Ж) контрольная группа. селезенка (З) прием штамма 8Т48А. селезенка. увеличение 60 х.

- 3 017558

В табл. 1 приведены фенотипические характеристики штамма 8Т48А (реакции брожения сахара).

В табл. 2 приведены характерные признаки штамма 8Т48Л.

В табл. 3 приведены результаты воздействия ферментов, температуры, рН и детергентов на пептид 8Т48А.

В табл. 4 показан спектр активности пептида 8Т48Л.

В табл. 5 иллюстрируется активность пептида 8Т48Л на бумажных дисках.

В табл. 6 сравнивается активность пептида 8Т48Л и популярных антибиотиков.

В табл. 7 иллюстрируется адгезия пептида 8Т48Л к патогенам.

В табл. 8 показаны данные касательно активности внеклеточной ДНК после обработки патогенов пептидом 8Т48Л.

В табл. 9 показаны данные касательно активности β-галактозидазы после обработки патогенов пептидом 8Т48Л.

В табл. 10 представлено функционирование ЖКМ (автоматизированное).

В табл. 11 представлены данные о выживании штамма 8Т48Л и об образовании пептида 8Т48Л в ЖКМ, где в качестве целевого организма (патогена) использовали ЬШепа топосуЮдепек. Приведенные значения являются усреднением трех экспериментов. В качестве питательных веществ использовали ΝΑΝ Ре1агдои (компания №к!1е) и МК8 (среда Мана и Рогозы, компания Вю1аЬ) соответственно.

В табл. 12 показана устойчивость штамма 8Т48А к антибиотикам.

Табл. 13 показывает рост штамма 8Т48А в присутствии различных концентраций триметопримсульфаметаксозола (ТМР-8МХ) и метронидазола.

В табл. 14 приведены оцениваемые факторы вирулентности.

В табл. 15 показаны результаты определения адгезии штамма 8Т48А к клеточным линиям Сасо-2 методом подсчета колоний в чашках (контроль).

В табл. 16 показано конкурентное исключение штамма 8Т48А и Ь.тоиосу1одеиек.

В табл. 17 приведены числовые данные, характеризующие изменения массы тела крыс, которым давали штамм 8Т48А, препарат Лактовита или воду без добавок.

В табл. 18 показана активность β-глюкуронидазы в образцах экскрементов, взятых у самцов крыс Уистара в рамках (А) 107-дневного исследования препарата Лактовита и (Б) 50-дневного исследования штамма 8Т48А. Значения обозначают количество мМ р-нитрофенола, высвобождаемое за 2 ч. Значения стандартной ошибки приведены в скобках.

В табл. 19 показана очистка пептида 8Т48А в среде МК8Г (фильтрат МК8).

В табл. 20 приведены результаты проверки чистого кукурузного ликера, мелассы и сухой сырной сыворотки в качестве потенциальных сред для выращивания пептида 8Т48А.

В табл. 21 приведен полный факторный план (ΡΡΌ) с кукурузным ликером и сухой сырной сывороткой в качестве компонентов, направленный на определение сред, оказывающих наибольшее влияние на получение пептида 8Т48А.

В табл. 22 показаны результаты использования кукурузного сиропа, дополненного компонентами среды МК.8 для оптимизации активности 8Т48А.

В табл. 23 показаны высокие и низкие концентрации компонентов среды МК8 и С8Ь (кукурузный сироп).

В табл. 24 приведен 2^10-5 дробный факторный план ΡγΡΌ.

В табл. 25 содержится анализ таблицы вариаций для плана 2^10-5 ΡγΡΌ.

В табл. 26 показан 2² полный факторный план ΡΡΌ с 3 центральными точками для определения концентраций С8Ь (кукурузного ликера) и УЕ (дрожжевого экстракта).

В табл. 27 приведены данные по потреблению углерода во время брожения.

В табл. 28 показаны результаты проверки устойчивости Е.шипбЫ 8Т4 к антибиотикам и противовоспалительным средствам.

В табл. 29 приведены результаты влияния антибиотиков и противовоспалительных средств на адгезию 8Т48А к клеткам Сасо-2.

Подробное описание изобретения

Предлагается штамм бактерии Еи1егососсик тииб1и, который устойчив к стрессовым условиям желудочно-кишечного тракта (низкий уровень рН, желчные соли, соли, панкреатические ферменты и т.п.) и вырабатывает антимикробный пептид широкого спектра действия, а именно пептид 8Т48А. Штамм Ейегососсик тииб1и, из которого получают пептид 8Т48А, содержится в АТСС (Американской коллекции типовых культур) под номером РТА-7278. Наблюдается активность пептида в отношении большого числа грамположительных и грамотрицательных бактерий, большинство из которых выделены из инфекций среднего уха и кишечника. Примеры подавляемых бактерий: Асше1оЬас1ег Ьаитапп, ВасШик сегеик, ОоЧпбшт 1угоЬи1уг1сит, Еп1егоЬас1ег с1оасае, ЕксйепсЫа сой, К1еЬк1е11а рпеитошае, Б-Мела шиосиа, Ркеиботоиак агидшока, 81арйу1ососсик аигеик, 81арйу1ососсик сагпокик, 81гер1ососсик саргшик, 81гер1ососсик (Ейегососсик) Гаесайк, 81гер1ососсик рпеитошае, а также некоторое количество клинических штаммов неопознанных грамположительных и грамотрицательных бактерий, изолированные из

- 4 017558 проб жидкости воспаленного среднего уха. Таким образом, пептид имеет обширный спектр действия, затрагивающий множество разнообразных человеческих патогенов.

Уже описано несколько антимикробных пептидов широкого спектра действия, активных в отношении грамотрицательных бактерий, например пентоцин 356, получаемый из ЬасЮЬасШиз реиФзиз, бактериоцин БТ151ВВ, получаемый из ЬасЮЬасШиз репЮзиз БТ151ВВ, бактериоцин, получаемый из Ьас1оЬасШиз рагасазе! подвид рагасазег термофилин, получаемый из Б1гер1ососсиз 1егторйу1из, пептид АБ-48, получаемый из Ешегососсиз ГаесаНз, бактериоцин, получаемый из БасЮсоссиз 1асЕз КСА2386 и энтероцин СВЬ35, получаемый из Еи1егососсиз Гаесшт. Однако область действия этих пептидов намного уже по сравнению с пептидом БТ4БА, что видно из приведенного выше списка видов, восприимчивых к пептиду БТ4БА. Широкий спектр активности пептида БТ4БА, особенно в отношении патогенных бактерий, делает его идеальным средством для регуляции бактериальных инфекций, в особенности воспалений среднего уха (благодаря активности пептида в отношении большого количества различных патогенов среднего уха), а также патогенов, связанных с вторичными раневыми инфекциями (пептид подавляет рост численности таких патогенов). Из жидкости инфицированного среднего уха были изолированы следующие патогенны: Асше1оЬас1ег Ьаитапй, ЕзсйепсЫа сой, К1еЬз1е11а рпеитошае, Рзеиботоиаз агидшоза, Б1арйу1ососсиз аигеиз, 81арйу1ососсиз сатозиз, 81герЮсоссиз рпеитошае, а также некоторое количество неопознанных грамположительных и грамотрицательных бактерий.

Материалы и методы.

Изолирование штамма БТ4БА и его идентификация до уровня видов.

Соевый экстракт, полученный из соевых бобов, вымоченных в стерильной дистиллированной воде в течение 4 ч, последовательно разбавляли и высевали на чашки с агаром МВБ (компания Вю1аЬ, Вю1аЬ О1адпозйсз, г. Мидранд, Южная Африка), в который добавили 50 мг/л натамицина (ЭекосИ®, компания С1з1-Ьгоса6ез, В.У., г. Делфт, Нидерланды) для предотвращения развития грибков. Чашки инкубировали в течение двух дней при температуре 30 и 37°С.

Колонии были случайным образом отобраны из чашек с количеством колониеобразующих единиц КОЕ от 50 до 300, после чего произвели скрининг на наличие антимикробной активности путем наложения второго слоя агара МВБ, дополненного препаратом Эе1уос1б® (50 мг/л). Чашки инкубировали в течение 48 ч при температуре 30 и 37°С в анаэростате (компания Охо16, Хэмпшир, Англия) в присутствии газообразующего комплекта (компания Охо16). Колонии покрыли третьим слоем (около 10 мл) полутвердой (1,0% агар, вес./об.) среды ВН1 (сердечно-мозговая вытяжка, компания Мегск, г. Дармштадт, Германия), дополненной 1 мл активно растущих клеток (около 10⁶ сГи/т1) Ьас1оЬасШиз сазе1, Еп1егососсиз Гаесайз, Б1арйу1ососсиз аигеиз, Рзеиботопаз аегидшоза, К1еЬз1е11а рпеитошае, Б1гер1ососсиз рпеитошае и Б1арйу1ососсиз аигеиз соответственно. Чашки инкубировали в течение 24 ч при температуре 37°С.

Одна из колоний подавляла наибольшее многообразие патогенов, входящих в испытательную группу (табл. 4), и была пересеяна в бульон МВБ (компания Вю1аЬ), после чего штриховым методом получили чистые культуры. Изолят обозначили как штамм БТ4БА. Антимикробную активность подтвердили с помощью капельного теста на агаре.

Клеточную морфологию штамма БТ4БА изучали посредством сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) (см. фиг. 1). 10 мл культуры штамма БТ4БА в начальной экспоненциальной фазе (ОП_600нм=0,2) собрали центрифугированием и пять раз промыли стерильной дистиллированной водой (3000 об/мин, 10 мин, 4°С). Осадок перерастворили в 500 мкл стерильной воды, очищенной с помощью системы Мййф (^а!егз, Мййроге), а затем подвергли микроскопии.

Дальнейшую идентификацию проводили по физиологическим (табл. 2) и биохимическим признакам. Тест на образование пигмента проводили на триптическом соевом бульоне (компания Мегск). Также выполнили тест на мобильность. Реакции брожения сахара (табл. 1) отмечали с помощью тестовых полосок АР1 50 СНЬ и АР1 20 Б(гер (компания Вютепеих, г. Марси-Летуаль, Франция) и сопоставляли с реакциями, указанными для энтерококков.

- 5 017558

Таблица 1

Соединение/Производное	Брожение Е. типсНН ЗТ45А
Контроль
Глицерол	+
Эритритол
β-арабиноза
1_- арабиноза	++
Рибоза	+++
ϋ-ксилоза	++
1_- ксилоза
Адонитол
Метил-ксилозид
Галактоза	++
ϋ-глюкоза	+++
ϋ-фруктоза	+++
О-манноза	++
Ь-сорбоза
Рамноза	++
Дульцит
Инозит
Манит	++
Сорбитол	++
Метил-О-маннозид	++
Метил-О-глюкозид
Ацетилглюкозамин	++
Амигдалин	+++
Арбутин	+++
Эскулин	+++
Салицин	+++
Целлобиоза	+++
Мальтоза	+++
Лактоза	+++
Мелибиоза	++
Сахароза	+++
Т регалоза	++
Инулин
Мелицитоза
ϋ-рафиноза
Крахмал	+
Гликоген
Ксилитол
В амигдалоза	+++
ϋ-тураноза
Э-ликсоза
ϋ-тагатоза
Э-фукоза
Ь-фукоза
ϋ-арабитол
1_- арабитол
Глюконат
2 кетоглюконат
5 кетоглюконат

- 6 017558

Таблица 2

Признак	Штамм 5Т48А
СО₂ из глюкозы	-
Рост при 10°С	+
Рост при 45°С	+
Рост при 6,5% ЫаС1	+
Рост при 18% №С1	-
Рост при рН=4,4	+
Рост при рН=9,6	+
Конфигурация молочной кислоты	Б

Дальнейшую идентификацию выполняли по расположению полос фрагментов ДНК, созданных с помощью праймеров, специфических для энтерококков (фиг. 2) и ЕЫегососсиз шипШй (фиг. 3). В качестве маркера использовали фрагмент ДНК длиной в 50 п.н. (компания Ашегзйаш Вюзыепсе, ϋΚ Ышйеф Великобритания). Праймеры, с помощью которых был создан фрагмент длиной в 306 п.н. (изображенный на фиг. 3), синтезировали из подходящих консервативных участков 168 рДНК.

ПОСЛ. ИДЕНТ. НОМЕР 1: Прямой праймер:

ААСОАССССААССС;

ПОСЛ. ИДЕНТ. НОМЕР 2: Обратный праймер:

0АС0С6С66Т6ТСТАС

Секвенирование фрагмента ДНК показало 98% гомологии с консервативными участками 168 рДНК из базы данных ОепВапк.

Выражение антимикробной активности.

Антимикробную активность выражали в условных единицах (УЕ) на 1 мл бесклеточного супернатанта. За одну УЕ принимали обратную величину максимального разбавления, демонстрирующего четкую зону подавления роста, и рассчитывали по формуле а^ьх100, где а - коэффициент разбавления;

Ь - последнее разбавление, образующее зону подавления диаметром не менее 2 мм.

Активность на 1 мл получали умножением на 100. В качестве индикаторного штамма использовали БаШоЬасШиз сазе1 БН8.

Определение характеристик антимикробного вещества.

Штамм 8Т48А культивировали в бульоне МК.8 (компания Вю1аЬ) в течение 24 и 48 ч при температуре 30°С. После этого клетки собирали (8000 об/мин, 4°С, 15 мин) и доводили бесклеточные супернатанты до рН 6,0 с помощью 6 М №ОН. 1 мл каждого супернатанта обрабатывали каталазой (компания Воейппдег Маппйе1ш) при 0,1 мг/мл (конечная концентрация), протеиназой К (компания Косйе, г. Индианаполис, штат Индиана, США), проназой, папаином, пепсином и трипсином (компания Воейгшуег Маппйет ОшЬН, Германия), при 1 и 0,1 мг/мл (конечная концентрация) соответственно. После инкубации ферменты инактивировали нагреванием (3 мин при 100°С) и проверяли на антимикробную активность согласно вышеописанной процедуре. Результаты приведены в табл. 3.

Аликвоты пептида 8Т48А подвергали воздействию температур 30, 60 и 100°С в течение 10, 30 и 90 мин соответственно и 121°С в течение 20 мин (табл. 3). Затем образцы проверяли на антимикробную активность согласно вышеописанной процедуре.

- 7 017558

Таблица 3

Воздействие	Пептид 8Т45А
Ферменты:
а-амилаза	+
Протеиназа К	-
пепсин	-
проназа	-
ЕШ
2,0-12,0	+
Нагревание:
30, 60, 100 °С в течение 10 мин	+
30, 60, 100 °С в течение 30 мин	+
30, 60, 100 °С в течение 90 мин	+
121 ’С в течение 20 мин	-
Детергенты (1%);
δϋδ (додецилсульфат натрия)	+
Твин 20, Твин 80 (полисорбат 20, 80)	+
мочевина	+
Тритон Х-100	+
Тритон Х-114	-
ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная
кислота):	+
0,1 ммоль (мМ), 1,0 мМ, 2,0 мМ

- = активности нет;

+ = зоны активности не менее 5 мм в диаметре.

В рамках отдельного эксперимента образцы пептида 8Т48А доводили до рН от 2 до 12, инкубировали при 37°С в течение 30 мин, нейтрализовали до рН7, а затем проверяли на антимикробную активность (табл. 3).

Изолирование и очистка пептида 8Т48Л.

Культуру штамма 8Т48Л суточной давности прививали (2%, об./об., ОП_600нм=8,0) в бульон МК8 (компания Вю1аЬ). Инкубацию проводили при температуре 37°С, без встряхивания, в течение 20 ч. Затем клетки собрали (8000 об/мин, 10 мин, 4°С) и осадили пептид из бесклеточного супернатанта сульфатом аммония с насыщенностью 80%. Осадок перерастворили в одной десятой объема 25 мМ ацетата аммония (рН 6,5), обессолили на дистиллированной воде с помощью диализной мембраны с М\УСО=1000 Да (компания 8рсе1гит 1пс., штат Калифорния, США) и поместили на колонку 8ерРак С18 (компания \Уа1ег Мййроге, штат Массачусетс, США). Колонку промыли 20% (об./об.) раствором изопропанола в 25 мМ ацетата аммония (рН 6,5) и бактериоцином, элюированным 40% раствором изопропанола в 25 мМ ацетата аммония (рН 6,5). После сушки в вакууме (прибор 8рееб-Уас; компания 8агап1) фракции объединили и растворили в 50 мМ фосфатного буфера, рН 6,5. Активные фракции подвергли дальнейшему разделению посредством гель-хроматографии (гель-фильтрации) в колонке 8ирегбех™ 75 (компания Атегкйат Рйагтас1а Вю1ес11). связанной с хроматографом АКТА-рипйег (компания Атегкйат) (фиг. 4). Элюирование пептида из колонки производили посредством 50 мМ фосфатного буфера и 400 мМ №1СТ рН 6,5. Пептиды были обнаружены при 254 и 280 нм соответственно. Фракции, содержащие активный пептид, собрали, высушили в вакууме и хранили при температуре -20°С. Проверку на активность проводили с помощью капельного теста на агаре.

