CN103571778A - 一种从黄曲条跳甲分离的粘质沙雷氏菌ps-1菌株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种从黄曲条跳甲分离的粘质沙雷氏菌PS-1菌株及其应用。本发明首次从罹病黄曲条跳甲幼虫体内直接分离到一株粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)菌株，于2013年7月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.7948。所述粘质沙雷氏菌PS-1菌株对黄曲条跳甲幼虫和成虫及甜菜夜蛾幼虫和成虫均有较强的致病力，可有效地控制甜菜夜蛾实验种群的发展。本发明为黄曲条跳甲和甜菜夜蛾的田间种群控制提供了技术基础，对安全、有效和可持续地控制黄曲条跳甲和甜菜夜蛾、有效保证蔬菜的产量和品质都有重要的实践意义和实用价值。

Description

一种从黄曲条跳甲分离的粘质沙雷氏菌PS-1菌株及其应用

技术领域

本发明涉及农作物害虫微生物杀虫剂研究及应用领域，更具体地，涉及一种从黄曲条跳甲幼虫分离的粘质沙雷氏菌PS-1菌株及其应用。

背景技术

黄曲条跳甲Phyllotreta striolata ( Fabricius)是为害十字花科蔬菜的世界性害虫[Smith E H. Revision of the genus Phyllotreta Chevrtolat of America north of Mexico. Part 1. The maculate species (Coleoptera：Chrysomelidae，Alticimae). Fieldiana (Zool)，1985，28: 1-38；张茂新，凌冰，梁广文.十字花科蔬菜上黄曲条跳甲种群动态调查与分析.植物保护，2000，26（4）：1-3；宋艳霞，董易之，张茂新. 黄曲条跳甲为害引起的菜心价值损失及防治指标研究. 华南农业大学学报. 2011(1): 53-56]。近年来，随着十字花科蔬菜种植面积的不断扩大，黄曲条跳甲的发生及为害越来越严重[聂河兴. 黄曲条跳甲危害严重原因与防治对策. 湖南农业科学, 2007, (5): 122-124；沈金发. 黄曲条跳甲的发生与综合防治技术. 福建农业科技, 2007，(2): 58-59]，在广东省的一些地区已成为十字花科蔬菜的头号害虫[高泽正，吴伟坚，崔志新.关于黄曲条跳甲的寄主范围.生态科学，2000,19（2）：70-72]。

长期以来，对于黄曲条跳甲的防治主要使用有机化学杀虫剂来毒杀其成虫，此法对生活在土中的幼虫效果很差，导致菜田中不断出现新羽化的黄曲条跳甲成虫，致使菜农施用杀虫剂的次数和浓度不断增加，蔬菜中农药残留加重，黄曲条跳甲的抗药性不断增强[周先治，吴刚.福州地区黄曲条跳甲的抗性监测.福建农林大学学报（自然科学版）2004，33（2）：158-161；梁宏卫，贤振华，龙明华. 黄曲条跳甲无公害控制技术研究进展.中国蔬菜，2007，(7)：36～3]。因此，迫切需要开发安全、高效、低毒的新型制剂。

微生物农药作为一种防治农林害虫的新技术手段在世界范围内受到广泛重视，特别是昆虫病原微生物农药具有对害虫专一性强、对环境和生态安全的突出优点，在发展无公害农产品、保护人民健康上比化学农药有着更大的优越性。黄曲条跳甲病原微生物的开发和利用是其生物防治的一个重要方面，但相关研究国内外报道很少。黄运霞等[黄运霞, 黄荣瑞, 李华. 坚强芽孢杆菌对黄条跳甲的毒效初步试验.生物防治通报，1992，8 (4) : 182 ]分离到一株坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus) 菌株Pu165，对黄曲条跳甲成虫表现出较好的毒杀作用。邝灼彬等[邝灼彬，吕利华，冯夏，陈焕瑜，武亚敬，何余容. 球孢白僵茵对四种十字花科蔬菜害虫的兼控潜力评价. 昆虫知识， 2005，42 (6) : 673 - 676 ]在室内测定了一株分离自小猿叶甲的球孢白僵菌对黄曲条跳甲的致病力。

甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）属鳞翅目夜蛾科，是一种多食性、间歇性大发生的害虫，寄主植物植物广泛，多达170余种，包括蔬菜、棉花、玉米、豆类等作物，其中对蔬菜和棉花为害最重[司升云，周利琳，王少丽，江幸福，许再福，慕卫，王冬生，王小平，陈浩涛，杨亦桦，吉训聪. 甜菜夜蛾防控技术研究与示范. 应用昆虫学报，2012，49 (6) : 1432-1438；吉训聪，谢圣华，林珠凤，梁延坡. 华南地区甜菜夜蛾发生特点及其综合防控技术. 长江蔬菜，2010，18: 100-102；郑霞林，王攀，王小平，雷朝亮. 转基因棉甜菜夜蛾的为害现状、爆发成因及防治现状. 植物保护，2010，36 (3): 34-38；袁永达，王冬生，张天澍，滕海媛. 甜菜夜蛾引起的青菜产量损失及其防治指标研究. 上海农业学报，2013，29(2): 20-23]。甜菜夜蛾易产生抗药性，在不同地区已对拟除虫菊酯类、有机磷类和昆虫生长调节剂等杀虫剂表现出不同程度的抗药性，使用药量不断增加，加重了环境污染和农产品中化学残留，对农作物的优质高产造成严重影响[夏晓明，王开运，姜兴印，仪美芹. 甜菜夜蛾抗药性现状及综合治理研究进展. 农药，2003, 42(8): 1-5；袁永达，王冬生，於文俊. 上海地区甜菜夜蛾的抗药性及防治. 上海农业学报，2006，22(1) : 42- 45；苏宏华，宋彬，李丽，陆永威，杨益众. 甜菜夜蛾的抗性及抗性机理研究进展. 应用昆虫学报，2012，49 ( 6) : 1659-1663]。随着转Bt基因棉的大面积种植，甜菜夜蛾也对转Bt基因棉产生了抗性[郑霞林，王攀，王小平，雷朝亮. 转基因棉甜菜夜蛾的为害现状、爆发成因及防治现状. 植物保护，2010，36 (3): 34-38；苏宏华，范娜，李达，杨益众. 转Bt基因棉对甜菜夜蛾的影响. 植物保护，2010，36 (5)：1-5]，这对甜菜夜蛾的有效控制提出了更高的要求。齐放军等和杨琼等分别从罹病甜菜夜蛾幼虫体分离到粘质沙雷氏菌QL-1和 B302个菌株，并测定了它们对甜菜夜蛾幼虫的致病性[齐放军，刘缨，季志英. 一种新的甜菜夜蛾致病菌的分离和鉴定. 植物保护学报，2004，31(2): 223-224；杨琼，周宇，韩光杰，方继朝. 两种甜菜夜蛾致病菌的分离、鉴定及杀虫成分初步分析. 江苏农业学报， 2012, 28( 6) : 1267-1271]，陈秀为等报道了从棉铃虫分离得到的粘质沙雷氏菌株对田间甜菜夜蛾幼虫虫口减退率的影响[陈秀为，范寰，陈融，于向君，兰洪霞，孙伯芝. 粘质沙雷氏菌对棉铃虫、菜青虫致病力及田间控制的研究初报. 天津农学院学报，2001, 8 (3): 28-30]，但粘质沙雷氏菌PS-1菌株对甜菜夜蛾的致病性以及对其种群增长的影响等均未见报道。

粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)是一类普遍存在于自然界的腐生小杆菌，由于其对多种农业害虫有较高的致死活性而备受各国科学家的重视。目前，已从感染该病原菌的蝗虫、棉铃虫、小菜蛾、光肩星天牛红棕象甲和甜菜夜蛾等害虫体内筛选出具有高致病性的菌株[Jeong H U，Mun H Y，Oh H K，Kim S B，Yang K Y，Kim I，Lee H B. Evaluation of Insecticidal Activity of a Bacterial Strain, Serratiasp. EML-SE1 against Diamondback Moth. The Journal of Microbiology，2010， 48（4）：541-545；Mohan M，Selvakumar G，Sushil S N，Bhatt J C， Gupta H  S. Entomopathogenicity of endophytic Serratia marcescens strain SRM against larvae of Helicoverpa armigera (Noctuidae: Lepidoptera). World Journal Microbiology and Biotechnology, 2011(27): 2545–2551；金虹，葛绍荣，陶勇，冉红艳，刘世贵.一株蝗虫病原菌的鉴定及其毒力和病理研究.微生物学报，45（2）：172-176；邓彩萍，刘红霞，闰喜中，武旭霞，骆有庆. 罹病光肩星天牛幼虫分离菌株的16S rDNA系统发育分析. 安徽农业科学，2008，36(18)：7672—7673，7682；张晶，覃伟权，阎伟，彭正强.一株对红棕象甲幼虫和卵有致病力的病原菌的分离鉴定. 热带作物学报，2011，32(12)：2331—233；齐放军，刘缨，季志英.罹病甜菜夜蛾分离菌株的生理特征及1 6S rDNA系统发育分析.山东大学学报（理学版），2004，39（4）：115-119]。

从甜菜夜蛾幼虫体也分离到粘质沙雷氏菌致病菌株 [齐放军，刘缨，季志英. 一种新的甜菜夜蛾致病菌的分离和鉴定. 植物保护学报, 2004，31(2)：223-224；杨琼，周宇，韩光杰，方继朝． 两种甜菜夜蛾致病菌的分离、鉴定及杀虫成分初步分析. 江苏农业学报， 2012，28( 6)：1267-1271]，但是，黄曲条跳甲是十字花科蔬菜上危害最为严重的害虫，但到目前为止，尚未见有昆虫病原微生物----粘质沙雷氏菌侵染黄曲条跳甲的报道，更未见直接从黄曲条跳甲直接分离得到粘质沙雷氏菌致病菌株相关技术报道，而粘质沙雷氏菌致病菌株同时可使黄曲条跳甲致病的技术研究在国内尤属空白，不能实现两种常见害虫的兼治，为农业生产防治害虫带来很大的局限和不便。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有黄曲条跳甲和甜菜夜蛾的田间种群控制应用中微生物农药的技术不足，提供一种新的粘质沙雷氏菌PS-1菌株。

本发明的另一个要解决的技术问题是提供所述粘质沙雷氏菌PS-1菌株的分离纯化方法。所述粘质沙雷氏菌PS-1菌株由黄曲条跳甲幼虫直接分离纯化得到。

本发明的另一个发明目的是提供所述粘质沙雷氏菌PS-1菌株的应用，具体是在防治黄曲条跳甲和/或甜菜夜蛾方面的应用。所述粘质沙雷氏菌PS-1菌株对黄曲条跳甲和/或甜菜夜蛾具有强致病力。

本发明的目的通过以下技术方案予以实现：

提供一种粘质沙雷氏菌PS-1菌株（Serratia marcescens），该菌株于2013年7月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏号为CGMCC No.7948。

所述粘质沙雷氏菌PS-1菌株的菌体16SrDNA序列分析结果如SEQ ID NO：1所示。

本发明同时提供所述粘质沙雷氏菌PS-1菌株的分离纯化方法，包括以下步骤：

S1.病原菌的分离   取被粘质沙雷氏菌感染、体色变红而死的黄曲条跳甲幼虫体接种到平板LB琼脂培养基中，倒置于恒温箱中培养，待菌落形成后，挑取深红色菌落用平板划线法分离，重复操作，得到单株菌落，转入试管斜面LB琼脂培养基上，保存备用；所述LB琼脂培养基组成为：琼脂15～20g，氯化钠10g，胰蛋白胨10g，酵母浸出粉5g，水1L ，pH7.2；

