CN109456911B - 一株蒙氏肠球菌HcM7及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株蒙氏肠球菌HcM7及其应用，该菌株的分类命名为蒙氏肠球菌(Enterococcus mundtii)HcM7，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2018487，保藏日期为：2018年7月16日，保藏地址为：中国武汉武汉大学。本发明利用可培养的方法对美国白蛾幼虫中肠细菌进行分离，获得蒙氏肠球菌HcM7，并在无肠道细菌幼虫的体内重建蒙氏肠球菌HcM7，试验结果证实，HcM7对HcNPV活性有显著的抑制作用，在保护美国白蛾中将具有广泛的应用。

Description

一株蒙氏肠球菌HcM7及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株蒙氏肠球菌HcM7及其应用。

背景技术

美国白蛾Hyphantria cunea(Drury)，属鳞翅目(Lepidoptera)灯蛾科(Arctiidae)，是一种食性广、危害大的世界性检疫害虫。原产北美，广泛分布于美国北部、加拿大南部和墨西哥(Gomi，1997)。自1979年从辽宁省丹东市传入我国以后，先后扩散至陕西、河北、北京、天津、河南、山东、安徽和江苏等11个省(区市)，由于它具有食性杂、食量大、繁殖能力强、适生性广、传播速度快、危害严重等特点，因而成为我国重大的外来入侵害虫，被国家林业局列为全国六大森林病虫害防控对象之一，是目前国内外最具危险性的入侵物种(梅丽娟等，2002；国家林业局2018年第3号公告)。因此，美国白蛾的防控是保护林木资源和维护国土生态安全的重要任务，研发高效、适用的防控技术是森林保护科研人员的重要课题。

HcNPV是一种专性病原微生物，在美国白蛾的生物防治上具有广阔的前景，阐明其杀虫机制和影响因素具有理论与实践等多方面的意义。昆虫肠道微生物与寄主之间相互依存，相互影响，肠道微生物区系的动态平衡关系影响着昆虫的生命健康。因此研究肠道细菌组成结构，有助于在了解昆虫肠道微生态的基础上，解释NPV杀虫机制与影响因素，更有利于在肠道微生态的环境中发现和利用肠道细菌提高NPV杀虫活性，更好的防治美国白蛾。

发明内容

发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一株蒙氏肠球菌HcM7，对HcNPV具有很好的抑制作用。本发明的另一目的是提供一种上述一株蒙氏肠球菌HcM7的应用。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：

一株蒙氏肠球菌，其分类命名为Enterococcus mundtii HcM7，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2018487，保藏日期为：2018年7月16日，保藏地址为：中国武汉武汉大学。

所述的蒙氏肠球菌HcM7在抑制HcNPV中的应用。

所述的蒙氏肠球菌HcM7在保护美国白蛾中的应用。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下优势：

1)利用可培养的方法对美国白蛾幼虫中肠细菌进行分离，获得蒙氏肠球菌(Enterococcus mundtii)HcM7。

2)成功建立出美国白蛾无肠道细菌幼虫品系，在无肠道细菌幼虫的体内重建蒙氏肠球菌HcM7，试验结果证实，HcM7对HcNPV有显著的抑制作用，在保护美国白蛾中将具有广泛的应用。

附图说明

图1是美国白蛾中肠细菌总DNA 16SrDNA PCR扩增图；

图2是肠道细菌对不同浓度HcNPV杀虫活性的影响结果图；注：图中3-7分别代表HcNPV浓度10³-10⁷PIB·mL^-1；

图3是肠道细菌对HcNPV杀虫活性的影响结果图；图中，CK表示无肠道细菌品系的幼虫，HcM7表示重建HcM7细菌的幼虫，HcNPV+HcM7表示重建细菌后使用LC₅₀浓度HcNPV生测，HcNPV表示无肠道细菌品系的幼虫生测。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。