Определение размера.

Штамм 8Т48А выращивали в бульоне МК8 (компания В1о1аЬ) в течение 20 ч при температуре 30°С. Клетки собирали центрифугированием (8000 об/мин, 10 мин, 4°С) и осаждали пептид 8Т48А из бесклеточного супернатанта сульфатом аммония с насыщенностью 80%. Осадок перерастворили в одной десятой объема 25 мМ ацетата аммония (рН 6,5), обессолили на дистиллированной воде посредством диализной мембраны с М\УС’О=1000 Да (компания 8рес1гит 1пс., штат Калифорния, США) и отделили с помощью трицин-8Э8 (додецилсульфат натрия)-ПААГ (электрофореза в полиакриламидном геле) (фиг. 5А). Использовали низкомолекулярный маркер для размеров от 2,35 до 46 кДа (компания Атегкйат 1п(ета1юпа1, Великобритания). Гели зафиксировали и наполовину покрыли Исаке! ЬН8 (10⁶ КОЕ/мл), введенными в агар с сердечно-мозговой вытяжкой (компания Вю1аЬ), чтобы определить расположение активного бактериоцина (фиг. 5В).

- 8 017558

Проверка пептида 8Т48А на цитотоксичность.

Для поиска цитотоксических свойств у пептида 8Т48Л в чашках тканевых культур в течение 48 ч в тройных лунках выращивали сплошные монослои клеток Уего почек обезьян, после чего их подвергали воздействию антимикробного пептида в различной концентрации. После 48 ч инкубации проверяли жизнеспособность клеток, для чего их обрабатывали солями тетразолия (МТТ) [3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)2,5-дифенилтетразолиум бромид] (сигма). Отметили образование синего вещества (формазан), которое получается при расщеплении МТТ сукцинатдегидрогеназой.

Уровень цитотоксичности в 50% (СС₅о) определили как концентрацию пептида (мк/мл), требуемую для снижения жизнеспособности клеток на 50%. Согласно результатам СС₅₀ (уровень цитотоксичности) не было отмечено цитотоксических свойств, т.е. пептид имеет нулевую цитотоксичность, т.е. СС₅₀=0.

Изолирование плазмиды.

ДНК изолировали целиком. Изолировали плазмидную ДНК, затем ДНК подвергли дальнейшему очищению с помощью центрифугирования в градиенте плотности хлорида цезия. ДНК отделяли на агарозном геле (фиг. 6). В качестве маркера молекулярных масс использовалась лямбда-ДНК, обработанная ЕсоК! и ΗίηάΙΙΙ (компания Рготеда, г. Мэдисон, США).

Излечивание плазмиды.

Проводили эксперименты по излечиванию. Клетки Εηΐ. типб1и 8Т48А инкубировали в присутствии новобиоцина (1-25 мкг-мл^-1) в течение 72 ч при температуре 37°С. Культуру, которая росла при наибольшей концентрации новобиоцина, последовательно разбавляли стерильным соляным раствором и высевали на чашки с агаром МК8. После ночной инкубации при 37°С колонии были перепечатаны (методом отпечатков) на другие чашки, а исходные чашки покрыли клетками Еп!егососси§ ГаесаНз ЬМО 13566. После дополнительных 16 ч инкубации при 37°С колонии проверили на утерю антимикробной активности.

Эксперименты с конъюгативным переносом.

Проводили эксперименты по конъюгации через фильтр. К 4,5 мл МК8 добавляли выращенную за ночь культуру (0,25 мл) Εηΐ. ιηιιηάΐίί 8Т48А и Εηΐ. ГаесаШ ЕА2-2, перемешивали и пропускали через стерильный мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм (НА\УР. компания Мййроге). Мембрану высевали в чашку с МК.8 агаром и ночью инкубировали при температуре 37°С. Клетки с фильтра вымывали в 1 мл МК8, последовательно разбавляли и высевали на чашки с МК8 агаром, содержащие 25 мкг-мл^-1 фусидовой кислоты, 25 мкг-мл^-1 рифампицина и 2000 УЕ мл^-1 неочищенного пептида 8Т48А. Эксперимент повторяли, используя в качестве реципиента Εηΐ. ГаесаШ ООХ1. В этом случае выборку осуществляли на чашках, содержащих 1 мг-мл^-1 стрептомицина и 2000 УЕ мл^-1 неочищенного пептида 8Т48А. Колонии выбирали случайным образом и проверяли на образование пептида 8Т48А, также проводился скрининг на содержание плазмиды согласно вышеописанной процедуре. Колонию конъюгированных клеток Εηΐ. ГаесаШ ООХ1, содержащую р8Т48А, культивировали и проверяли активность бесклеточного супернатанта согласно вышеописанным процедурам.

Обнаружение генетических элементов, кодирующих пептид 8Т48А и секвенирование ДНК.

ДНК изолировали целиком. Для амплификации структурного гена, транспортного гена и гена иммунитета с помощью ПЦР использовали праймеры (см. ниже), синтезированные на основе частичных последовательностей, опубликованных для других антимикробных пептидов. Секвенирование производили с помощью комплекта для секвенирования ΑΒΙ РгЦт™ ВщИуе™ ТегтшаЮг Сус1е 8е^иеηс^ηд Кеабу РепсНом и секвенатора ДНК ΑΒΙ РгЦт™ 377 (компания РЕ Аррйеб Вюзуйет, г. Фостер Сити, США). Поиск по базам данных осуществляли с помощью программ ВЬА8ТИ и ВБА8ТХ Национального информационного центра биотехнологий (ИСВЦ, г. Бетесда, штат Мэрилэнд, 20894, США.

- 9 017558

Праймеры структурного гена:

ПОСЛ. ИДЕНТ. НОМЕР 3: ЗО-а: Т0А0АСААС6ТТТААСТТТТСААСАА (прямой)

ПОСЛ. ИДЕНТ. НОМЕР 4: 86-Ь: ТССАСТ6АААТССАТ6ААТ6А (обратный)

Праймеры АВС-транспортера:

ПОСЛ. ИДЕНТ. НОМЕР 5: АВС1-а: Т6АТ66АТТТСА6Т60АА6Т (прямой)

ПОСЛ. ИДЕНТ. НОМЕР 6: АВС1-Ь: АТСТСТТСТСС6ТТТААТС6 (обратный)

ПОСЛ. ИДЕНТ. НОМЕР 7: АВС2-а: 6ТСАТТ0ТТ6Т6666АТТАТ (прямой)

ПОСЛ. ИДЕНТ. НОМЕР 8: АВС2-Ь: ТСТА6АТАС6ТАТСАА6ТСС (обратный)

Праймеры гена иммунитета:

ПОСЛ. ИДЕНТ. НОМЕР 9: 1ттип-а: ТТССТ6АТ6ААСАА6ААСТС (прямой)

ПОСЛ. ИДЕНТ. НОМЕР 10: 1ттип-Ь: 6ТССССАСААССААТААСТА (обратный)

Образование пептида 8Τ48Α в различных питательных средах и при различных начальных значениях рН.

18-часовую культуру штамма 8Τ48Ά прививали (2%, об./об.) в бульон МК8, бульон с сердечномозговой вытяжкой и бульон М17 (компания Мегск, г. Дармштадт, Германия), соответственно. Инкубацию проводили при температуре 30 и 37°С соответственно, без встряхивания, в течение 28 ч. Каждый час производили забор образцов, которые исследовали на рост бактерий (ОП при 600 нм), изменения значения рН культуры и на антимикробную активность (УЕ/мл) в отношении Б.са8е1 БН8. Использовали метод капельного теста на агаре, описанный ранее.

В рамках отдельного эксперимента устанавливали влияние начального значения рН среды на образование пептида 8Τ48Ά. Образцы бульона МК8 каждый объемом 300 мл с помощью 6 М НС1 или 6 М ЦаОН доводили до рН, равного 4,5, 5,0, 5,5, 6,0 и 6,5 соответственно, а затем обрабатывали в автоклаве (фиг. 9А). В каждую колбу прививали 2% (об./об.) 18-часовой культуры штамма 8Τ48Α и инкубировали при температуре 30°С в течение 20 ч, без встряхивания. Изменения в значении рН культуры и образовании пептида 8Τ48Α (в УЕ/мл) определяли каждый час согласно вышеописанной процедуре. Все эксперименты проводили в трех экземплярах.

Влияние состава среды на получение пептида 8Τ48Α.

Штамм 8Τ48Α выращивали в 10 мл бульона МК8 в течение 18 ч при 30°С, клетки собирали центрифугированием (8000 об/мин, 10 мин, 4°С), осадок перерастворяли в 10 мл стерильной пептонной воды. 4 мл полученной клеточной суспензии использовали для привития образцов следующих сред (по 200 мл):

(а) бульон МК8 (Ман, Рогоза, Шарп), без органических питательных веществ, дополненный триптоном (20,0 г/л), мясной вытяжкой (20,0 г/л), дрожжевым экстрактом (20,0 г/л), триптоном (12,5 г/л) и мясной вытяжкой (7,5 г/л), триптоном (12,5 г/л) и дрожжевым экстрактом (7,5 г/л), мясной вытяжкой (10,0 г/л) и дрожжевым экстрактом (10,0 г/л) либо комбинацией триптона (10,0 г/л), мясной вытяжки (5,0 г/л) и дрожжевого экстракта (5,0 г/л) соответственно;

(б) бульон МК8 (компания Вю1аЬ), содержащий 20,0 г/л глюкозы;

(в) бульон МК8 (Ман, Рогоза, Шарп) без глюкозы, дополненный 20,0 г/л фруктозы, сахарозы, лактозы, маннозы и мальтозы соответственно;

(г) бульон МК8 с 0,1-40,0 г/л фруктозы в качестве единственного источника углерода;

(д) бульон МК8 (Ман, Рогоза, Шарп) с 2,0-50,0 г/л К₂НРО₄ или 2,0-50,0 г/л КН₂рО₄; а также (е) бульон МК8 (Ман, Рогоза, Шарп), дополненный 0-50,0 г/л глицерола.

В рамках отдельного эксперимента в бульон МК8 добавляли стерилизованные посредством фильтрации витамины при 1,0 мг/мл (конечная концентрация): цианокобаламин (компания 81§та, г. СентЛьюис, штат Миссури, США), Б-аскорбиновую кислоту (компания ВИН СГетюак Б1б, г. Пул, Великобритания), тиамин (компания 81§та), ИБ-6,8-тиоктовую кислоту (компания 81§та) и витамин К! (компания Ийка СЪеине ΑΟ, г. Букс СН-9471, Швейцария).

Во всех испытаниях инкубацию производили при температуре 30°С в течение 20 ч. Уровни активности пептида 8Τ48Α определяли согласно вышеописанной процедуре. Все эксперименты проводили в трех экземплярах.

Штамм 8Τ48Α был опознан как штамм рода энтерококков на основе морфологии (см. фиг. 1), немобильности, отсутствия образования пигмента, а также ПЦР с родоспецифическими праймерами (фиг. 2) и видоспецифическими праймерами (фиг. 3). Дальнейшую идентификацию до уровня видов производили по характеру реакций брожения сахара (см. табл. 1) и по физиологическим параметрам

- 10 017558 (см. табл. 2).

Пептид 8Т48Л инактивировали обработкой протеолитическими ферментами (протеиназа К, пепсин, проназа, папаин и трипсин), Тритоном Х-114 и нагреванием в течение 20 мин при 121^ОС, что видно из табл. 3. Пептид оставался активным после нагревания в течение 90 мин при 100ОС, а также после обработки Твином 20, Твином 80, мочевиной, ЭДТА и Тритоном Х-100 (табл. 3). Не было отмечено потери активности после инкубации при значениях рН от 2,0 до 12,0 (табл. 3).

Пептид 8Т48Л подавлял большое количество грамположительных и грамотрицательных бактерий, как видно из табл. 4.

Таблица 4

Организм	Темп. (°С)	Среда, инкубация	Активность пептида
4в1пе1оЬас1ег Ьаитапн АВ 16	37	ВНР, аэробная	+
ВасШиз сегеиз 1_МС 13569	37	ΒΗΙ, аэробная	+
С1оз1псНит (угоЬи1упсит 1_МО 13571	30	КСМ^&, анаэробная	+
Еп1егоЬас1ег с1оасае26	37	ΒΗΙ	+
Еп1егососсиз /аесаНз 1_МС 13566, Е77, Е80, Е90, Е92, РА2, 20, 21	37	МКЗ, аэробная	+
ЕзсЬепсЫа соП ЕС1	37	ΒΗΙ	+
К1еЬз1е1а рпеитот'ае КР31	37	ΒΗΙ	+
’ ас1оЬас\|\|1из аск1орЫ1и8 1_М(Э 13550	37	МКЗ, анаэробная
1_ас1оЬасП1из Ьи1дапсиз 1_МС 13551	37	МКЗ, анаэробная
1_ас1оЬасН1из сазе/ 1_МС 13552	37	МКЗ, анаэробная
1_ас1оЬасП1из сип/а1из 1_МС 13553	30	МКЗ, анаэробная
1_ас1оЬасП1из ?егтеп1ит 1_МС 13554	37	МКЗ, анаэробная
Ьас1оЬасП1из Ье/уеИсиз 1_МС 13555	42	МКЗ, анаэробная
1_ас1оЬасН1из р1ап1агит 1_МС 13556	37	МКЗ, анаэробная
1-ас1оЬасН1и$ геи1еп ЬМС 13557	37	МКЗ, анаэробная
1_ас1оЬасП1из заке! ЬМС 13558	30	МКЗ, анаэробная	+
1_еисопоз1ос тезеп1его1дез подвид сгетопз 1_МС 13562	30	МКЗ, анаэробная
и$(епа тпосиа Ι-ΜΘ 13568	30	ΒΗΙ, аэробная	+
РесПососсиэ регйозасеиз 1_МЗ 13560	30	МКЗ, анаэробная
Ргор. ас1Скргорюп1С11_МС 13572	32	СУР^В, анаэробная
Ргорюп1Ьас1епит вид ЬМС 13574	32	СУР, анаэробная	+
Рзеис1отопаз аегидтоза 1,7	37	ΒΗΙ, аэробная	+
31ар(1у1ососсиз аигеиз 6, 13, 33-38	37	ΒΗΙ	+
31ар11у1ососсиз сагпозиз 1_МО 13567	37	ΒΗΙ, аэробная	+
31гер1ососсиз сарппиз Τ81, Τ82	37	ΒΗΙ, аэробная	+
31гер1ососсиз рпеитогиае 3, 4, 27, 29	37	ΒΗΙ, аэробная	+
31гер1ососсиз {ЬегторкНиз 1_МС 13565	42	МКЗ, анаэробная

^а ВН1 - сердечно-мозговая вытяжка;

^б КСМ - улучшенная клостридиальная среда; ^в ΘΥΡ - глюкоза, дрожжи, пептон.

- 11 017558

Пептид 8Т48А очищали гель-фильтрацией (см. фиг. 4); как видно из фиг. 4 и 5, молекулярный вес пептида лежит в пределах 3400 Эа. При проверке на Уето клетках согласно вышеописанной процедуре у пептида не было обнаружено цитотоксичных характеристик.

Штамм 8Т48А имеет две плазмиды (см. фиг. 6А). При вылечивании штамма от этих плазмид потери антимикробной активности не наблюдалось. При зондировании хромосомной и плазмидной ДНК с помощью фрагмента ДНК, кодирующего структурный ген, отмечали четкое скрещивание с хромосомой (геномом) (см. фиг. 6Б). Это доказывает, что структурный ген, кодирующий пептид 8Т48А, содержится в геноме. Кроме того, конъюгация упомянутых плазмид с Е.£аееа118 (не показано на фигуре) не превратила штамм в источник пептида 8Т48А, что подтверждает тот факт, что гены, кодирующие образование пептида 8Т4, располагаются в геноме штамма 8Т48А.