S2.病原菌的复感染  将S1分离到的单菌落菌株接种于装有LB液体培养基的三角瓶中，置于恒温摇床中活化；活化后吸取菌液转接到另一个装有LB液体培养基的三角瓶中，继续培养后，离心弃去上清液，用无菌水洗涤细菌沉淀，加入无菌水，磁力漩涡震荡溶解作为初始菌悬液；将新鲜萝卜块浸入到初始菌悬液中约5～10s，置于通风处晾干表面水分，放入垫有湿润滤纸的培养皿中，培养皿中接入黄曲条跳甲3龄幼虫，保鲜膜封口；24h后，用无菌萝卜块继续饲养，每天更换新鲜萝卜块；3天后，挑取受感染死亡的黄曲条跳甲幼虫，按S1方法分离得到致病PS-1菌株并保存。所述LB液体培养基组成为：蛋白胨10 g，酵母浸出粉5 g，氯化钠10 g，水1L ，pH7.2。

本发明同时提供了所述PS-1菌株在黄曲条跳甲和甜菜夜蛾生物防治方面的应用，具体是将所述菌株应用于防治黄曲条跳甲和/或甜菜夜蛾幼虫及成虫，所述菌株病原体对黄曲条跳甲和甜菜夜蛾幼虫及成虫有很强的致病力；本发明所述菌株的菌体培养上清液对甜菜夜蛾幼虫及成虫也具有较强的致死作用，将所述菌株的菌体培养上清液应用于防治甜菜夜蛾幼虫及成虫。

本发明具有如下有益效果：

本发明提供了一种新的粘质沙雷氏菌PS-1菌株，首次从罹病黄曲条跳甲幼虫体内直接分离到，国内外尚无相关技术报道。所述粘质沙雷氏菌PS-1菌株经致病力测定结果表明，对黄曲条跳甲幼虫和成虫及甜菜夜蛾幼虫和成虫均有较强的致病力，可有效地控制甜菜夜蛾实验种群的发展。本发明为黄曲条跳甲和甜菜夜蛾的田间种群控制提供了技术基础，对安全、有效、可持续地控制黄曲条跳甲和甜菜夜蛾，保证蔬菜的产量和品质都有重要的实践意义和实用价值。

本发明所述粘质沙雷氏菌PS-1菌株不仅对黄曲条跳甲幼虫和成虫有较强的致病力，而且对甜菜夜蛾幼虫和成虫也有很强的毒杀作用。黄曲条跳甲是十字花科蔬菜上危害最为严重的害虫，到目前为止，尚未见有昆虫病原微生物----粘质沙雷氏菌侵染黄曲条跳甲的报道。虽然有从甜菜夜蛾幼虫体也分离到粘质沙雷氏菌致病菌株 [齐放军，刘缨，季志英. 一种新的甜菜夜蛾致病菌的分离和鉴定. 植物保护学报, 2004，31(2)：223-224；杨琼，周宇，韩光杰，方继朝． 两种甜菜夜蛾致病菌的分离、鉴定及杀虫成分初步分析. 江苏农业学报， 2012, 28( 6)：1267-1271]，但未见到同时可使黄曲条跳甲致病的报道。而且，粘质沙雷氏菌PS-1菌体培养上清液对甜菜夜蛾幼虫和成虫表现出明显的致死作用，其毒杀效果与菌体悬浮液的作用相似。粘质沙雷氏菌PS-1菌株易于培养，操作简单，生产和加工工艺简单，可应用于工厂化生产。且可实现两种常见害虫的生物兼治，在黄曲条跳甲以及甜菜夜蛾的生物防治方面具有重要的应用价值，为农业生产防治害虫带来很大的方便，解决了本技术领域长久以来的技术难题。