实施例1

蒙氏肠球菌HcM7分离自美国白蛾的肠道，其生理生化性质如下：革兰氏阳性，荚膜染色阴性，鞭毛染色阴性，菌体形状为球状，菌落形态：乳白色，圆形，光滑，凸起，有光泽，边缘透明。

蒙氏肠球菌HcM7的生理特征：蒙氏肠球菌HcM7活化后分别置于不同温度(℃)、不同NaCl浓度和不同氢离子浓度(pH)条件下接种培养2d，结果见表1，可以看出，蒙氏肠球菌HcM7在28～37℃内能生长良好，在45℃以上表现出不生长状态；在pH5～9的环境下能生长，最适宜的酸碱度偏中性，比较符合昆虫肠道内环境；但菌株对盐度要求较严格，高浓度的盐离子会抑制菌株生长。

表1 蒙氏肠球菌HcM7生理特征

注：CK表示未接菌的空白对照组。

蒙氏肠球菌HcM7的生物化学特性：对蒙氏肠球菌HcM7的进行生物化学性状测定，包括酶类、各种醇、糖以及对氮素化合物、碳素化合物等30种物质，结果见表2。

表2 蒙氏肠球菌HcM7的生化特性

提取蒙氏肠球菌HcM7的16S rDNA(SEQ ID NO.1所示)，在NCBI数据库中进行比对，与蒙氏肠球菌(Enterococcus mundtii)的相似性为99％，因此命名为：蒙氏肠球菌(Enterococcus mundtii)HcM7。

实施例2

1、将实施例1获得并保存好的蒙氏肠球菌HcM7单菌甘油管解冻后，取100μL接种到50mL LB液体培养基中，28℃，200r/min摇床培养48h进行活化。稀释一定倍数后，用血球计数板计数，将蒙氏肠球菌HcM7配置成10⁶cfu/mL，4℃冰箱保存备用。

2、参照Broderiek等(2006；2009)的方法，对美国白蛾卵表面消毒，在高压灭菌的人工饲料饲养中添加500μg/mL利福霉素，链霉素，庆大霉素，卡那霉素，氨苄青霉素混合液，饲喂美国白蛾孵化的幼虫，利用可培养方法(表3)和不可培养方法(图1)均已检测不到或是极少量肠道细菌存在。此方法虽然可以清除肠道细菌，但为了对后续生测实验无影响，需测定美国白蛾幼虫生长发育相关生理指标，主要包括幼虫存活率，化蛹率。

表3 抗生素对美国白蛾幼虫肠道可培养细菌的影响

抗生素浓度(μg/mL)	活菌数量(cfu/mL)	OD<sub>600</sub>
			500	10	0.009±0.001
0	6.7×10<sup>7</sup>	0.039±0.004

3、HcNPV室内活性测定

将HcNPV(中国林科院提供)原液稀释10倍，取50头健康幼虫，在人工饲料中添加HcNPV稀释液喂养，收集感染病毒并且发病死亡的幼虫尸体，球磨仪打碎，三层纱布过滤弃除杂质，滤液6000rpm离心25min，去上清，双蒸水悬浮沉淀，重复数次后悬液1000rpm离心5min，留上清，沉淀悬浮，重复3次，将3次上清合并，10000rpm离心30min后弃上清，沉淀即为粗提的HcNPV。为了进一步提纯HcNPV，采用蔗糖密度梯度离心法进行提纯。首先制备45％(w/w)和60％(w/w)的蔗糖溶液，将多角体悬液加于盛有60％的蔗糖液的离心管上部，8000rpm离心30min，取含多角体的上层液，移至盛有45％蔗糖液的离心管上部，再经8000rpm离心30min，收集管底的多角体，然后用双蒸水稀释，10000离心30min，弃上清，重复数次，以洗去蔗糖。将提纯后的HcNPV多角体溶于适量的双蒸水中，用血球记数法记数后贴上标签，于-20℃冰箱中保存备用。