Последовательность пептида 8Т48А приведена на фиг. 7 и в списке последовательностей, и в рамках данного изобретения обозначается как ПОСЛ. ИДЕНТ. НОМЕР 12. Последовательности транспортного и иммунного пептидов в рамках данного изобретения обозначаются как ПОСЛ. ИДЕНТ. НОМЕР 14 и 16 соответственно.

Последовательности ДНК структурного, транспортного и иммунного генов приведены на фиг. 8 и в списке последовательностей, и в рамках данного изобретения обозначаются как ПОСЛ. ИДЕНТ. НОМЕР 11, 13 и 15 соответственно.

Образование пептида 8Т48А в различных питательных средах показано на фиг. 9А и 9Б. Влияние начального значения рН среды на образование пептида 8Т48А приведено на фиг. 9А. Из этих результатов очевидно, что оптимальной средой для получения пептида 8Т48А является бульон МК8 с начальным значением рН 6,0 или 6,5 и что наличие 10-20 г/л К₂НРО₄, 15,0-20,0 г/л фруктозы или присутствие витаминов С, В1 и ПЬ-6,8-тиоктовой кислоты стимулирует образование пептида.

Получение пептида 8Т48А показано на фиг. 10. Максимальный уровень образования зафиксировали после 14 ч культивирования.

На фиг. 11 показан фрагмент ДНК, содержащий ген адгезии/иммунитета; в рамках настоящего изобретения этому фрагменту присвоен номер ПОСЛ. ИДЕНТ. НОМЕР 15.

Еи1егососси8 типФи 8Т48А вырабатывает антимикробный пептид широкого спектра действия (пептид 8Т48А), активный в отношении различных патогенов. Структурный ген, кодирующий лидерный пептид и пропептид (в совокупности они известны под именем препептид), располагается в геноме штамма 8Т48А (см. фиг. 6Б). Обнаружили только одну такую генную структуру, что указывает на то, что широкий спектр антимикробной активности обеспечивается только одним пептидом. Были произведены попытки излечивания штамма 8Т48А от его 50 кб и 100 кб плазмид (см. фиг. 1), однако они не увенчались успехом. Это говорит о том, что плазмида играет важную роль в обеспечении иммунитета пептида 8Т48А либо содержит гены, существенные для ключевых реакций метаболизма.

Дальнейшее подтверждение того, что 8Т48А является штаммом ЕпГетососсик типФи, получили посредством видоспецифической ПЦР (полимеразной цепной реакции) с праймерами, синтезированными из консервативных участков 168 рДНК:

ПОСЛ. ИДЕНТ. НОМЕР 16: Прямой праймер: ААС6АОСОСААССС;

ПОСЛ. ИДЕНТ. НОМЕР 17: Обратный праймер:

САСОСССССТСТСТАС.

Амплифицировали фрагмент длиной в 306 пар оснований (см. фиг. 3). Секвенирование фрагмента ДНК дало 98% гомологии с консервативными фрагментами 168 рДНК из ОепБапк.

Структурный ген (кодирующий пропептид 8Т48А), транспортные гены и ген иммунитета были секвенированы, а их последовательности аминокислот были транслированы из последовательностей ДНК (фиг. 8).

Стабильность пептида 8Т48А, взвешенного в стерильной дистиллированной воде, проверяли при температурах от -20 до 60°С на протяжении 42 дней (фиг. 12). Пептид оставался стабильным при -20°С в течение 42 дней и при 4°С в течение трех недель. Уровень стабильности понизился после одной недели проверки при температуре 37°С. Однако пептид 8Т48А в виде порошка оставался стабильным в течение 6 месяцев при комнатной температуре (25°С). Пептид 8Т48А будет изготавливаться и продаваться в виде порошка. После растворения в стерильной дистиллированной воде пептид 8Т48А можно хранить в течение трех недель при температуре 4°С (см. фиг. 12).

Активность пептида 8Т48А на бумажных дисках приведена в табл. 5. Сравнение активности с антибиотиками показано в табл. 6. Активность проверялась в отношении вида Ркеиботопак, изолированного из жидкости инфицированного среднего уха. Фотографии зон подавления приведены на фиг. 13.

- 12 017558

Таблица 5

Активность пептида 8Т48А на бумажных дисках

	Пептид 5Т43А (УЕ/мл)
Лиофилиз. (УЕ/мл)	409600
Бумажный диск (2 см х 2 см; 700 рл)	286720
Бумажный диск (0,6 см в диаметре)	20263

Таблица 6

Сравнение активности пептида 8Т48Л и популярных антибиотиков

Антибиотик	Диаметр зон подавления (мм)
Ампициллин (10рг)	24
Бацитрацин (10 единиц)	10
Хлорамфеникол (ЗОрг)	28
Эритромицин (15рг)	Зона отсутствует
Тетрациклин (ЗОрг)	35
Пептид 3Τ43Α	25

Связывание пептида 8Т48А с целевыми клетками существенно для обеспечения проникновения пептида внутрь. Изучали способность пептида 8Т48А прикрепляться к патогенам; результаты выражали в процентах прикрепления к патогенам (табл. 7). Согласно результатам не менее 75% пептида 8Т48А прикрепляется к патогенам, использованным в эксперименте. После адгезии пептида 8Т48А к целевой клетке происходит проникновение внутрь и разрушение клеточной мембраны (фиг. 14).

Дальнейшее подтверждение наличия повреждений клеточных мембран и вытекания клеточных составляющих получили при проверке на активность внеклеточной ДНК и внеклеточной β-галактозидазы. Результаты приведены в табл. 8 и 9 соответственно. Данные указывают на то, что ДНК и β-галактозидаза вытекли из клеток, поврежденных пептидом 8Т48А. Вытекание β-галактозидазы отмечалось не у всех патогенов, так как не все виды имеют высокий внутриклеточный уровень этого фермента.

- 13 017558

Таблица 7

Адгезия пептида 8Т48Л к патогенам

Патоген

% прикрепления пептида 8Т48А к целевой клетке (патогена)

Пептид 8Т48А при 6400 УЕ/мл

Пептид 8Т48А при 204800 УЕ/мл

0

50

75

88

94

100

0

50

75

88

94

100

3(гер(ососсиз рпеитотае

27

+

29

+

ϋ

+

8{гер1ососси8 руодепез

20

+

21

+

Рзеидотопаз аиппдгпоза

Е

+

К1еЬз1еНа рпеитогнае

30

+

Изоляты из среднего уха (неопознанные

13

+

17

+

25

+

40

+

вт

+

Ст

+

От

Р

+

нт

+

1

+

д

+

ст

+

к

+

£

+

М

+

- 14 017558

Таблица 8

Данные об активности внеклеточной ДНК после обработки патогенов пептидом 8Т48А

Патоген Вытекание ДНК (показания ОП при 260 нм)
31гер1ососсиз рпеитоп/ае
27	1,670
29	1,182
ϋ	1,160

&гер(ососси$ руодепез
20	0,930

Рзеидотопаз аиппдтоза
Е	0,187

3(арРу!ососсиз аигеиз
36	0,892

К1еЬ$1е11а рпеитоп/ае
30	1,01

Изоляты из среднего уха (неопознанные)
40	0,801
Βνν	1,186
υνν	1,153
Е	1,428
Н\Л/	1,559
ονν	0,751
к	0,455
ι_	0,592
м	0,326

Контроль
Виды энтерококков НК1 Н8	1,395

На фиг. 15-23 показан лизис клеток различных патогенов после обработки пептидом 8Т48А. 0,2% (об./об.) инокулят ночного патогена привили в бульон с сердечно-мозговой вытяжкой. К каждому патогену добавляли пептид 8Т48А в середине экспоненциальной фазы. Из приведенных результатов (фиг. 1523) ясно, что пептид 8Т48А оказывал бактерицидное воздействие на большинство патогенов.

Изучали образование пептида 8Т48А в присутствии Ь181епа тиосиа (фиг. 24). Согласно результатам исследования Ь.шпосиа стимулирует производство пептида 8Т48А штаммом 8Т48А, которое, в свою очередь, подавляет Ь.тпосиа.

- 15 017558

Таблица 9

Патоген	Активность β-галактозидазы при ОП₄₂₀
8(гер1ососсиз рпеитоп/ае
27	Утечки нет
29	Утечки нет
ϋ	Утечки нет

31гер1ососси8 руодепез
20	Утечки нет

8(арРу1ососсиз аигеиз
36	Утечки нет

К1еЬз1е11а рпеитотае
30	Утечки нет

Изоляты из среднего уха (неопознанные)
40
ВИ/	0,370
ОН/	0,293
Р	0,318
нш	0,235
Θΐν	0,373
К	Утечки нет
Б	Утечки нет
Μ	Утечки нет
Контроль
Виды энтерококков НКБН5	Утечки нет

Еп1егососси8 ιηιιπάΐίί 8Т48А как пробиотик.

Выживание Еп1егососси§ ιηιιπάΐίί 8Т48А оценивали с помощью компьютеризированной модели желудочно-кишечного тракта (ЖКМ, показана на фиг. 25).

Первый сосуд ЖКМ изображает желудок, второй - двенадцатиперстную кишку, третий - тонкую и подвздошную кишку, а четвертый - толстую кишку. Поток питательных веществ контролировали с помощью специальной программы. Уровень рН в различных секциях ЖКМ регулировали посредством перистальтического введения стерильного 1н. НС1 или 1н. ΝαΟΗ. Каждую секцию оборудовали высокочувствительным датчиком рН, соединенным с блоком управления и компьютером. Скорость потока питательных веществ через ЖКМ регулировали в соответствии с кишечником новорожденного. Были специально выбраны условия, симулирующие короткий пищеварительный тракт, чтобы обеспечить больший размах колебаний и, соответственно, увеличить нагрузку на пробиотик. Оценивали четыре смеси для грудных детей (БасЮдеп 2, NАN Ре1агдоп, АББ110 и А1Гаге). Дозировка пробиотических бактерий (8Т48А) производилась в соответствии с рецептурой, т.е. 10⁸ жизнеспособных клеток (КОЕ) на 1 мл. Пробиотические клетки взвешивали в слюне. Раствор панкреатического сока и желчи содержал NаНСΟз, панкреатин и медицинскую желчь, растворенные в дистиллированной воде. Использованные в ЖКМ условия описаны в табл. 10 и 11.

- 16 017558

Таблица 10

Время (мин)	рН	Питательная среда	Раствор панкреатического сока и желчи
0-4		Питательные вещества закачивают в желудок (сосуд). Дозировка штамма ЗТ45А 10⁸ кое/мл
4-44	5,2	Инкубация в желудке
44 - 64	4,9
64-108	4,5
108 - 128	4,1
128-154	3,7
154 - 156		Раствор панкреатического сока и желчи закачивают в двенадцатиперстную кишку
154-158		Содержимое желудка закачивают в двенадцатиперстную кишку
158-274	6,5	Инкубация в двенадцатиперстной кишке
274-280		Содержимое двенадцатиперстной кишки закачивают в тонкую кишку
280 - 394	6,5	Инкубация в тонкой кишке
394-401		Содержимое тонкой кишки закачивают в подвздошную кишку
401 - 520	6,0	Инкубация в подвздошной кишке

Таблица 11

Отдел ЖКМ	КОЕ^э/мл в смеси ΝΑΝ Ре1агдол	Активность бактериоцина (> 25600 УЕ⁶/мл)	КОЕ/мл в бульоне МК8	Активность бактериоцина (> 25 600 УЕ/мл)
Инокулят	Тбх 10“	+	6,0 х 10^7-	+
Желудок	1,2 х 10'	+	3,7x10'	-I-
Двенадцатиперстная кишка	2,5x10⁶	+	1,0 х 10^	+
Тонкая кишка	1,0x10'	+	1,3 х 10“	+
Подвздошная кишка	5,0x10'	+	1,0 х 10“	+

^аКОЕ = колониеобразующие единицы (т.е. количество жизнеспособных клеток);

^бУЕ = условные единицы! (выражают антимикробную активность).

Для проверки выживания штамма 8Т48А в присутствии патогенов ЖКМ заражали ЫЧепа топосу1одепе5. Отслеживали жизнеспособность штамма 8Т48А и его способность производить антимикробный пептид 8Т48А в ЖКМ (см. результаты в табл. 12).

Из представленных в табл. 12 результатов можно сделать вывод. что штамм 8Т48А выжил во всех секциях желудочно-кишечного тракта. Образование антимикробного пептида превышало 25600 УЕ (условных единиц) на 1 мл во всех секциях желудочно-кишечного тракта. Рост в среде ΝΑΝ Ра1агдоп был чуть менее благоприятным. чем в среде МК.8. Однако в обоих экспериментах число клеток не уменьшилось более чем на один логарифмический цикл (см. табл. 13).

- 17 017558

Таблица 12

Антибиотики	ЗТ4
Ампициллин	+++
Бацитрацин	+4-
Цефазолин	+
Хлорамфеникол	+ + +
Ципрофлоксацин	+ + +
Сс1. сульфонамиды	-
Клоксациллин	-
Эритромицин	+++
Метронидазол	-
Метициллин	-
Неомицин	-
Новобиоцин	+++
Нистатин	-
Офлоксацин	++
Оксациллин	-
Рифампицин	+++
Тетрациклин	+++
Стрептомицин	-
Ванкомицин	++
Пенициллин	+ + 4-

- = нет зон подавления (устойчивость к антибиотику); + = зона подавления диаметром от 1 до 11 мм;

++ = зона подавления диаметром от 12 до 16 мм; +++ = зона подавления с диаметром более 17 мм.

Таблица 13

Антибиотик (мг)	Число жизнеспособных клеток штамма 8Т48А
Контроль	1 х 10^а
ТМР-8МХ^а 20/100	7х 10⁴
ТМР-8МХ 40/200	8х 10⁴
ТМР-8МХ 60/300	¹8хО⁴
ТМР-ЗМХ 80/400	1,8 х 10⁴
Метронидазол 50	1,3 х 10⁴
Метронидазол 100	’бхЦУ'
Метронидазол 200	3x10’

^аТМР-8МХ - триметоприм-сульфаметаксозол.

Устойчивость штамма 8Т48А в отношении различных антибиотиков проверяли посредством стандартных процедур (диски с антибиотиками. компания ОхоИ). Согласно результатам штамм 8Т48А устойчив к сульфонамидам. клоксациллину. метронидазолу. метициллину. неомицину. нистатину. оксациллину и стрептомицину (табл. 13).

Для предотвращения диареи у детей с ВИЧ/СПИДом им назначают триметоприм-сульфаметаксозол (ТМР-8МХ) и/или метронидазол. В смесь NАN Ра1агдоп добавляли различные концентрации упомянутых антибиотиков. а затем проверяли их воздействие на штамм 8Т48А после 18 ч инкубации при оптимальной температуре роста (37°С).

Из результатов. представленных в табл. 13. видно. что ТМР-8МХ и метронидазол вызвали уменьшение количества клеток штамма 8Т48А на четыре логарифмических цикла. Однако увеличение концентрации антибиотиков не привело к резким изменениям в жизнеспособности клеток.

- 18 017558

Присутствие факторов вирулентности в 8Т48А.

Для получения пробиотика из штамма 8Т48А важно знать, не связаны ли с ним какие-либо факторы вирулентности. Синтезировали праймеры для генов, кодирующих следующие факторы вирулентности: устойчивость к ванкомицину (VаηΑ/VаηВ);

образование желатиназы (Се1);

субстанция агрегации (А8);

адгезии к коллагену от энтерококков (Асе), поверхностный протеин энтерококков (Езр); гемолизин/бактериоцин (Су1) и нецитолитический β-гемолизин.

ДНК штамма 8Т48А, амплифицированная с помощью перечисленных праймеров, показала, что штамм не содержит генов, кодирующих устойчивость к ванкомицину, активность желатиназы, субстанцию агрегации и адгезию к коллагену. На основании имеющихся результатов можно сделать вывод, что штамм 8Т48А не является патогенным и не должен вызывать аллергических реакций при приеме внутрь.

Широкий спектр антимикробной активности пептида 8Т48А, включающий грамположительные и грамотрицательные бактерии, указывает на возможное отличие механизма действия пептида 8Т48А от других ранее описанных антимикробных пептидов для молочнокислых бактерий. Кроме того, участок распознавания на стенках чувствительных клеток может не совпадать с участком прикрепления липида ΙΙ, который используют другие известные заявителю пептиды (фиг. 26).