附图说明

图1病原菌PS-1的菌落形态图。 

图2 PS-1的扫描电镜图（20000×）。

图3 PS-1 16S rDNA PCR扩增产物电泳图，其中M为2000bpMarker泳道； 1为菌株PS-1DNA产物泳道。

图4基于16S rDNA 基因序列建立的沙雷氏菌属系统发育树节点上的数字表示100自展后的数值。

图5 黄曲条跳甲罹病幼虫。

图6 黄曲条跳甲罹病幼虫。

图7 黄曲条跳甲健康幼虫。

图8粘质沙雷氏菌PS-1对黄曲条跳甲成虫的毒杀作用。

图9罹病甜菜夜蛾幼虫。

图10罹病甜菜夜蛾蛹。

图11罹病甜菜夜蛾成虫。

图12健康甜菜夜蛾幼虫。

图13健康甜菜夜蛾蛹。

图14健康甜菜夜蛾成虫。

图15 不同浓度粘质沙雷氏菌PS-1对甜菜夜蛾幼虫的毒杀作用。

图16 粘质沙雷氏菌PS-1对甜菜夜蛾成虫存活率的影响。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，但具体实施例并不对本发明作任何限定。实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1粘质沙雷氏菌PS-1的分离培养方法

1. 病原菌的分离与复感染

S1.病原菌的分离   

取自然感染粘质沙雷氏菌、体色变红而死的黄曲条跳甲幼虫体接种到平板LB琼脂培养基（琼脂15～20g，氯化钠10g，胰蛋白胨10g，酵母浸出粉5g，水1L ，pH7.2）中，倒置于30℃恒温箱中培养，待菌落形成后，挑取深红色菌落再用平板划线法分离，重复5～7次后得到单株菌落，再转入试管斜面LB琼脂培养基上，在4℃冰箱保存。

S2.病原菌的复感染  

将分离到的单菌落菌株接种于装有100ml LB液体培养基（蛋白胨10 g，酵母浸出粉5 g，氯化钠10 g，水1L ，pH7.2）的三角瓶中，置于30℃、140 r·min^-1的恒温摇床中，活化10h。从中吸取1mL菌液转接到另一个装有100mL LB液体培养基的三角瓶中，30℃、140 r·min^-1继续培养。12h后，用5000 r·min^-1离心10min，弃去上清液，用无菌水洗涤细菌沉淀2次，然后加入20ml无菌水，磁力漩涡震荡溶解作为初始菌悬液。将新鲜萝卜块(2 cm×1cm ×0.5cm)浸入到菌悬液中约5-10s，置于通风处晾干表面水分，放入垫有湿润滤纸的培养皿（9cm）中，每皿接入黄曲条跳甲3龄幼虫10头，保鲜膜封口。24h后，用无菌萝卜块继续饲养，每天更换新鲜萝卜块。3d后，挑取受感染死亡的黄曲条跳甲幼虫，按前法分离得到致病PS-1菌株并保存。

致病菌PS-1菌株的形态学、生理生化及分子生物学特性

通过病原菌的形态观察、Biolog系统鉴定以及16Sr DNA序列测定比对，确定PS-1菌株隶属于肠杆菌科、沙雷氏菌属的粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens ）族群，并于2013年7月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.7948。

所述菌株的形态特征：

菌体在30℃条件下，用LB琼脂培养基培养生长正常。培养8h出现乳黄色的圆形菌落，12h菌落变成粉红色，随着培养时间的延长，菌落的颜色加深变成红色，见附图1所示。菌落为圆形，表面稍隆起，有光泽，光滑湿润，边缘整齐或不整齐，有轻微异味。LB液体培养基振荡培养，培养液浑浊，有轻微异味。培养液在静置数小时后有红色色素出现。扫描电镜观察显示菌体为短杆状，两端钝圆，见附图2所示。菌体长0.41～1.28 um，宽0.28～0.71 um。

所述菌株的生理生化特性：

    PS-1菌株革兰氏染色呈阴性，在GEN III鉴定板上的显色反应结果如表1所示。以A1孔为阴性对照对GENⅢ微孔板1～9列中的碳源利用情况进行测试比对，以A10孔为阳性对照对GENⅢ微孔板10～12列中的化学物质的敏感性进行测试