病毒含量计数法：将病毒原液稀释至一定浓度，用血球计数板计数多角体含量。具体方法：用无菌移液管吸取少许稀释液，从盖玻片边缘慢慢注入，让样品稀释液充满计数室。将装样血球计数板在显微镜台上静置几分钟后计数。每个样品重复计数3次，取其平均值。多角体数按以下公式计算：

16×25的计数板计算公式：

多角体数(PIB·mL^-1)＝(100小格内的多角体数/100)×400×1000×稀释倍数

病毒毒力测定：将病毒稀释成1.0×10⁷，1.0×10⁶，1.0×10⁵，1.0×10⁴，1.0×10³PIBs·mL^-1 5个浓度，每组实验虫数为18头，每个处理重复3次，另设一组空白对照。无菌操作，用打孔器和刀片将人工饲料制成(3mm×1mm)薄片，放入6孔养虫皿，每个薄片滴加2μL病毒稀释液，阴干后挑取饥饿8h处理的健康活泼的美国白蛾4龄幼虫放入。在温度25±2℃，相对湿度70％-75％，光暗周期比L:D＝12h:12h的光照培养箱中饲养，饲料食进24h后，每隔一日更换无病毒新鲜的人工饲料。待幼虫开始死亡后，每日定时检查记录死虫数，并取出虫尸，直至幼虫化蛹。

4、美国白蛾幼虫生物测定

在无肠道细菌品系的美国白蛾幼虫肠道中，重建蒙氏肠球菌HcM7后对其进行生物测定。试验采用饲料添加法，分6组，以正常饲养的无肠道菌幼虫作为对照，其余组分别为添加蒙氏肠球菌HcM7，LC₅₀浓度的HcNPV，LC₅₀浓度的HcNPV和HcM7。

方法：每组试虫18头，3个重复，无菌操作制作人工饲料薄片(3mm×1mm)放入6孔养虫皿，在薄片上分别滴加各种试剂2μL，阴干后取饥饿8h处理的健康活泼的无肠道菌美国白蛾4龄幼虫放入养虫皿。在温度25±2℃，相对湿度70％-75％，光暗周期比L:D＝12h:12h的光照培养箱中饲养，饲料食进24h后，每隔一日更换新鲜无添加物的人工饲料。待幼虫开始死亡后，每日定时检查记录死虫数，并取出虫尸，直至幼虫化蛹。

重建成功与否的检测：在饲养过程中，外界细菌(包括空气中的，人为带入的细菌等)很有可能会污染到重建过程，因此，试验需要定期检测中肠细菌的重建状况与污染情况。通过可培养方法(解剖-稀释涂布)，不可培养方法(提取中肠细菌基因组DNA检测)，以检测不到其余细菌为标准来规范实验材料。

5、数据处理与分析

毒力测定的结果，将死亡率转换为几率值，病毒浓度转换为对数值，采用线性回归处理，检测数据标准化残差正态分布情况，拟合度以大于80％为标准，得到线性回归方程用以计算半致死浓度。

抗生素对美国白蛾生长发育影响和同一浓度下HcNPV对美国白蛾死亡率的影响，采用独立样本t检验，在0.05水平上，分析两组数据之间差异的显著性。

肠道细菌对美国白蛾杀虫活性的影响，对于三组以上单一变量的组间差异性检验，在检验方差齐性和数据服从正态分布的基础上，采用单因素方差分析，在0.05水平上，分析比较各组数据之间差异的显著性。以上数据处理均采用SPSS19软件，图表制作采用Excl2003软件。

6、结果

分别对正常和无肠道细菌的美国白蛾幼虫进行HcNPV毒力测定，结果如表4所示，正常的美国白蛾幼虫的LC₅₀为5.445×10⁴PIB·mL^-1，无肠道细菌幼虫的LC₅₀为3.192x10⁵PIB·mL^-1，二者相差约6倍，即通过添加抗生素清除肠道细菌后，美国白蛾幼虫对HcNPV的敏感性显著降低。图2为不同浓度的HcNPV处理下，两组实验间差异性展示，随着病毒浓度的升高，两个处理的美国白蛾幼虫死亡率均相应提高，并且在10⁷PIB·mL^-1达到最高值，均在90％以上；在低浓度10³，10⁴PIB·mL^-1，高浓度10⁷PIB·mL^-1，肠道细菌的存在对于HcNPV的毒力效果均无显著影响；但是在10⁵，10⁶PIB·mL^-1，肠道细菌的存在降低了20％的HcNPV杀虫效果。