Для проверки этой гипотезы целевой участок липида ΙΙ Ьас!оЬасШи8 8аке1 И8М 20017 (чувствительной к пептиду 8Т48А) блокировали ванкомицином (см. схематическое изображение на фиг. 26). Ванкомицин прикрепляется к боковой аминокислотной цепочке молекулы липида ΙΙ, что в теории должно предотвратить присоединение пептида 8Т48А к тому же участку (в случае, если липид ΙΙ действует как рецептор). Однако после обработки целевых клеток (Ь.8аке1 И8М 20017) комбинацией ванкомицина и пептида 8Т48А было отмечено подавление роста (вытекание цитоплазмы; см. фиг. 26), что указывает на то, что в качестве рецепторов для пептида 8Т48А выступают иные целевые участки, а не липид ΙΙ. Способность пептида 8Т48А прикрепляться более чем к одному участку прикрепления чувствительной клетки, возможно, объясняет наличие у него такого широкого спектра антимикробной активности (подавление грамположительных и грамотрицательных бактерий). Заявитель знает, что низин (лантибиотик) связывается с липидом ΙΙ, что показано на фиг. 26, где видно, что обработка Ь.8аке1 И8М 20017 ванкомицином не позволила низину прикрепиться к целевому участку липида ΙΙ.

Пептид 8Т48А имеет два гидрофобных участка (фиг. 27), которые могут встраиваться в богатые фосфолипидами клеточные мембраны после того, как имеет место его реакция с рецепторным участком клеточной стенки. Область между двумя гидрофобными участками, а именно между аминокислотой 29 (серин) и аминокислотой 30 (аланин) (фиг. 27), обладает большей гибкостью, чем другие участки структуры, и может выступать в качестве шарнира, позволяя С-концевой половине пептида сгибаться и, таким образом, проникать в богатую фосфолипидами клеточную мембрану. Для проверки этой гипотезы синтезировали два отрезка пептида 8Т48А (фиг. 27), условно обозначаемые как фрагмент 1 и фрагмент 2, на основе последовательности аминокислот, установленной из последовательности ДНК структурного гена.

Ниже видно, что фрагмент 1 состоит из первых 29 аминокислот (от лизина до серина) и оканчивается непосредственно перед шарнирной областью (между серином 29 и аланином 30). Ввели дисульфидный мост (см. изображенную ниже связующую линию), ковалентно связывающий аминокислоты 9 (цистеин) и 14 (цистеин), также изображенные ниже в составе полной последовательности пептида:

ΚΥΥ6Ν6ν5£ΝΚΚ0£8νρνν0ΚΑΙ(3ΙΙ6ΝΝ5·

Дисульфидный мост служит для стабилизации структуры пептида. Фрагмент 1 содержит первый гидрофобный участок, обведенный кружком (шесть аминокислот от 21 до 26, т.е. АЮПС). Данная часть молекулы распознает рецептор на стенке клетки целевого (чувствительного) организма.

Фрагмент 2 содержит последние 13 С-концевых аминокислот второй гидрофобной петли после шарнирной области, а также 11 предшествующих аминокислот непосредственно перед шарнирной областью (между серином и аланином):

Фрагмент 2' ΚΑΙΟΙΙ6ΝΝ£ΑΑΝΡΑΤΟΟΑΑαλνΚ8

Эксперименты по обработке чувствительных клеток двумя упомянутыми фрагментами пептида 8Т48А показали, что для обеспечения антимикробной активности требуются оба фрагмента (сегмента) молекулы. Поэтому разрушение клеточной мембраны представляется возможным лишь после прикрепления Ν-концевой области к рецептору на поверхности клетки.

Прикрепление пептида 8Т48А к полиэтилену (ПЭ).

Проверяли прикрепление пептида 8Т48А к полиэтилену (ПЭ). Полиэтиленовую пленку нарезали на фрагменты размером 5x5 см и в течение 1 ч замачивали в 60% растворе изопропанола и пептида 8Т48А (уровень активности: 102400 УЕ/мл). Фрагменты ПЭ высушивали на воздухе (20 мин при 60°С), после чего анализировали на антимикробную активность с помощью стандартного метода диффузии в агаре. Чашки с высеянными Ь.8аке1 И8М 20017 инкубировали в течение 24 ч при температуре 30°С, а затем проверяли на наличие зон подавления роста.

- 19 017558

Пептид 8Т48А был адсорбирован ПЭ за 60 с, образовав пленку с высокой антимикробной активностью (вокруг фрагмента ПЭ находились крупные зоны подавления). Для определения силы прикрепления полиэтиленовую пленку, покрытую пептидом, замачивали в буфере 8Ό8 (додецилсульфат натрия), а затем электроэлюцией извлекали пептид 8Т48Л из пленки током в 30 мА в течение 2 ч (при комнатной температуре, т.е. около 25°С). Через определенные промежутки времени забирали образцы и проверяли их на антимикробную активность. Концентрации белков определяли по методу Бредфорд. Электроэлюированную пленку проверяли на антимикробную активность с помощью метода диффузии в агаре, как и ранее.

Судя по всему, пептид 8Т48Л прикрепляется к ПЭ пленке очень прочно, практически неотделимо. Высвобождение пептида 8Т48Л с поверхности ПЭ оказалось возможным только после часового воздействия током в 30 мА. В ходе контрольного заражения, где в качестве модели использовали сырое мясо, пептид 8Т48Л, прикрепленный к полиэтиленовой поверхности, предотвратил рост патогенных бактерий (ЫЧспа. ВасШик и 81арЕу1ососси5). Это указывает на возможность применения пептида 8Т48Л в составе раневых повязок для предотвращения или сокращения микробных инфекций, а также в других медицинских и асептических средствах, таких как, например, имплантаты, ушные трубки, катетеры, стомные трубки и мешки, стенты, шовные материалы, а также предметы гигиенического назначения, такие как предметы женской гигиены, контактные линзы, растворы для промывки контактных линз. Благодаря инкапсуляции в полимере антимикробный пептид высвобождается медленно, что увеличивает срок лечебного воздействия на микробную инфекцию. Кроме того, сила сцепления пептида 8Т48Л с ПЭ также указывает на то, что он действует как медленно высвобождающееся антимикробное средство.

Пептид 8Т48Л связывается с несколькими рецепторными участками микробной клетки, чего следует ожидать от антимикробного средства широкого спектра действия. Первая часть пептида 8Т48Л (перед шарнирной областью) связывается с рецептором. Вторая часть (после шарнирной области) имеет гидрофобный участок большего размера и встраивается в клеточную мембрану, нарушая проницаемость клетки, что приводит к ее гибели (это выражается в утечке ДНК и ферментов). Пептид 8Т48Л устойчиво связывается с ПЭ и медленно высвобождается, что делает его пригодным для использования в составе раневых повязок.

Превращение Ейегососсик типбШ 8Т48Л в пробиотик.

Выживаемость ЕЩегососсщ типбН 8Т48Л оценивали с помощью упомянутой компьютеризированной модели желудочно-кишечного тракта. На этой стадии дополнительно оценивали штамм 8Т48Л в качестве пробиотика в искусственных и естественных условиях. Адгезию к слизи и клеткам эпителия изучали в искусственных условиях на клеточных линиях человека. В естественных условиях эксперимент проводили на крысах.

В исследованиях использовали линии кишечных клеток человека из аденокарциномы толстой кишки, содержащие линии клеток Сасо-2, НТ-29 и НТ29-МТХ (клетки, секретирующие слизь). При культивировании в стандартных условиях клеточные линии демонстрируют морфологическую и функциональную дифференциацию, а также характеристики зрелых энтероцитов, такие как поляризация, функциональная щеточная кайма и апикальные кишечные гидролазы.

На адгезию штамма 8Т48Л к клетке-хозяину влияют углеводы клеточной поверхности, белок А НЖК, Асе (адгезин к коллагену от энтерококков) белок и субстанция агрегации (А8), относящиеся к патогенности. А8-адгезин, который опосредует образование клеточных слипаний, обеспечивая высокоэффективный перенос плазмиды половых феромонов, кодирующей А8.

В рамках данного эксперимента штамм 8Т48А проверяли на наличие признаков вирулентности, активность гидролазы солей желчных кислот, а также способность к адгезии с линией человеческих энтероцитоподобных клеток Сасо-2, конкурентное исключение при адгезии с клеточной линией Сасо-2, а также в искусственных условиях - в модели желудочно-кишечного тракта (ЖКТ). Кроме того, определяли гидрофобность клеточной поверхности 8Т48А.

Факторы вирулентности.

С помощью экспериментов в искусственных условиях и/или ПЦР скрининга проверяли присутствие таких факторов вирулентности, как гены устойчивости к ванкомицину (УапА/УапВ/УапС1/УапС2/УаиС3), образования желатиназы (Се1), субстанции агрегации (А8), адгезина к коллагену от энтерококков (Асе), поверхностного протеина энтерококков (Екр), гемолизина/бактериоцина (Су1) и нецитолитического β-гемолизина. ДНК извлекали из Е.типФи 8Т4 стандартными методами. Для амплификации упомянутых генов использовали ранее описанные праймеры. Результаты приведены в табл. 14.

- 20 017558

Таблица 14

	\/ап А	\/ап В	Уап С1/2/ 3	<Эе!	Е1а- А1т
ЗТ4 ЗА

Е1а- Αίε	А8	Асе	Су1	Еар	Νοη -су1
			+		+

УапА/УапВ: устойчивость к ванкомицину;

Се1: образование желатиназы;

ЕГаАГт: антиген эндокардита Е.Гаесшт;

ЕГаАГз: антиген эндокардита Е.ГаесаНз;

Аз: субстанция агрегации;

Асе: адгезин к коллагену от Е.Гаесайз;

Су1: цитолизин (активность β-гемолизина); Езр: поверхностный протеин энтерококков;

Ыоп-Су1: нецитолитический β-гемолизин III.

Образование субстанции агрегации (А8).

Образование субстанции агрегации А8 изучали в рамках анализа слипания в присутствии полового феромона. Половой феромон получали 18-часовым выращиванием производителя феромона, т.е. Еп(егососси5 ГаесаНк 1Н2-2, в бульоне МК8 при температуре 37°С. Супернатант производителя феромона, Е.Гаесайк ОС1Х, использовали в анализе слипания на пластине микротитратора. В 200 мкл привили (0,5%, об./об.) штамм 8Т48А, а затем под микроскопом исследовали на наличие слипания клеток через 2, 4, 8 и 24 ч. Слипания клеток обнаружено не было.

Образование желатиназы.

Образование желатиназы изучали на агаре МК8, содержащем 30 г желатина на 1 л. За положительную реакцию считали наличие чистой зоны вокруг колоний после 18 ч при температуре 37°С. Образования желатиназы обнаружено не было.

Образование β-гемолизина.

Образование β-гемолизина проверяли по формированию чистых зон вокруг колоний на чашках с кровяным агаром. Для приготовления чашек с кровяным агаром использовали колумбийскую основу кровяного агара с 5% крови барана. Образования β-гемолизина обнаружено не было.

Очевидно, что заявитель продемонстрировал отсутствие в штамме 8Т48А генов, кодирующих устойчивость к ванкомицину, образование желатиназы, образование антигена эндокардита, формирование клеточных скоплений, адгезию к коллагену и/или образование поверхностного протеина. Были обнаружены гены, кодирующие активность β-гемолизина и нецитолитического β-гемолизина III. Однако последние два гена не выражены (не наблюдалось гемолитической активности на чашках с кровяным агаром - см. ниже).

Определение гидролитической активности солей желчных кислот.

Для проверки штамма 8Т48А на гидролитическую активность солей желчных кислот 10 мкл ночной культуры нанесли на чашки с МК8 агаром, дополненным 0,5% (вес./об.) соли натрия тауродезоксихолевой кислоты и 0,37 г/л СаС1₂. Чашки инкубировали в анаэростате в течение 72 ч при температуре 37°С. Формирование зон преципитации принималось за положительный результат проверки на гидролитическую активность солей желчных кислот.

Гидролитической активности солей желчных кислот у штамма 8Т48А не наблюдалось. Гидролитическая активность солей желчных кислот может способствовать устойчивости молочнокислых бактерий к токсичности конъюгированных солей желчной кислоты в двенадцатиперстной кишке. Однако принято считать, что гидролитическая активность солей желчных кислот и устойчивость к желчным солям никак между собой не связаны.

Определение гидрофобности поверхности клеток.

Ночную культуру Е.ншпбЫ 8Т48А дважды промыли раствором Рингера '/.·ι крепости, а затем определили ОП_580нм. Добавили равные объемы взвеси и н-гексадекана, перемешивая в течение 2 мин. На разделение фаз отвели 30 мин при комнатной температуре, после чего отделили 1 мл водной фазы и определили ОП580нм. Две оценки ОП580нм усреднили и полученное значение использовали для расчета гидрофобности:

% гидрофобности = [(ОП_580нм показание 1 - ОП_580нм показание2)/ОП_580нм показание 1]х 100.

Из результатов, приведенных на фиг. 28, очевидно отсутствие признаков гидрофобности у штамма 8Т48А. Соответственно, клетки не приклеиваются к поверхностям ЖКТ перманентно. Они свободно передвигаются в кишечнике (как планктонные клетки), что дополнительно увеличивает полезность штамма в качестве пробиотика.

- 21 017558

Адгезия Е.тиибШ 8Т48А и Ык1епа топосуЮдепек к клеточным линиям Сасо-2.

Для достижения слияния клетки Сасо-2 (Н1дйуе1б Вю1одюа1 8аеисек) высеивали в концентрации 5х10⁵ клеток на лунку. Для определения адгезии в лунки добавляли 100 мкл бактериальной взвеси (1х 10⁵ КОЕ/мл штамма 8Т48А и 1х10³ КОЕ/мл Ь.тоиосуЮдеиек). После 2-часовой инкубации при температуре 37°С клеточные линии дважды промыли буфером ФСБ. Бактериальные клетки подвергли лизису посредством Тритона Х-100 и высеяли в чашки с агаром МК8 и агаром с сердечно-мозговой вытяжкой соответственно. При расчете адгезии исходили из начального количества жизнеспособных клеток и из количества клеточных лизатов.

Для определения конкурентного исключения штамма 8Т48А и Ык1епа топосу1одеиек прививали 100 мкл каждого из штаммов в клеточный монослой. После 2-часовой инкубации клетки лизировали и высевали в среды, специфические для энтерококков и листерий соответственно.

Монослои клеток Сасо-2 подготавливали на покровных стеклах в 12-луночных чашках для тканевых культур. В лунки добавляли взвесь клеток 8Т48А. После 2-часового периода адгезии клеточные линии дважды промывали буфером ФСБ, фиксировали 10% формалином и проводили окрашивание по Граму. Сцепленные клетки изучали под микроскопом. Результаты приведены в табл. 15 и 16.

Таблица 15

КОЕ/мл	Инокулят ЗТ4	Адгезия ЗТ4	Инокулят /. Мопосу(одепез	Адгезия Е. топосу(одепе$
Эксперимент 1	1 х 10⁶	2х10⁴	1 х Ю⁵	Зх 10²
Эксперимент 2	1 х 10^ь	1 х 10⁴	3 х 10⁴	1 х 10³

Таблица 16

КОЕ/мл	Инокулят 5Т4	Адгезия ЗТ4	Инокулят Е. Мопосу^одепез	Адгезия Е. топосу(одепе8
Эксперимент 1	1 х 10^в	8 х 10³	1 х 10^ъ	4x10’
Эксперимент 2	1 х10^в	1 х 10⁴	ЗхЮ⁴	ЗхЮ³

Из результатов, приведенных в табл. 15 и 16, ясно, что клетки Е.типбЫ 8Т48А предотвратили адгезию листерий к клеткам Сасо-2 и успешно конкурировали с листериями за участки распознавания линии человеческих клеток. Таким образом, штамм 8Т48А способен вытеснять листерии.

Выживание в искусственных условиях (модель желудочно-кишечного тракта ЖКТ) Ь.МоиосуФдеиек при стимуляции 8Т48А.

Оценивали антимикробную активность 8Т48А в отношении Ь.тоиосуФдеиек в искусственной среде - желудочно-кишечной модели. 8Т48А привили в изображающий желудок сосуд согласно вышеописанной процедуре. Ь.тоиосуФдеиек (1х10⁴) привили в сосуд ЖКТ, изображающий двенадцатиперстную кишку. Затем из каждого сосуда взяли образцы и высеяли их в среды, специфические для энтерококков и листерий соответственно. В качестве контроля в ЖКМ прививали только Ь.тоиосуФдеиек.