比对。附图3为PS-1 16S rDNA PCR扩增产物电泳图，其中M为2000bpMarker泳道； 1为菌株PS-1DNA产物泳道。从附图3和表1的试验结果可以看出，PS-1菌株可利用35种碳源，对14种化学物质敏感，容易被萘啶酮酸和亚碲酸钾所抑制。将Biolog 细菌自动鉴定系统测定的结果经计算机处理后与数据库内己知的细菌比较分析，该菌株是粘质沙雷氏菌的可能性为78.8%，相似性为0.543，位距为4.396。结合形态特征和Biolog鉴定结果初步确定该菌株为粘质沙雷氏菌。

表1 病原菌PS-1 Biolog GENⅢ微孔的鉴定结果

表中括号内的“-”为阴性反应、“+”为阳性反应、“B”表示结果不确定。

序列测序结果与分析：

以PS-1菌株的基因组DNA为模板，PCR扩增产物的序列长为1423bp。根据PS-1菌株测序的结果进行Blast序列比对，与沙雷氏菌属的粘质沙雷氏菌菌种的同源性最高。选取与PS-1菌株16S rDNA序列同源性相对较高的沙雷氏菌属16个菌株构建的系统树见附图4所示。PS-1菌株与S. marcescens形成一个簇群，PS-1菌株的16S rDNA序列与S. marcescens（登录号为AY514433.1）菌株的相似性达到99.2%，与Serratiasp.（登录号为JF783992.1)菌株的相似性达到98.6%。这一结果进一步明确了PS-1菌株归属于粘质沙雷氏菌S. marcescens。菌体16SrDNA序列分析结果如SEQ ID NO：1所示。

实施例2 粘质沙雷氏菌PS-1菌株对黄曲条跳甲幼虫的生物活性

供试虫源 黄曲条跳甲成虫采自华南农业大学资源环境学院植保农场（供试虫的来源并不限定本发明，其他来源的虫源亦适用于本发明），将其置于网室内种植的菜心苗上饲养，收集黄曲条跳甲卵，待幼虫孵化后，用萝卜片在培养皿中饲养至3龄供试。

病原菌培养  病原菌接种于100 ml LB液体培养基中，置于30℃恒温摇床，140 r/min活化10h后，取1 ml菌液转接到100 ml LB液体培养基中，30℃，140 r/min培养24h。5000 r/min离心10 min后，弃去上清液，用无菌水洗涤细菌沉淀2次，然后加入20 ml无菌水，磁力漩涡震荡溶解作为初始菌悬液备用。

生测方法  配制浓度为3×10² cfu·ml^-1、3×10⁴ cfu·ml^-1、3×10⁶ cfu·ml^-1和3×10⁸ cfu·ml^-1的菌悬液。将新鲜萝卜块(2 cm×1cm ×0.5cm)分别浸入不同浓度的菌悬液中5s，晾干，放入培养皿（9cm）中，每皿接入黄曲条跳甲3龄幼虫10头，保鲜膜封口。以无菌水处理作为对照，每个处理重复4次。24 h后，所有处理均用无菌萝卜块继续饲养，每天更换新鲜萝卜块，记录幼虫的死亡数。生测试验在温度为25±2℃、相对湿度为75％～80％ 和光照时间L：D =14：10的条件下进行。试验结果如下：

    黄曲条跳甲幼虫感染粘质沙雷氏菌PS-1菌株的初期，透过虫体体壁可看到体腔泛红，把奄奄一息的幼虫解剖，发现整个消化道由于感染粘质沙雷氏菌呈现琥珀色，而健康的幼虫消化道呈现的是正常乳黄色。24h后幼虫开始死亡，受感染的幼虫变成红色，柔软。用毛笔轻轻触动便溃烂，其内脏被液化。黄曲条跳甲罹病幼虫与健康幼虫的比较见附图5～附图7所示，其中，附图5和附图6为罹病黄曲