表4 HcNPV对美国白蛾幼虫的毒力测定

在无肠道细菌的美国白蛾幼虫肠道中，重建HcM7成功后，以正常饲养无肠道菌幼虫作为对照，进行生物测定。结果如图3所示，重建两种细菌成功后，在接下来的饲养中美国白蛾幼虫的死亡率均与对照无显著差异，这说明两种细菌在以10⁶cfu/mL浓度回接后，未对美国白蛾幼虫产生致死效应；最终生物测定结果显示：重建HcM7处理组，美国白蛾幼虫死亡率显著低于只添加LC₅₀浓度HcNPV，低于只添加LC₅₀浓度HcNPV试验组25％，这表明HcM7能够显著抑制HcNPV的活性，对美国白蛾幼虫具有很好的保护作用。

序列表

<110> 南京林业大学

<120> 一株蒙氏肠球菌HcM7及其应用

<130> 100

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1144

<212> DNA

<213> Enterococcus mundtii

<400> 1

gcggcgtgct atacatgcaa gtcgaacgct tcttttccca ccggagcttg ctccaccggg 60

aaaagaggag tggcgaacgg gtgagtaaca cgtgggtaac ctgcccatca gaaggggata 120

acacttggaa acaggtgcta ataccgtata acaatcgaaa ccgcatggtt tcgttttgaa 180

aggcgcttta cggtgccgct gatggatgga cccgcggtgc attagctagt tggtgaggta 240

acggctcacc aaggccacga tgcatagccg acctgagagg gtgatcggcc acattgggac 300

tgagacacgg cccaaactcc tacgggaggc agcagtaggg aatcttcggc aatggacgaa 360

agtctgaccg agcaacgccg cgtgagtgaa gaaggttttc ggatcgtaaa actctgttgt 420

tagagaagaa caagggtgag agtaactgtt caccccttga cggtatctaa ccagaaagcc 480

acggctaact acgtgccagc agccgcggta atacgtaggt ggcaagcgtt gtccggattt 540

attgggcgta aagcgagcgc aggcggtttc ttaagtctga tgtgaaagcc cccggctcaa 600

ccggggaggg tcattggaaa ctgggagact tgagtgcaga agaggagagt ggaattccat 660

gtgtagcggt gaaatgcgta gatatatgga ggaacaccag tggcgaaggc ggctctctgg 720

tctgtaactg acgctgaggc tcgaaagcgt ggggagcaaa caggattaga taccctggta 780

gtccacgccg taaacgatga gtgctaagtg ttggagggtt tccgcccttc agtgctgcag 840

ctaacgcatt aagcactccg cctggggagt acgaccgcaa gggttgaaac tcaaagggaa 900

ttgacggggg cccgcacaag cgggtgggag catgtggttt taatttcgaa gcaacgcgag 960

acccttaccc aggtcttgac atcctttgac cactctagag aatagagctt ccccctttcg 1020

gggcaagtga cagtgctgca tgattgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt ggattagtcc 1080

ggcacggagc gcaatcataa tggtagcttg ccatcatagt tagcactcct agaccaggac 1140

ctgc 1144

Claims (2)

1.一株蒙氏肠球菌，其分类命名为蒙氏肠球菌（Enterococcus mundtii）HcM7，保藏于中国典型培养无保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2018487，保藏日期为：2018年7月16日，保藏地址为：中国武汉武汉大学。

2.权利要求1所述的蒙氏肠球菌HcM7在抑制HcNPV中的应用。