Стимулирование Ь.тоиосуФдеиек штаммом 8Т48А в искусственных условиях модели ЖКТ показало, что 8Т4 оказывает антимикробное воздействие на Ь.тоиосуФдеиек (см. графики). Темп роста в тонкой кишке снизился с 8х10⁴ до 2х10⁴, а уровень Ь.топосуЮдепек в подвздошной кишке был на 1х10¹ КОЕ/мл ниже по сравнению с контролем (см. фиг. 29).

Оценка (в естественных условиях) безопасности, бактериальной транслокации, выживаемости и иммуномодуляционных способностей Е.типФи 8Т48А при пероральном приеме: сравнение с препаратом Лактовита.

Материалы и процедуры.

Животные.

самцов крыс Уистара массой тела 318-335 г поместили в пластиковые клетки группами по пять особей, при 12-часовом цикле день/ночь и контролируемых условиях окружающей среды (температура 20±3°С). Животные получали стандартный рацион питания, а также в неограниченном количестве получали воду, обработанную в автоклаве, очищенную методом обратного осмоса и либо дополненную пробиотиком, либо нет.

Бактериальные штаммы и пробиотик.

Штамм 8Т48А в течение 18 ч культивировали в бульоне МК8 при температуре 30°С; оптическую плотность доводили до 1,8 при 600 нм. Клетки собирали центрифугированием и промывали в 20 мМ фосфатного буфера (рН 7,5). Промытые клетки перерастворяли в 100 мМ сахарозы, замораживали в жидком азоте и оставляли сушиться в вакууме на ночь. Для определения значения КОЕ/мл заданную массу клеток растворяли в 1 мл фосфатного буфера и наносили полученную посевную взвесь на твердую среду МК8. Штамм 8Т48А добавляли в питьевую воду в концентрации около 2х 10⁸ КОЕ/мл.

Вскрыли три капсулы, содержащие пробиотик с коммерческим названием Лактовита, и добавили их содержимое в каждую бутылку с питьевой водой. Полученная таким образом концентрация составила около 3х10⁵ КОЕ/мл.

- 22 017558

План эксперимента.

Проводили два отдельных исследования. В каждом из них 10 крыс случайным образом поделили на две группы, по пять животных в каждой. Одна группа выступала в качестве контрольной, и крысы этой группы получали воду без добавок; крысы второй группы получали воду, в которую были добавлены либо капсулы Лактовита, либо лиофилизированный штамм 8Т48А. Таким образом, всего каждая крыса получила за период проведения исследований 9,89х10^п КОЕ штамма 8Т4 либо 3,1х10⁹ КОЕ препарата Лактовита. 3а крысами велось ежедневное наблюдение, отслеживались любые отклонения в поведении или действиях, а также общее состояние здоровья, в том числе взъерошенная шерсть, сгорбленное положение тела, неустойчивые движения, дрожь, тряска, кашель, затрудненное дыхание, цвет конечностей. Активность отслеживали согласно трехступенчатой шкале: 1 = ленивые, медленные движения; 2 = средний темп; 3 = активные, рыскающие движения. Ежедневно замеряли живой вес и объем потребляемой воды. Исследования штамма 8Т48А продолжались в течение 50 дней, а исследования Лактовиты - в течение 108 дней; результаты приведены в табл. 17.

Таблица 17

	Контроль	8Т4	Контроль	Лактовит
Прирост (г)	144 (7.22)	150.60 (9.34)	255.2 (21.83)	246 (44.42)
Прирост (%)	69.46 (1.10)	69.19 (1.05)	56.04 (2.59)	57.21 (5.60)

Активность β-глюкуронидазы.

На ночь крыс размещали в клетках по одному согласно установленному графику забора образцов и брали 24-часовые образцы экскрементов для определения числа колоний бактерий и активности β-глюкуронидазы. Образцы экскрементов гомогенизировали в 20 мМ фосфатного буфера в концентрации 100 мг экскрементов на 1 мл буфера. До анализа образцы хранили при температуре -20°С. Образцы экскрементов осаждали центрифугированием и перерастворяли в 1 мл экстрагирующего буфера для β-глюкуронидазы (50 мМ ЫаНРО₄, 5 мМ ОТТ (дитиотреитола), 1 мМ ЭДТА, 0,1% Тритона Х-100), перемешивали и инкубировали при температуре 22°С в течение 10 мин. На ночь образцы замораживали при температуре -20°С, а затем размораживали перед определением активности β-глюкуронидазы. Для оценки активности β-глюкуронидазы 100 мкл обработанной взвеси экскрементов инкубировали в 900 мкл реакционного буфера (содержащего 1 мМ р-нитрофенил глюкурониды) при температуре 37°С в течение 2 ч. Для прекращения реакции добавляли 2,5 мл 1 М триса, рН 10,4. Оптическую плотность определяли при 415 нм, а затем строили калибровочную кривую, используя следующие значения концентрации р-нитрофенила: 0,1, 0,2, 0,5, 1 и 10 мМ.

Бактериальная транслокация, токсикологические исследования и гистология.

После кормления крыс проверяемыми штаммами в течение упомянутых промежутков времени животных подвергли эвтаназии путем передозировки пентобарбитон-натрия. Забор образцов крови осуществлялся посредством пункции сердца (правого желудочка). Проверили и отметили макроскопическую анатомию внутренних органов каждой крысы. Взяли образцы тканей печени, селезенки, подвздошной, слепой и толстой кишки. Образцы тканей разместили в кассетах, поместили в 4% раствор формальдегида (ФСБ), а затем погрузили в твердый парафин для проведения гистологического анализа и исследований методом флюоресцентной гибридизации. Срезы подвздошной и толстой кишки заморозили в жидком азоте. Образцы крови нанесли на твердую среду с сердечно-мозговой вытяжкой и инкубировали ночью при температуре 37°С.

Иммуномодуляция.

С помощью реагента тризол из замороженных образцов подвздошной и толстой кишки извлекли полную РНК. Для определения концентрации РНК измеряли оптическую плотность при 260 нм посредством спектрофотометра Ыапобгор после окончания обработки ДНКазы. Каждый образец РНК разбавили до концентрации 42 нг/мкл. 5 мкг каждого образца (в сумме) в трех экземплярах перенесли на нейлоновую мембрану посредством слот-блот прибора. Затем мембрану проверяли ДНК-зондом фактора некроза опухолей (ΊΝΕ), интерферона γ (ΙΕΝ) или β-актина, который амплифицировали из геномного ДНК крыс и помечали дигоксигенином. Ночью мембрану снимали на рентгеновскую пленку, которую затем проявляли.

Результаты.

Общее состояние здоровья и прибавка в весе.

За весь период проведения исследований не было отмечено изменений в поведении или активности крыс, также отсутствовали заметные различия между экспериментальными и контрольными группами. Не было случаев заболеваний или гибели животных в связи с лечением.

Активность β-глюкуронидазы.

Известно, что бактериальные ферменты, в том числе β-глюкуронидаза, связаны с образованием мутагенов, канцерогенов и опухолевых активаторов из предшественников, имеющихся в желудочнокишечном тракте, и их присутствие может указывать на токсичность бактериальных штаммов, что позволяет использовать их для определения безопасности потенциальных пробиотиков. Взвеси штаммов

- 23 017558

БТ4БА и препарата Лактовита не обнаружили активности β-глюкуронидазы в искусственных условиях (данные не приведены). Однако в пробах экскрементов крыс, которые потребляли взвесь препарата Лактовита, обнаружилась повышенная активность β-глюкуронидазы по сравнению с крысами из контрольной группы (табл. 18А). Кроме того, у животных из контрольной группы на 107 день исследования активность была ниже, чем на 56 день, тогда как активность экспериментальных животных на 107 день немного повысилась по сравнению с 56 днем. Крысы, получавшие добавку с БТ4, показали более высокий уровень активности β-глюкуронидазы по сравнению с контрольными группами (табл. 18Б); тем не менее, активность в конце исследования была все же ниже, чем в его первый день. Животные контрольной группы также продемонстрировали снижение уровня активности в конце исследования по сравнению с его началом.

Таблица18А

	День 56	День 77	День 107
Лактовит	6.58 (0.34)	7.49 (0.23)	7.88 (0.36)
Контроль	7.52 (0.26)	8.17 (0.08)	6.70 (0.32)

Таблица 18Б

	День 0	День 14	День 30	День 50
8Т4	6.43 (0.52)	1.78 (0.45)	5.25 (0.57)	5.14 (0.83)
Контроль	5.78 (0.50)	2.40 (0.76)	4.02 (0.62)	2.68 (0.15)

Ни в одной группе животных не было отмечено бактериемии. При макроскопическом исследовании внутренних органов обнаружилось, что крысы, получавшие штамм БТ4БА, имели значительно более выраженные кишечные лимфатические узлы, чем крысы из контрольной группы. У контрольных крыс обнаружить кишечные лимфатические узлы было практически невозможно. Селезенка у крыс из контрольной группы была уже, а мышечная масса и абдоминальный жир меньше, чем у крыс из экспериментальной группы. У животных, получавших препарат Лактовита, кишечные лимфатические узлы были менее выражены, а селезенка меньше, чем у животных контрольной группы.

Лимфоциты попадают в селезенку и способствуют иммунным ответам в отношении антигенов крови. Увеличение селезенки может свидетельствовать о возросшей активности иммунной системы. Также есть связь с выраженными кишечными лимфатическими узлами. Они также связаны с работой иммунитета и могут увеличиваться в результате воспаления или инфекции. Такое увеличение говорит о том, что кишечные лимфатические узлы должным образом выполняют свою задачу. Следовательно, штамм БТ4БА может выступать в качестве стимулятора иммунитета. У крыс, получавших препарат Лактовита, селезенка была меньше, а кишечные лимфатические узлы менее выражены, чем у крыс из контрольной группы. Это указывает на то, что препарат Лактовита не стимулирует иммунный ответ. Однако у крыс из контрольной группы кишечные лимфатические узлы и селезенка были увеличены, и не было отмечено симптомов заболеваний в отсутствие иммунных стимуляторов.

Иммуномодуляция.

Исследования по гибридизации с нозерн-блоттингом не выявили экспрессии цитокинов (ТИР или ΙΡΝ) ни в экспериментальной группе БТ4БА, ни в контрольной группе. Обнаружили положительные сигналы приблизительно такой же интенсивности, как при зондировании РНК β-актин ДНК-зондом, что говорит о наличии РНК.

Цитокины - секретируемые протеины, которые влияют на рост клеток, воспаления, иммунитет, дифференциацию и репарации. Часто для достижения требуемых эффектов требуется всего лишь фемтомолярная концентрация цитокинов. Как правило, цитокины действуют в совокупности с рецепторами на поверхности клеток, внося изменения в паттерн РНК и синтез белка. В связи с очень низкой концентрацией цитокинов, возможно, более целесообразным будет определение экспрессии дополнительных генов, на которые влияют эти протеины.

Приведенные здесь результаты показывают, что ни один из проверенных пробиотиков не оказывает отрицательного воздействия на общее состояние здоровья самцов крыс Уистара.

Таким образом, штамм БТ4БА не содержит генов, кодирующих устойчивость к ванкомицину. Были обнаружены гены, кодирующие активность β-гемолизина и нецитолитический β-гемолизин III, однако они представляют собой молчащие (невыраженные) гены. В штамме БТ4БА отсутствует активность гидролазы солей желчных кислот. Это указывает на повышенную эффективность штамма в нижних отделах желудочно-кишечного тракта (подвздошная и толстая кишка). Приведенные ранее данные указывают, что штамм Е.типбЫ БТ4БА свободно передвигается по желудочно-кишечному тракту и предотвращает адгезию листерий к клеткам Сасо-2, а также успешно конкурирует с листериями за связывание с рецепторами человеческих клеток. Штамм БТ4БА оказал антимикробное воздействие на Б.шопосуЮдепез при проведении исследований в модели желудочно-кишечного тракта (ЖКМ). Штамм БТ4БА нетоксичен, что доказали эксперименты на крысах. Не было случаев заболеваний или смертельных исходов, связан

- 24 017558 ных с лечением. Штамм 8Т48А также показал лучшие результаты по сравнению с препаратом Лактовита, так как у крыс, получавших препарат Лактовита, наблюдалось увеличение активности β-глюкуронидазы; следовательно, штамм 8Т48А стимулирует иммунный ответ у крыс. У крыс, получавших препарат Лактовита, отмечалось уменьшение селезенки и менее выраженные кишечные лимфатические узлы по сравнению с крысами из контрольной группы, что говорит о том, что Лактовита не стимулирует иммунных реакций.

Выше было показано, что пептид 8Т48А подавляет рост различных бактерий, а максимальное образование пептида 8Т48А (51200 УЕ/мл) было зафиксировано после 20 ч выращивания в бульоне МК8 (компания Вю1аЬ) и сохранялось во время брожения.

18-часовую культуру штамма 8Т48А привили (2%, об./об., ОПб00нм=2,0) в бульон МК8 (компания Вю1аЬ) и фильтрованный бульон МК8 соответственно. Бульон МК8 (компания Вю1аЬ) фильтровали с помощью системы МтИап™ (компания МИИроге, Вю8с1епсек 1п1етаИопа1), оборудованной нитроцеллюлозными мембранами с размером пор 6000 -8000 Да. Затем фильтрат МК8 (МК8Г), содержащий протеины размером менее 8000 Да, обработали в автоклаве, после чего произвели прививку согласно вышеописанной процедуре. Инкубацию в бульонах МК8 и МК8Г производили при температуре 30 и 37^ОС, без встряхивания, в течение 29 ч. Активность пептида 8Т48А определяли каждые 2 ч.

Очистка пептида 8Т48А.

В 1 л МК8Г прививали Еп1егососсик типЛи 8Т48А (ОП₆00нм=1,8), а затем инкубировали в течение 24 ч при температуре 30ОС. Клетки собирали центрифугированием (8000 об/мин, 4ОС, 15 мин), бесклеточный супернатант инкубировали при температуре 80ОС в течение 10 мин. При температуре 4ОС в бесклеточный супернатант осторожно добавляли сульфат аммония до уровня насыщения в 60%. После 4 ч медленного помешивания осадок собирали центрифугированием (20000 об/мин, 1 ч, 4ОС). Остаток перерастворяли в одной десятой объема 25 мМ ацетата аммония (рН 6,5) и обессоливали на дистиллированной воде, очищенной на системе М11ВД, с помощью диализной мембраны с ΜΨΌΘ=1,0 кДа 8рес1та/Рог (компания 8рес1гит 1пс., штат Калифорния, США). Последующее разделение производили посредством катионообменной хроматографии в колонке 1 мл Кекоигсе 8 (компания АтегкЬат Вюкс1епсек) с помощью хроматографа АКТАрипГег (компания АтегкГат) согласно вышеописанной процедуре.

В табл. 19 приведены уровни активности пептида 8Т48А после каждой ступени очистки.

Таблица 19

Образец	Активность (УЕ/мл)	Суммарный белок (рг/мл)	Специфическая активность (УЕ/рг протеина)	Урожай (%)	Коэффициент очистки
бесклеточный супернатант (450 мл)	12800	10,77	1188,49	100	1
Осадок сульфата аммония (45 мл)	102400	82,31	1244,08	80	1,1
Диализат (45 мл)	102400	35,77	2862,73	80	2,4

Активные фракции, собранные из АКТАрипГег, соответствовали пику 8Т48А и образовывали пептид из 42 аминокислот, что соответствует ожидаемому размеру пептида 8Т48А.

Изоэлектрическое фокусирование пептида 8Т48А.

Изоэлектрическое фокусирование пептида 8Т48А проводили посредством аппарата электрофокусирования Ко1оГог® (компания Вю-Каб, г. Геркулес, штат Калифорния, США). 1 л бесклеточного супернатанта, полученного из культивированного в МК8Г штамма 8Т48А и подготовленного согласно вышеописанной процедуре, подвергли лиофилизации, а затем перерастворили в 50 мл стерильной дистиллированной воды с амфолитами (диапазон рН от 3 до 10, компания Вю-Каб), следуя инструкциям производителя. В течение 5 ч применяли постоянный ток 12 Вт при температуре 8ОС. После разделения небольшое количество от каждой собранной фракции довели до рН 7,0 посредством 3н. ЫаОН или 3н. НС1 и проверили на антимикробную активность в отношении Гас1оЬасШик саке1 ЬН8. Фракции, давшие положительный результат, объединяли, перерастворяли в деионизированной воде до достижения общего объема в 50 мл, снова подвергали электрофокусированию, собирали фракции и проверяли их на антимикробную активность. Образцы хранили при температуре -20ОС.