条跳甲幼虫，附图7为健康黄曲条跳甲幼虫。

表2是不同浓度粘质沙雷氏菌PS-1菌原体悬浮液处理后黄曲条跳甲3龄幼虫的死亡率。从表2可以看出，随着菌原体浓度的增加，幼虫的死亡率也随着提高，说明幼虫的死亡率与第一次摄入的菌原体浓度有密切关系。处理1d后，高浓度3×10⁶ cfu·ml^-1和3×10⁸ cfu·ml^-1处理的幼虫死亡率显著地高于对照（F_L1=17.72，p_L1=0.0001）。处理2d～4d，虽然3×10² cfu·ml^-1和3×10⁴ cfu·ml^-1处理组幼虫死亡率低于两个高浓度处理组，但都明显高于对照组。表现出明显的浓度-效应关系。各病原菌处理随着时间的延长，幼虫累计死亡率不断提高。在3×10⁶ cfu·ml^-1浓度处理中，处理1d、2d、3d和4d后的累计死亡率分别为20.0%、55.0%、57.0%和67.5%。在3×10⁸浓度处理4d后的校正死亡率达到77.5%，说明粘质沙雷氏菌PS-1菌株对黄曲条跳甲幼虫有明显的致死作用。

用不同浓度粘质沙雷氏菌PS-1菌原体处理的黄曲条跳甲3龄幼虫3d后均开始化蛹，4d后全部进入蛹期。高浓度3×10⁸ cfu·ml^-1处理组的黄曲条跳甲幼虫虽然有少量化蛹，但蛹体颜色由浅黄色逐渐变成红色，最后全部死亡。

表2 粘质沙雷氏菌PS-1菌株对黄曲条跳甲3龄幼虫的毒杀作用

表中同列数据后小写英文字母不同者表示经Duncan’s新复极差多重比较在0.05水平上差异显著（P<0.05）。

实施例3 粘质沙雷氏菌PS-1菌株对黄曲条跳甲成虫的毒力测定

供试黄曲条跳甲以及病原菌的培养同实施例2。

试验方法：挑取洗净晾干的菜心叶片1.5g，在1.0×10⁸ cfu·ml^-1的菌悬液 (含0.1％吐温-80)中浸泡30 S，置于通风处晾干放入培养皿中，用塑料罩（直径9cm，高21 cm）罩上，接入饥饿2h的黄曲条跳甲成虫10头，24 h后，换用新鲜的菜心叶片继续饲喂。用含0.1％吐温-80的双蒸水处理菜心叶片为对照组。每处理重复5～7次。观察12 d，每天记录成虫的死亡数。试验在温度为25±2℃、相对湿度为75％～80％ 和光照时间L：D =14：10的条件下进行。试验结果如下：

附图8所示粘质沙雷氏菌PS-1菌悬液（浓度为1×10⁸ cfu·ml^-1）处理黄曲条跳甲成虫后12d的死亡率为41.67%，与对照相比差异显著（t=4.50，p=0.0015）。这一结果表明，粘质沙雷氏菌PS-1菌株对黄曲条跳甲成虫具有致病性。

本发明研究结果表明，粘质沙雷氏菌PS-1菌株不仅对黄曲条跳甲幼虫有较强的毒力，对其成虫具有致病力。黄曲条跳甲是十字花科蔬菜上危害最为严重的害虫，到目前为止，在生产上未见有利用昆虫病原微生物防治黄曲条跳甲的报道。粘质沙雷氏菌PS-1菌株易于培养，操作简单，生产和加工工艺简单，可应用于工厂化生产，在黄曲条跳甲的生物防治方面具有重要的应用价值。

实施例4 粘质沙雷氏菌PS-1菌株对甜菜夜蛾幼虫的生物活性测定

供试虫源  甜菜夜蛾幼虫和成虫均来自华南农业大学昆虫生态研究室，用胡凤林的人工饲料配方[胡凤林，彭正松，蔡平钟，王闵霞，龙虎，曲继鹏，陈先红. 甜菜夜蛾的人工饲养方法. 安徽农业科学, 2008, 36 (1): 68-69]在室内条件下饲养2～3代的实验种群。室内饲养条件为：温度为25±2℃、相对湿度为75％～80％ 和光照时间为L：D =14：10（供试虫的来源和饲养方法并不限定本发明，其他来源的虫源亦适用于本发明）。