- 25 017558

Снижение затрат на среду для культивации является важной частью выбора оптимальных сред. Для снижения затрат можно использовать промышленные среды в качестве источника углерода и/или азота. Часто в составе сред для роста используют кукурузный ликер (С8Ь), сухую сырную сыворотку (С\р) и мелассу. Кукурузный ликер - побочный продукт, получаемый при измельчении кукурузных зерен. В основном он является источником азота, но также содержит и сахар (преимущественно сахарозу), витамины и минералы. Сырная сыворотка, побочный продукт молочного производства, представляет собой наиболее распространенную среду брожения для получения молочной кислоты (ЬА) и в основном состоит из лактозы, белков и солей. Меласса - побочный продукт, в основном состоящий из сахарозы и примесей других минералов.

Культивирование и среды.

Штамм 8Т48А культивировали в бульоне МК.8 (компания Вю1аЬ) и прививали (2% об./об.) в С8Ь, С\р и мелассу соответственно.

Брожение.

Брожение проводили в пробирках, содержащих 10 мл среды. Перед стерилизацией регулировали рН с помощью №1ОН (121°С в течение 15 мин). Концентрация ЫаОН зависела от буферной емкости сред. При прививании использовали 24-часовую культуру (2% об./об.). Периодические брожения проводили в пробирках при температуре 30°С в течение 16 ч, рН 6,5-7,0. Значение рН не контролировали. Оптическую плотность (ОП) измеряли при 600 нм.

Мелассу и С8Ь при 10, 20 и 50 г· л^-1 оценивали в качестве потенциальных сред для получения пептида 8Т48А (табл. 20). Хотя уровень рН мелассы понизился во время брожения (что свидетельствует о росте клеток), в супернатанте не было обнаружено активности пептида 8Т48А, тогда как в среде С8Ь образовался супернатант с активностью до 3200 УЕ^мл^-1 при минимальной концентрации в 20 г· л^-1. Из этих результатов можно сделать вывод, что для образования пептида 8Т48А необходим источник азота (С8Ь).

В последующих экспериментах С\р добавили в список промышленных сред и осуществляли брожение при 10, 20 и 50 г тв. част. л^-1 (табл. 20). В среде С\р отмечали активность пептида 8Т48А до 1600 УЕ>мл^-1 (табл. 20).

Таблица 20

№	Среда	Гл’¹	РН
начало	конец	УЕ мл ¹
1	МР5 контроль		6,50	4,65	12800
2	С8Б	10	6,50	4,38	1600
3	20	6,50	4,41	3200
4	50	6,50	4,56	3200
5	Меласса	10	6,50	4,82	0
6	20	6,50	5,01	0
7	50	6,50	4,97	0
гтв.част.Г¹
8	СУУр	10	6,27	4,14	800
9	20	6,55	4,44	800
10	50	6,47	4,82	1600

Для определения среды, имеющей наибольшее влияние на получение пептида 8Т48А, использовали полный факторный (ΡΡΌ) с С8Ь и С\р в качестве компонентов (табл. 21). ΡΡΌ также мог указать 5 на наличие или отсутствие взаимодействия между питательными веществами.

Таблица 21

2² ΡΡΌ с С8Ь и С\\ р

№	С81	СМр	рН	УЕ мл’¹
Начало	Конец
1	1	1	6,490	5,510	12800
2	-1	-1	6,490	5,100	12800
3	1	1	6,450	5,430	12800
4	-1	-1	6,480	5,090	12800

мкз	6,86	4,53	51200
С81_ 5 г тв.част. Г¹	6,51	5,04	12800
СЗБ 10 г тв.част. Г'	6,47	5,12	12800

- 26 017558

Утилизацию сахара определяли с помощью следующих методов.

Метод оценки общего сахара посредством фенола и серной кислоты.

К 500 мкл разбавленного образца в пробирке добавляли фенол (500 мкл, 5%, об./об.) и концентрированную серную кислоту (2,5 мл). Растворы тщательно перемешали, а затем измерили оптическую плотность при 490 нм (при комнатной температуре). Концентрацию сахара (1 г глюкозы-л^-1) рассчитывали по стандартному графику.

Определение мономерных сахаров с помощью прибора Ωίοηοχ.

Для анализа образцов на мономерные сахара использовали анализатор Όίοηβχ ΌΧ500 с колонкой СатЬоРас РА100. В качестве элюента использовали 250 мМ ΝαΟΗ, Н₂О и 1 М №1ОЛс при расходе 1 мл-мин^-1. Прибор Όίοηβχ был оборудован автодозатором, а объем ввода составлял 10 мкл.

Суммарная концентрация сахара варьировалась от 5 до 10 г тв. част.-л^-1 (обозначения -1 и 1 соответственно). Результаты (эксперимент проводился в двух экземплярах) указывают на то, что концентрация С8Ь и С\Ур не влияет на образование пептида 8Т48А (табл. 21). Уровень активности пептида 8Т48А, полученный в С8Ь при 5 и 10 г тв. част.-л^-1, сходен с уровнем, отмеченным при комбинации С8Ь и С\Ур (табл. 21), и в четыре раза выше, чем было отмечено при 50 г-л^-1 С8Ь (табл. 20). Из приведенных результатов очевидно, что наибольшее влияние на получение пептида 8Т48А оказывает С8Ь.

Оптимизация С8Ь.

Активность пептида 8Т48А, отмеченная в чистом С8Ь при концентрации 10 г тв. част.-л^-1, достигала 12800 УЕ-мл^-1. Однако это намного ниже, чем активность пептида 8Т48А, зафиксированная в среде МК8 (51200 УЕ-мл^-1). В рамках предварительного эксперимента компоненты среды МК8 (за исключением глюкозы) добавляли к 10 и 40 г Т8-л^-1 С8Ь и С\Ур соответственно (табл. 22). В 10 г тв. част.-л^-1 С8Ь с добавками наблюдалось увеличение активности в два раза по сравнению с чистым С8Ь. Однако С8Ь с добавками при 40 г тв. част.-л^-1 с добавками показал низкую активность. Высокая концентрация С8Ь подавляла рост (небольшое уменьшение рН) и, следовательно, образование пептида 8Т48А. Возможно, это связано с наличием в С8Ь подавляющих компонентов. Такой же эксперимент проводили с С\Ур (табл. 22). При увеличении концентрации С\Ур (с 10 до 40 г тв. част.-л^-1) не было отмечено изменений в образовании пептида 8Т48А.

Таблица 22

Среда С8Ь, дополненная компонентами среды МК8

№	Источник углерода	г тв.част.л'¹	ен	УЕ мл'¹
Начало	Конец
1	сзь	10	6,52	5,47	25600
2	40	6,55	6,26	800
3	С\Л/р	10	6,51	4,92	12800
4	40	6,50	5,07	12800

При 10 г тв. част.-л^-1 С8Ь активность полученного пептида 8Т48А была в два раза больше, чем в среде С\Ур (25600 УЕ-мл^-1). Поэтому именно С8Ь был выбран в качестве среды для последующих экспериментов.

Не все компоненты среды МК8 влияли на улучшение получения пептида 8Т48А, и поэтому для выявления значимых компонентов был проведен отсеивающий эксперимент. Отсеивающий эксперимент проводили согласно 2^10-5 дробному факторному плану (РтРИ). Такой метод позволил проверить 10 факторов всего лишь за 32 прохода, вместо обычных 1024 проходов (табл. 23 и 24). Также оказалось возможным проверить компоненты на наличие каких-либо взаимодействий между ними. Результаты проанализировали с помощью АNΟVА (табл. 25).

- 27 017558

Таблица 23

Высокие и низкие концентрации компонентов среды МК8 и С8Ь

	Компонент	Бульон МКЗ	гл'
гл¹	Л	-
А	Специальный пептон	10	10	0
В	Мясная вытяжка	5	5	0
С	Дрожжевой экстракт	5	5	0
ϋ	С5Б	-	6	3
Е	Фосфат калия	2	2	0
Е	Твин80	1	1	0
С	Средний цитрат аммония	2	2	0
н	МдЗО₄	0,1	0,1	0
и	ΜηδΟ₄	0,05	0,05	0
к	Ацетат натрия	5	5	0

Линейная модель, выраженная в кодовых обозначениях:

Активность = -1431,2*В + 956,2*С + 3831,2*Ό - 2781,3*Е - 2243,8*6 -2006,2*К + 7668,8 [Уравнение 2], К² = 0,73.

Получение пептида 8Т48А описали с помощью линейной модели. Хотя линейная модель не позволила точно предсказывать активность (К²=0,73), она все же позволила оценить влияние (положительное или отрицательное) компонентов на ее величину. Мясная вытяжка (В), фосфат калия (Е), средний цитрат аммония (6) и ацетат натрия (К) в линейной модели имели отрицательные коэффициенты (см. уравнение 2), т.е. уменьшали отклик. Это отражает их негативное влияние на образование пептида 8Т48А. Следовательно, только дрожжевой экстракт (УЕ) (С) и С8Ь (Ό) способствуют росту образования пептида 8Т48А.

Таблица 24 План 2^10-5 ЕгЕЭ

№	А	в	с	ϋ	Е	Е=АВСО	С=АВСЕ	Η=ΑΒϋΕ	ϋ=ΑΟΟΕ	К=ВСБЕ
1	-1	-1	-1	-1	-1	1	1	1	1	1
2	1	-1	-1	-1	-1	-1	-1	-1	-1	1
3	-1	1	-1	-1	-1	-1	-1	-1	1	-1
4	1	1	-1	-1	-1	1	1	1	-1	-1
5	-1	-1	1	-1	-1	-1	-1	1	-1	-1
6	1	-1	1	-1	-1	1	1	-1	1	-1
7	-1	1	1	-1	-1	1	1	-1	-1	1
8	1	1	1	-1	-1	-1	-1	1	1	1
9	-1	-1	-1	1	-1	-1	1	-1	-1	-1
10	1	-1	-1	1	-1	1	-1	1	1	-1
11	-1	1	-1	1	-1	1	-1	1	-1	1
12	1	1	-1	1	-1	-1	1	-1	1	1
13	-1	-1	1	1	-1	1	-1	-1	1	1
14	1	-1	1	1	-1	-1	1	1	-1	1
15	-1	1	1	1	-1	-1	1	1	1	-1
16	1	1	1	1	-1	1	-1	-1	-1	-1
17	-1	-1	-1	-1	1	1	-1	-1	-1	-1
13	1	-1	-1	-1	1	-1	1	1	1	-1
19	-1	1	-1	-1	1	-1	1	1	-1	1
20	1	1	-1	-1	1	1	-1	-1	1	1
21	-1	-1	1	-1	1	-1	1	-1	1	1
22	1	-1	1	-1	1	1	-1	1	-1	1
23	-1	1	1	-1	1	1	-1	1	1	-1
24	1	1	1	-1	1	-1	1	-1	-1	-1
25	-1	-1	-1	1	1	-1	-1	1	1	1
26	1	-1	-1	1	1	1	1	-1	-1	1
27	-1	1	-1	1	1	1	1	-1	1	-1
28	1	1	-1	1	1	-1	-1	1	-1	-1
29	-1	-1	1	1	1	1	1	1	-1	-1
30	1	-1	1	1	1	-1	-1	-1	1	-1
31	-1	1	1	1	1	-1	-1	-1	-1	1
3?	1	1	1	1	1	1	1	1	1	1

- 28 017558

Таблица 25 Анализ таблицы вариаций для плана 2^10-5 ΕτΕΌ

Отклик	Активность (УЕ мл'¹
Компонент	ϋί	Значение Е	Рг(>Е)
А	1	0,950	0,334
В	1	8,858	0,004
С	1	3,954	0,052
ϋ	1	63,474	1,435е-10
Е	1	33,450	4,221е-0,7
Е	1	0,162	0,689
6	1	21,770	2,191е-0,5
Н	1	0,207	0,651
ύ	1	0,008	0,928
К	1	17,405	0.000
Воспроизводимость	1	1,338	0,253
Показатель статистической ошибки	52
Коды значимости 0 ”'0,001 ’0,01 *'0,05 '0.1 '1

Концентрации С8Ь и УЕ установили посредством 2² ΕΕΌ (табл. 26). Применение метода критических разбавлений для определения активности пептида 8Τ48Α не дало точных результатов. Таким образом, не получилось соответствовать модели, связывающей концентрации С8Ь и УЕ с уровнем активности. Для установления концентраций компонентов использовали результаты экспериментов. Из табл. 26 видно, что при использовании низких или высоких концентраций С8Ь и УЕ не было выраженного эффекта. В качестве наилучшего варианта выбрали среднее значение - композицию из С8Ь 7,5 г тв. част.-л^-1и УЕ 6,5 г-л^-1.

	УЕ мл^-1
№	С		Репл.1	Репл.2
1	-1	-1	25600	25600
2	-1	1	25600	25600
3	1	-1	36204	12800
4	1	1	25600	36204
5	0	0	25600	25600
6	0	0	25600	36204
7	0	0	51200	25600

Таблица 26

План 2² ΕΕΌ с 3 центральными точками для определения концентраций С8Ь и УЕ

Компонент	Гл’¹
1	0	-1
С	С51_	10	6,5	3
ϋ	ΥΕ	10	7,5	5

На фиг. 30 показана кривая роста в оптимальной среде. Среда на основе С8Ь и среда МК8 показали сходную динамику роста.

Различия между партиями.

Состав С8Ь может изменяться ежедневно, так как он представляет собой побочный продукт производства. Различия в составе могут в значительной степени влиять на результат. Для этого провели те же самые эксперименты на второй партии С8Ь. В этот раз анализ ΑΝΟνΑ выявил УЕ, С8Ь, Твин 80, Ми8О₄и ацетат натрия в качестве компонентов, которые оказывают наибольшее влияние на образование бактериоцена (Р<0,1). Дальнейшая оптимизация показала, что Ми8О₄ не оказывал заметного влияния, а ацетат натрия уменьшал активность.

Итоговая среда состояла из следующих трех компонентов: УЕ (С), С8Ь (Ό) и Твин 80 (Ε). Неудивительно, что дрожжевой экстракт снова оказался в числе значимых компонентов. Твин 80 обладает эмульгирующими свойствами. Окончательные концентрации, установленные согласно плану 2³ ΕΕΌ, составили: УЕ 7,5 г-л^-1, С8Ь 10 г-л^-1 и Твин 80 2 г-л^-1.

Ограничители роста.

До и после брожения измеряли сахаристость среды С8Ь. В начале брожения концентрация С8Ь составляла 7,5 г тв. част.-л^-1. Основными присутствующими мономерными сахарами были глюкоза и фруктоза, с суммарной концентрацией 3,883 г-л^-1. Следовательно, лишь 51,8% суммарного количества сахара были способны к брожению, и во время брожения был усвоен не весь сахар. В конце брожения (постоянная ОП) значение рН составляло 4,6, а процент остаточных сахаров равнялся 8,8%. Рост ограничивался низким значением рН, а не недостатком азота, минералов, витаминов или каких-либо других питатель

- 29 017558 ных веществ; в табл. 27 показано потребление углерода во время брожения. Таблица 27 Потребление углерода во время брожения

Время	Глюкоза	Фруктоза	Общий сахар	% Сброженного сахара
[ч]	[г/л]	[г/л]	[г/л]
0	1,747	2,136	3,883	0,0
10	0,391	0,899	1,290	66,8
19	0,041	0,301	0,342	91,2

Таким образом. очевидно. что С8Ь. дополненный УЕ. может достигать таких же высоких показателей образования пептида 8Т48А. как и коммерческий МК8 бульон. Преимуществом такой потенциальной замены является значительное снижение расходов на обеспечение среды для культивации. С8Ь выбрали в качестве питательной среды для промышленного изготовления пептида 8Т48А.

Еп1егососси8 шипбШ 8Т48А как пробиотик.

Важным критерием. рассматриваемым при выборе пробиотических штаммов. является адгезия к клеткам эпителия. Пробиотические бактерии также могут конкурировать с патогенными бактериями за участки адгезии. В качестве модели (в искусственных условиях). позволяющей изучить способности Е.типб1й 8Т48А к адгезии и конкурентному исключению по отношению к эпителиальным клеткам. использовали клетки Сасо-2. происходящие из аденокарциномы толстой кишки человека.

Результаты выражали как процент адгезии по сравнению с инокулятом. Как Е.типб1й 8Т48А. так и Ь.топосу1о§епе8 8сой А оказались способными к адгезии и продемонстрировали 5-процентную адгезию к клеткам Сасо-2. При инкубации в течение всего лишь 1 ч процент адгезии Е.типб1й 8Т48А снизился до 1%. Питательные вещества находятся в тонкой кишке в течение 2 ч. что обеспечивает достаточно времени для адгезии Е.типб1й 8Т4 к эпителиальным клеткам. Однако штамм Е’.типсИи 8Т48А не оказывал влияния на адгезию Ь.топосу1о§епе8 8сой А. независимо от того. когда добавляли штамм - до. во время или после инкубации с патогеном. В тестах на исключение и замещение Ь.топосу1о§епе8 8сой А продемонстрировал 5-процентную адгезию. Тест на конкуренцию не выявил конкуренции за адгезию. так как процент адгезии остался таким же. как и в контроле. Возможно. это объясняется тем. что Е.типб1й 8Т48А и Ь.топосу1о§епе8 8сой А связываются с разными рецепторами эпителиальной клетки. Следовательно. Е.типб1й 8Т48А и Ь.топосу1о§епе8 8сой А не конкурируют за связывание с одними и теми же рецепторами.

Устойчивость Е.типб1й 8Т4 к антибиотикам и противовоспалительным медикаментам.

Е.типб1й 8Т48А продемонстрировал устойчивость к двум антибиотикам (Се£а8уп и Ийп) и нескольким противовоспалительным средствам - Кйеиде81с. Сохйат и Руптеб. Результаты приведены в табл. 28. Следующие антибиотики в наибольшей степени подавляли рост Е.типб1й 8Т48А: Рготохй. С1рабиг. Кох1Ь1бб и Эохтак

Рготохй. Вохта1. Се£а8уп и Ийп не влияли на адгезию клеток 8Т48А к клеткам Сасо-2 по сравнении с контролем. Адгезия уменьшилась на 10% в присутствии С1рабиг. КомЬиск! и 1Ьиде8Йс (сироп) и на 14% при повышенной концентрации Се£а8уп (см. табл. 29).

Таблица 28

Препарат	Штамм 8Т45А
Ибупрофен, 5 мг/мл	++
Аспирин, 5 мг/мл	+
РготохП, 100 мг/мл	++++
С\|рас!иг, 50 мг/мл	+++
СеТазуп, 100 мг/мл	-
Κοχϊόϊάά, 30 мг/мл	+++
Оох1та1, 20 мг/мл	+++
ΟίρΙοχχ, 100 мг/мл	+
υΐΐη, 80 мг/мл	-
РНеидезю, 4 мг/мл	-
СохЛат, 1,5 мг/мл	-
К-Гепак, 5 мг/мл	++
РгеЛат, 3 мг/мл	+
1Ьиде$1С	++
Руптес!	-

- = зоны отсутствуют;

+ = зоны диаметром от 1 до 11 мм;

++ = зоны диаметром от 12 до 16 мм; +++ = зоны диаметром от 17 мм и выше.

- 30 017558

Таблица 29

Препарат	Адгезия штамма ЗТ48А
Инокулят	1 х 10⁷
Контроль	5х10⁴
С\|ра4иг (5 мг/мл)	6х10⁴
Кох1ЬЮс1 (10 мг/мл)	Зх 10³
ΡΐΌΓΠΟΧίΙ (8 мг/мл)	1,25 х 10⁴
ΟοχϊγπθΙ (2 мг/мл)	1 х 10*
СеТазуп (10 мг/мл)	1,2 х 10⁴
Се/азуп (50 мг/мл)	7х 10²
υΐϊη (8 мг/мл)	4х10⁴
υΐιη (40 мг/мл)	3 х 10⁴
1Ьидез11с (сироп) (100 μπ)	6х10³
К-1епак (0,5 мг/л)	Зх 10⁴

Оценка (в естественных условиях) безопасности. токсичности. бактериальной транслокации и живучести. иммуномодуляционных способностей и эффективности клеток Е.типб1и 8Т48А при пероральном введении - сравнение с препаратом Лактовита.

Животные.

самцов крыс Уистара массой тела 150-180 г разместили в пластиковых клетках группами по шесть особей. при 12-часовом цикле день/ночь. в контролируемых условиях окружающей среды (температура 20±3°С). Животные получали стандартный рацион питания в неограниченном количестве.

Бактериальные штаммы и пробиотик.

Штамм Е.типб1и 8Т48А в течение 18 ч культивировали в бульоне МК.8 при температуре 30°С; оптическую плотность доводили до 1.8 при 600 нм. Клетки собирали центрифугированием и промывали в 20 мМ фосфатного буфера (рН 7.5). Промытые клетки перерастворяли в 100 мМ сахарозы. замораживали при -80°С и ночью лиофилизировали. Для определения значения КОЕ/пробирка заданную массу клеток растворяли в 1 мл фосфатного буфера. полученную посевную взвесь нанесли на твердую среду МК8. Для определения значения КОЕ/пробирка заданную массу клеток растворяли в 1 мл фосфатного буфера и полученную посевную взвесь наносили на твердую среду МК8. Лиофилизированные клетки перерастворяли в стерилизованном растворе обезжиренного молока (10%). после чего 2х10⁸ КОЕ штамма 8Т48А вводили посредством желудочного зонда.

Содержимое капсул с препаратом Лактовита высыпали в пробирку и перерастворяли в стерилизованном растворе обезжиренного молока (10%). после чего 2х10⁸ КОЕ вводили посредством желудочного зонда.

Ых1ег1а топосу Юдепех 8со11 А в течение 18 ч культивировали в бульоне с сердечно-мозговой вытяжкой при температуре 37°С. Клетки собирали центрифугированием и промывали в 20 мМ фосфатного буфера (рН 7.5). Промытые клетки перерастворяли в 100 мМ сахарозы. замораживали при -80°С и ночью лиофилизировали. Число КОЕ/пробирка определяли согласно вышеописанной процедуре. Лиофилизированные клетки перерастворяли в стерилизованном растворе обезжиренного молока (10%). после чего 10⁴ КОЕ вводили посредством желудочного зонда.

План эксперимента.

В течение 7 дней подряд две группы животных получали штамм 8Т4 посредством желудочного зонда. две группы получали препарат Лактовита. а оставшиеся две контрольные группы получали воду. На 8 день обе контрольные группы заразили Ых1ет1а топосу1одеиех; кроме того. по одной из каждых двух групп. получавших штамм 8Т48А или препарат Лактовита. также подвергли заражению ^.тоиосуΐодеиех посредством желудочного зонда. При этом животные также получали штамм Е.типб1и 8Т48А. препарат Лактовита или воду. Пробиотик или воду повторно давали на 9 и 10 день. Когда у животных из контрольных групп начали проявляться симптомы заболевания. одной группе ввели штамм Е.пшпбШ 8Т48А посредством желудочного зонда. Затем отслеживали состояние данной группы на признаки облегчения симптомов.

Два раза в день животных осматривали на наличие симптомов листериоза. На 11 день произвели умерщвление животных (за исключением контрольной группы. получающей штамм Е.типб1й 8Т48А). Анализ крови брали из правого желудочка. Клинический анализ крови проводили в патоморфологической лаборатории; образец крови привили в твердую среду с сердечно-мозговой вытяжкой и основу селективного агара для листерий. а затем определяли число КОЕ/мл. После сбора плазмы определяли уровни эндотоксинов и цитокинов (1Ь-6 и ΙΕΝ-α). Печень. селезенку и отделы желудочно-кишечного тракта удалили. законсервировали в формальдегиде. а затем погрузили в парафин.

- 31 017558

Провели гистологический анализ срезов посредством окрашивания гемолизином и эозином. Анализ гемолизином и эозином показал, что пероральное введение штамма 8Т48А не вызывает структурных повреждений печени, селезенки или желудочно-кишечного тракта (см. фиг. 31). Не было отмечено различий между животными, получавшими штамм 8Т48А, и животными, которые получали воду без добавок.

Как описано выше, заявитель обнаружил, что штамм Еп1егососси5 ιηιιπ6ΐίί 8Т48А, изолированный из соевого экстракта, вырабатывает полезный антимикробный пептид, а именно пептид 8Т48А, который является активным в отношении некоторого количества патогенных организмов, например изолятов из инфекций среднего уха и кишечника человека. Преимуществом пептида 8Т48А является отсутствие в нем цитотоксических характеристик. Заявитель отделил штамм Еп1егососси5 ιηιιπ6ΐίί 8Т48А от других штаммов Е^^бй с помощью реакций брожения сахара, нескольких биохимических тестов, по присутствию двух плазмид (р8Т48А1 и р8Т48А2) и по уникальному гену (А6Б8Т48А), кодирующему адгезию к эпителиальным клеткам кишечника и слизи. Пептид 8Т48А очистили и секвенировали; он имеет два больших гидрофобных участка. Заявитель изолировал и секвенировал последовательность нуклеиновых кислот, кодирующую пептид 8Т48А, а также последовательность нуклеиновых кислот, кодирующую переход пептида 8Т48А через клеточную мембрану, обеспечивающий клетке-продуценту иммунитет в отношении собственного пептида. Все последние гены расположены в геноме, так как после излечивания пептида от его плазмид не произошло потери антимикробной активности. Кроме того, трансформация плазмид на штамм Еп1егососси5 ГаесаШ не превратила его в источник пептида 8Т48А, что подтверждает гипотезу о том, что гены не располагаются в плазмидах. Тот факт, что после обработки пептида протеолитическими ферментами он утратил антимикробную активность, подтверждает, что активность присутствовала благодаря структуре пептида, а не белков или углеводов, связанных с молекулой. Поразительно, но пептид оставался активным после 30 мин инкубации в буферах с рН от 2,0 до 12,0, а также после 90 мин при температуре 100°С. Еще более удивительно, что антимикробная активность не была утрачена и после обработки ЭДТА (этилендиаминтетрауксусной кислотой), 8Ό8 (додецилсульфатом натрия), Твином 20, Твином 80 и Тритоном Х-100. Штамм 8Т48А сохраняет жизнеспособность при низких значениях рН (рН 2,5), показывает рост в среде, доведенной до рН от 4,0 до 9,6 в присутствии 6,5% №С1, и устойчив к 1,0% (вес./об.) желчным солям и панкреатическому соку. Рост штамма 8Т48А наблюдается при температуре 10°С (хотя и медленный), а также при 45°С; оптимальной температурой для роста является 37°С. Из глюкозы получается только молочная кислота Ь(+). Упомянутые характеристики штамма, быстрое и стабильное образование пептида 8Т48А даже в стрессовых условиях среды, отсутствие в нем цитотоксических свойств, а также тот факт, что пептид образуется из организма со статусом СКА8 (признанный безопасным) - все это делает данный штамм полезным пробиотиком.

Пептид также может использоваться в качестве антимикробного средства в составе жидкого препарата для местного лечения, например, воспалений среднего уха. Такой жидкий препарат можно применять с помощью аппликатора ушных капель. Также жидкий препарат входит в состав жидкой разновидности пробиотика Еп1егососси5 ти^Ш, которую можно использовать в качестве жидкой пищевой добавки. Кроме того, пептид можно использовать в качестве антимикробного средства в жидкой или аспирированной форме в составе назального спрея для лечения таких заболеваний, как носовые инфекции или синусит. Также пептид может применяться в качестве антимикробного агента, инкапсулированного в составе полимера. Полимер с инкапсулированным в нем пептидом может использоваться в составе препарата для местного лечения инфекций, например кожных, либо может быть встроен в имплантаты или медицинские приборы, такие как, например, ушные трубки, либо он может включаться в состав раневых повязок. Благодаря инкапсуляции антимикробного пептида в полимере, пептид высвобождается медленно, в результате чего увеличивается срок лечебного воздействия на микробную инфекцию. Кроме того, пептид можно применять в качестве антимикробного средства в составе мазей, лосьонов, кремов, которые используются для лечения инфекций. Также пептид может быть использован как антимикробное средство в составе жидких препаратов, например растворов для промывки контактных линз, либо в составе самих линз. Дополнительно пептид может применяться в качестве антимикробного средства в составе упаковочных материалов, например пластмассы, при производстве стерильных упаковочных материалов. В еще одном варианте осуществления изобретения пептид может применяться в составе пробиотика широкого спектра действия Еп1егососси5 типбЫ в виде таблеток или капсул либо в съедобном виде - как конфета или жевательная резинка.

- 32 017558

Перечень последовательностей <110>

Схр1а МеЗрго КеэеагсЪ апс! Όβνβ1ορηι®η5 (РгоргхеЪагу) ЬхтхС.ес1 <120>

РК0ВЮТ1С 5ΤΗΑΤΝ ΑΝΠ

АМТХШСКОВТАЪ ΡΕΡΤΙΌΕ ΟΕΚΙΥΕΏ ТНЕЕЕГКОМ <130>

10511 <160>

<170>

РаРепЫп уегзхоп 3.4 <210>

<211>

<212>

<213>

ΏΝΑ

ЕИТЕКОСОССиЗ

МЦИЛТЦ

3Τ43Α <400>

аасдадсдса ассс <210>

<211>

<212>

<213>

ΏΝΑ

ЕЯТЕКОСОССиЗ

ΜϋΝϋΤΙΧ

8Т45А <400>

дасдддаддЬ д-Ьдъас <210>

<211>

<212>

<213>

ΏΝΑ

ЕИТЕКОСОССиЗ

ΜϋΝΏΤΙΙ

3Τ43Α

Ъдададаадд ЪЪйаадСЪЪС даадаа <210> 4 <211> 21 <212> ϋΝΑ <213> ЕЫТЕКОСОССиЗ ΜΟΝϋΤΙΙ 3Τ43Α <400> 4

5ссасЬдааа ЪссаЪдаа^д а <210> 5 <211> 20 <212> ΏΝΑ <213> ЕЫТЕКОСОССиЗ ΜϋΝϋΤΙΙ ЗТ45А <400> 5

Ьда¹ ддаЪ’ЬЬ садЪддаадС <210> 6 <211> 20 <212> ϋΝΑ <213> ЕытЕкососсиз минош зт43а <400> 6 аЪсЬсЪЪсЬс сд'Ь^ЪааЪсд

- 33 017558

- 34 017558

С1у Азп Азп. Зег А1а А1а Азп Ьеи А1а ΊΊιγ С1у <31у А1а А1а С1у Тгр

40 45

Ьуа Зег

<210> 13 <211> 2025 <212> ΏΝΑ <213> ЕЫТЕВССОССиЗ МЦЫЕТ11 8Т43А
<400> 13 а!дсада!да	1111ааа!аа	1111са11са	1дда111сад	1ддаад1111	аададасИа	60
асЪдааассд	а11с1даадд	1асс1д1дса	11адд1а1ад	11аасдда11	1дс1ааа11а	120
ддаа1ааа11	д!даадсс1а	1заадс1аа1	ад1да1д1а1	ддааадаааа	1дад11саа1	180
1а1сссд1аа	11дс1аа1а1	ад1ааадаа!	аа!саа111с	11са11а11д	1а11д1а1а 1	240
дд191даааа	аададаааН	д11аа1адс1	дассс1дсда	11ддаааа1а	сааадаа!са	300
а!адаааад!	Ъсаасаасаа	а1ддас1дд1	д11а1111ад	11дс1даааа	дас1сс1да1	360
Иссаассса	1ааа1аа1аа	аааааааад^	1111111С11	саа1аад!11	анаааада!	420
саа!а1аааа	ааа11Иа11	дд1да1а11а	1с11са11аа	1аа1аасаа1	1а1аддаа1а	480
с1а1саад!1	аа1а1111ад	аа1111аа1а	даИддИас	11сс1даааа	адасИШа	540
аа1с1а111а	1да1а1саа1	1адс1а1а1с	а1аддса111	11а1аасаад	1а1а111даа	600
аНассадаа	да1а1аа111	адаааадсЪа	ддаоаадаЪд	1адд1адаад	0311113111	660
ааа1а111ад	ааса1а1111	са1111асса	дс11сс1111	111с1аааад	ааааас1дда	720
да1а11д1с1	с1ада1111с!	1да1дс1аа1	аааа11а1ад	аадсШада	1здс111ас1	780
а1аГа1а111	1111ада111	аад!1сад1с	а11д11д1дд	дда11а1а!1	да!саа1а11	840
аа1ааасаа1	ЬаЪ'Ыг.'ЫзааЪ	8809111233911	1с1а11сса1	111а1а1ас1	аа11а1а11а	900
дда1сааа1а	аааааа1дад	1сдаИааас	ддадаадада	1доааасааа	11оаа1ад11	960
да11с1аа11	ИаИдаадд	аНааасдда	а1а1а1ас1а	1аааадсас1	11д1ад1дад	1020
аа1аада11д	1ааа1сааа1	аЪаЪадаадР	11ааа1ааа1	11111да1д1	а!сас1ааад	1080
адаааЬаЦд!	аЪдаНсЪа!	ааНсаааа!	НаааааШ	1дд1Шс1с1	111ааос1од	1140
дс1111д1а1	1а1ддс11дд	1:1109113111:31:	д11а1саа1д	дадаааНас	аа1аддадаа	1200
с1аа1аас11	1саа11са11	81:01:31:3111:1:	НИскасас	с1с1асаааа	1а1аа1ааа1	1260
сЪаааадааа	ааНссаааа	890303891:1:	дсаааЪааЪо	ддсИаасда	1д1аИ11с1	1320
аЬаааЬааЬд	ааааЪааада	саадШаИ	са111ддс1а	аа11аас1да	аааадсаасд	1380
а11аса111д	аааа!д~а1а	ИИадЫа!	1с1ас1ааа1	а1сс1аа!д1	д11ада1аа1	1440

- 35 017558

аЬдадЪ -ЬЪЪ-Ь	сЬсЪассЪдЪ	дад’каааааЪ	а1:аддааЪаа	ааддЪдаЪад	•Ьдд1:дсЪддд	1500
аааЪсаасЬЪ	ЪадсасаасЪ	ЪсЪадсЪдда	ЪЪЪЪасЪсЪс	садаЪааЪдд	аадааЪЬЪдЪ	1560
аЪааа1:дадс	ааааЬаЪ'Ьда	аааЪаЪЪааЪ	адаааадаЪЪ	ЬасдЬаад'Ь'Ь	даЪЪасо^а'Ь	1620
дЪдссЪсаад	ааъсъъъ-Ьаъ	ЪаЪдадЪдда	асъаъ^ааад	асааъъьаъъ	Ъ-ЬЪадд-^-ЬЪа	1680
даас дЪаЪ'Ьс	с'Ьда'Ьдааса	адаасЬсдаа	ааадЪасЪда	аадаЪааФгЬд	Ъ'ЬЪа^ддад'Ь	1740
УаЪаЪСасЪд	сдссЬссЪсЪ		асдЪаЪсЪад	аадааааЪдд	ЪдсдааЪ'ЬЪа	1800
Ьсадд'Ьдд'Ьс	аааадсааад	ааЫхдсЪЪЬа	дсаададЪЬ'Ь	ЬаЪЪа^Ьадд	аа.д'Ьаааа.Ь”	1860
ЪЪаЫ^аЪЬад	аЬдаадаЬас	дадкдсЪсЬа	даЪЪсЪаааа	сЪдаааЪдсЪ	даЪЪЪЪадаа	1920
аааЪ'ЬаЪЪаа	адЬаосоЪаа	ЬаадЪоаа^с	а'ЬЪа^даЪа^	оЪоа£аа11да	ЬаааЪЪааЬа	1980
дасаадидЪд	ааъгааЪсаЪ	ЪдаЪЪЪадас	дааадддаЪъ	аа£аа		2025

<210> 14 <211> 674 <212> РКТ <213> ЕЫТЕКОСОССиЗ ΜϋΝΏΤΙΙ 3Τ43Α <400> 14

МеЪ 1

С1п МеЬ

Не Ьеи 5

Азп

Аз η

Рке Н1з

Зег 10

Тгр

Не Зег

Уа1

С1и 15

Уа1

Ьеи

Ахд

Азр

Ьеи 20

Ткг

С1и

Ткг

Азр

Зег 25

С1и

С1у

Ткг

Суз

А1а 30

Ьеи

С1у

Не

Уа1

Аз η 35

С1у

Рке

А1а

Ьуз

Ьеи 40

С1у

11е

Азп

Суз

С1и 45

А1а

Туг

Ьуз

А1а

Азп 50

Зег

Азр

Уа1

Тгр

Ьуз 55

01и

Аз η

О1и

₽Ье

Азп 60

Туг

Рго

Уа1

11е

А1а 65

Азп

Не

Уа1

ТИг

Азп 70

Азп

121п

Рпе

Ьеи

Н1з 75

Туг

Суз

Не

Уа1

Туг 80

51у

Уа1

Ьуз

С1и 85

Ьуз

Ьеи

Не

А1а 90

Азр

Рго

А1а

Х1е

С1у 95

Ьуз

Туг

Ьуе

С1и

Зег 100

11е

С1и

Ьуз

Рке

Аз η 105

Азп

Ьуз

Тгр

Ткг

С1у 110

Уа1

11е

Ьеи

ν&1

А1а 115

С1и

Ъуз

ТЬ.г

Рго

Азр 120

РЪе

С1п

Рго

Не

Азп 125

Азп

Т11Г

Ьуз

8ег 130

Рке

РЬе

Зег

11е 135

Зег

Ьеи

Ьуз

Азр 140

С1п

Туг

Ьуз

- 36 017558

Не 145

Ьеи

Уа1

Не

Ьеи 150

Зег

Ьеи

11е

Не 155

ТЬг

Не

С1у

Не 160

Ьеи

Зег

Туг

РЬе

Агд

11е

Ьеи

11е

Азр

Тгр

Ьеи

Рго

С1и

165

170

175

Ьуз

Азр

РЬе

Ьеи

Азп

Ьеи

Рке

Мек

11е

Зег

Не

Зег

Туг

Не

С1у

180

185

190

Не

Рк©

Не

ТИг

Зег

11е

РЬе

С1и

Не

ТЪг

Агд

Туг

Азп

Ьеи

С1и

195

200

205

Ьуз

Ьеи

С1у

С1п

Азр

ν₃ι

С1у

Агд

Зег

Т1е

Ьеи

РЬе

Ьуз

Туг

Ьеи

С1и

210

215

220

Н1з

Не

РЬе

11е

Ьеи

Рго

А1а

Зег

РЬе

Зег

Ьуз

Агд

Ьуз

ТЬг

С1у

225

230

235

240

Азр

Не

Уа1

Зег

Агд

РЬе

Зег

Азр

А1а

Азп

Ьуз

Не

11е

С1и

А1а

Ьеи

245

250

255

А1а

Зег

РЬе

ТЬг

Не

Зег

Не

Рке

Ьеи

Азр

Ьеи

Зег

Уа1

11е

νθΐ

260

265

270

Уа1

С1у

Не

Ьеи

Не

Азп

11е

Азп

Ьуз

С1п

Ьеи

РЬе

Ьеи

Не

ТИг

275

280

285

Ьеи

Зег

Не

Рго

РЬе

Туг

11е

Ьеи

11е

Не

Ьеи

С1у

Зег

Азп

Ьуз

290

295

300

Ьуз

Мек

Зег

Агд

Ьеи

Азп

С1у

С1и

Мек

С1п

ТЬг

Азп

Зег

11е

Уа1

305

310

315

320

Азр

Зег

Азп

РЬе

Не

С1и

С1у

Ьеи

Азп

Й1у

Не

Туг

ТЬг

Не

Ьуз

А1а

325

330

335

Ьеи

Суз

Зег

С1и

Азп

Ьуз

Не

ν₃1

Азп

С1п

11е

Туг

Агд

Зег

Ьеи

Азп

340

345

350

Ьуз

РЬе

Азр

Уа1

Зег

Ьеи

Ьуз

Агд

Азп

Мек

Туг

Азр

Зег

Не

355

360

365

С1п

Азп.

Ьеи

Ьуз

Не

Ьеи

Уа1

Зег

Ьеи

ТЬг

Зег

А1а

РЬе

Уа1

Ьеи

3*70

375

380

Тгр

Ьеи

С1у

Зег

Туг

ν&1

Не

Азп

С1у

С1и

11е

Ткг

Не

С1у

С1и

385

390

395

400

- 37 017558

Беи

Не

ТЬг

РЬе

Азп 405

Зег

Беи

Зег

11е

РЬе 410

РЬе

Зег

ТЬг

Рго

Беи 415

61п

Азп

Не

Азп

Беи

С1п

С1и

Буз

РЬе

61п

Буз

А1а

С1п

Уа1

А1а

Азп

420

425

430

Азп

Агд

Беи

АЗП

Азр

ν^Ι

РЬе

Зег

Не

Азп

61и

Азп

Буз

Авр

Буз

435

440

445

РЬе

Не

Н13

Беи

А1а

Буз

Беи

ТЬг

61и

Буз

А1а

ТЬг

11е

ТЬг

РЬе

61и

450

455

460

Агп

Уа1

Туг

РЬе

5ег

Туг

Зег

Ткг

Буз

Туг

Рго

Азп

ν31

Беи

Азр

Азп

465

470

475

480

Ме-Ь

Зег

РЬе

Зег

Беи

Рго

Уа1

Зег

Буз

Азп

Ι1Θ

61у

Не

Буз

61у

Азр

485

490

495

Зег

С1у

А1а

С1у

Буз

Зег

ТЬг

Беи

А1а

С1п

Беи

А1а

61у

РЬе

Туг

500

505

510

Зег

Рго

Азр

Агп

С1у

Агд

11е

Суз

Не

Азп

С1и

С1п

Азп

Не

С1и

Азп

515

520

525

Не

Агп

Агд

Буз

Азр

Беи

Агд

Буз

Беи

Не

ТЬг

Туг

Уа1

Рго

С1п

С1и

530

535

540

Зег

РЬе

Не

Меь

Зег

С1у

ТЬг

Не

Буз

АЗр

Азп

Беи

РЬе

Беи

С1у

Беи

545

550

555

560

61и

Зег

11е

Рго

Азр

61и

61 п

61и

Беи

С1и

Буз

νβΐ

Беи

Буз

Азр

ТЬг

565

570

575

Суз

Беи

Тгр

Зег

Туг

11е

ТЬг

А1а

Рго

Беи

61у

Беи

Азр

ТЬг

Туг

580

585

590

Беи

С1ц

С1и

Агц

С1у

А1а

Азп

Беи

Зег

С1у

61у

61 п

Буз

Й1п

Агд

Не

595

600

605

А1а

Беи

А1а

Агд

ν^ι

Беи

С1у

Зег

Буз

Не

Беи

Азр

510

615

620

61и

А1а

ТЬг

Зег

А1а

Беи

Азр

Зег

Буз

ТЬг

С1и

Беи

Не

Беи

С1и

625

630

635

640

Буз

Беи

Буз

Туг

Рго

Азп

Буз

Зег

Не

Меь

Не

Зег

Н13

Азп

645

650

655

- 38 017558

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

аЪдадЬааЪ'Ь	ЪааадЪддЪ'Ь	Т~с“ддЬдда	дасдаЬсдас	дЪаааааадс	адаадЪдаЪ	60
а^ЪасТ.даа'Ь	ЬаС.Ъада'Ьда	ΐΐ. ЬададаЪа	даЪсЪЪддаа	аЪдааЪсЪсЬ	ЬсдаааадЪа	120
ЬЬа'· дсЬссЬ	аЪсЬЪдаааа	дЪЬдаааааЬ	дааддаасЬЬ	садЪ’ЬссаЬ'Ь	адЪЪС'ЬаадЬ	180
сдЪаЬдааЬа	ЪададаЪаЪс	ЪааЪдсааЪа	аааааадасд	дЪдЪаЪсдЬЬ	ааагдаааа®.	240
сааЪсЬаааа	ааЬЬаааада	асЬсаЬаЪсЪ	а-аСсЬааЬа	ЬЪадаЬаЪдд	аЪаЪЪад	297

МеЪ 1

Зег Азп

Ьеи

Ьуз 5

Тгр

РЬе

Зег

С1у С1у 10

Азр Азр Агд

Агд

Ьуз 15

Ьуз

А1а

С1и

Уа1

Не

ТЬг

С1и

Ьеи

Азр

Ьеи

О1и

Не

Азр

Ьеи

20

25

30

С1у

Азп

С1и

Зег

Ьеи

Агд

Ьуз

Уа1

Ьеи

С1у

Зег

Туг

Ьеи

С1и

Ьуз

Ьеи

35

40

45

Ьуз

Азп

С1и

С1у

ТЬг

Зег

Уа1

Рго

Ьеи

ν31

Ьеи

Зег

Агд

МеЬ

Азп

Не

50

55

60

С1и

11а

Зег

Азп

А1а

Не

Ьуз

Азр

С1у

ν^ι

Зег

Ьеи

Азп

С1и

А$п

65

70

75

80

С1п

Зег

Ьуз

Ьеи

Ьуз

С1и

Ьеи

11е

Зег

Не

Зег

Азп

Не

Агд

Туг

85

90

95

1. Штамм бактерий Е.типбЫ 8Т48А АТСС РТА-7278, способный при брожении в питательной среде, содержащей усвояемые источники углерода, азота и неорганические вещества, продуцировать антибактериальный пептид 8Т48А, имеющий аминокислотную последовательность 8ЕД ΙΌ N0:12 или последовательность, которая более чем на 75% гомологична указанной, в извлекаемом количестве.

Claims

2. Способ получения изолированного антибактериального пептида 8Т48А, имеющего аминокислотную последовательность 8ЕД ΙΌ N0:12 или последовательность, которая более чем на 75% гомологична указанной, согласно которому штамм бактерий Е.типП1и 8Т48А по п.1 культивируют в питательной среде при микроаэрофильных условиях и температуре от 10 до 45ОС до получения извлекаемого количества упомянутого пептида, после чего пептид извлекают, при этом в качестве питательной среды используют один или несколько из перечисленных ниже вариантов: кукурузный ликер; сухая сырная сыворотка; бульон МК8 (Манна-Рогоза); дрожжевой экстракт; меласса.

3. Способ по п.2, дополнительно включающий получение фрагментов указанного пептида, обладающих антибактериальной активностью.

4. Способ лечения бактериальной инфекции в организме животного или человека, на одной из стадий которого инфицированный участок организма человека или животного подвергают воздействию композиции, содержащей терапевтически эффективное количество штамма бактерий Е.типбЫ 8Т48А по п.1.

5. Способ по п.4, в котором указанный штамм используют в концентрации от 10⁶ до 10⁹ КОЕ (колониеобразующих единиц) на 1 мл композиции.

6. Способ лечения бактериальной инфекции в организме животного или человека, на одной из стадий которого инфицированный участок организма человека или животного подвергают воздействию композиции, содержащей терапевтически эффективное количество изолированного антибактериального

- 39 017558 пептида 8Τ48Α или его фрагмента, полученных согласно способу по любому из пп.2, 3.

7. Способ по п.6, в котором указанный пептид или его фрагмент используют в концентрации от 100000 до 300000 УЕ на 1 мл композиции.

8. Способ лечения бактериальной инфекции в организме животного или человека, на одной из стадий которого инфицированный участок организма человека или животного подвергают воздействию композиции, содержащей терапевтически эффективное количество штамма бактерий Е.типбЫ 8Τ48Α по п.1 и изолированного антибактериального пептида 8Τ48Α или его фрагмента, полученных согласно способу по любому из пп.2, 3.

9. Способ по п.8, в котором указанный штамм используют в концентрации от 10⁶ до 10⁹ КОЕ (колониеобразующих единиц) на 1 мл композиции.

10. Способ по п.8, в котором указанный пептид или его фрагмент используют в концентрации от 100000 до 300000 УЕ на 1 мл композиции.

11. Композиция для лечения бактериальной инфекции в организме животного или человека, содержащая штамм бактерий Е.типбЫ 8Τ48Α по п.1, выполненная в виде жидкого препарата, мази, лосьона, крема, геля, жидкого спрея, лиофилизированного порошка, лиофилизированного спрея, жидкости для полоскания рта или горла.

12. Композиция для лечения бактериальной инфекции в организме животного или человека, содержащая изолированный антибактериальный пептид 8Τ48Α или его фрагмент, полученные согласно способу по любому из пп.2, 3, выполненная в виде жидкости, мази, лосьона, крема, жидкого спрея, лиофилизированного спрея, жидкости для полоскания рта или горла.

13. Пробиотическая композиция, содержащая терапевтически эффективное количество штамма бактерий Е.тиибШ 8Τ48Α по п.1 в концентрации от 10⁵ до 10⁹ жизнеспособных клеток (КОЕ) на 1 мл пробиотической композиции.

14. Пробиотическая композиция по п.13, выполненная в виде жидкости, таблеток, конфет, жевательной резинки или в иной съедобной форме.

15. Способ сокращения числа патогенных бактерий или вирусов в организме животного или человека, на одной из стадий которого в организм животного или человека вводят терапевтически эффективное количество пробиотической композиции по п.13.

16. Способ по п.15, в котором конечная концентрация жизнеспособных клеток бактерий (КОЕ), вводимых в организм животного или человека, составляет от 10³ до 10⁶ КОЕ/мл пробиотической композиции.