活性测定方法  采用粘质沙雷氏菌PS-1菌悬液与人工饲料（可采用胡凤林的人工饲料配方或其他常规饲料配方）混合后的含菌饲料饲喂甜菜夜蛾幼虫。PS-1菌悬液的浓度为2.5×10cfu/ml、2.5×10³ cfu/ml、2.5×10⁵cfu/ml和2.5×10⁸cfu/ml。称取0.5 g带菌饲料分别放入24孔细胞培养皿的每个孔内，在每个培养孔内接入发育一致已饥饿2h的甜菜夜蛾2龄幼虫，单头饲养。幼虫取食带菌饲料48h后，被转移到装有无菌新鲜饲料的塑料盒（直径3 cm，高3 cm）中继续饲喂，每天更换新鲜饲料，直至幼虫化蛹。每天观察记录幼虫的死亡数。并在处理后2d和4d分别对各处理幼虫称重。

供试病原菌的培养同实施例2。试验结果如下：

甜菜夜蛾幼虫取食带菌饲料24h后，染病虫体初期表现出活动缓慢，取食减少；处理2d后虫体开始变成红色，陆续死亡。有些感染幼虫虽然可以化蛹，但在蛹期，其外表颜色逐渐加深死亡。羽化后的成虫寿命缩短，产卵量下降。死亡的成虫体变红色，体壁变脆，用毛笔轻轻触碰即溃烂流出红色菌脓，附图9～附图14提供了染病与健康的甜菜夜蛾比较结果，其中附图9～附图11为罹病甜菜夜蛾幼虫、蛹和成虫，附图12～附图14为健康甜菜夜蛾幼虫、蛹和成虫。

粘质沙雷氏菌PS-1菌株对甜菜夜蛾幼虫生长发育的抑制作用见附图15所示。附图15中，图中1、2、3和4分别代表粘质沙雷氏菌PS-1的浓度为2.5×10cfu/ml、2.5×10³cfu/ml、2.5×10⁵cfu/ml和2.5×10⁸cfu/ml；同一天的相同字母者表示经Duncan氏新复极差测验，其在0.05水平上差异不显著。

粘质沙雷氏菌PS-1菌株对甜菜夜蛾幼虫的致死作用见附图15所示，其中，图中1、2、3和4分别代表粘质沙雷氏菌PS-1的浓度为2.5×10cfu/ml、2.5×10³cfu/ml、2.5×10⁵cfu/ml和2.5×10⁸cfu/ml；由附图15可以看出，甜菜夜蛾幼虫在供试浓度的粘质沙雷氏菌PS-1处理中的死亡率均明显升高，随着浓度的增加和处理时间的延长，甜菜夜蛾幼虫的死亡率不断增加。从3d开始，4个菌悬液处理组的幼虫死亡率明显高于对照组（F_3d =9.439, P_3d =0.0020）。高浓度2.5×10⁸cfu/ml处理组幼虫的死亡率在4d急剧上升，明显高于其它处理组（F_4d =40.357, P_4d =0.0001），累积死亡率达66.5%；8d的累积死亡率达75.0%。2.5×10cfu/ml、2.5×10³cfu/ml和2.5×10⁵cfu/ml浓度处理组的累积死亡率也显著高于对照组，分别为32.0%、39.5%和37.5%。

实施例5 粘质沙雷氏菌PS-1菌株饲喂甜菜夜蛾幼虫后对其实验种群的抑制作用测定

测定方法：采用粘质沙雷氏菌PS-1菌悬液与人工饲料（同前述实施例）混合后的含菌饲料饲喂甜菜夜蛾2龄幼虫48h后，被转移到装有无菌新鲜饲料的塑料盒（直径3 cm，高3 cm）中继续饲喂，每天更换新鲜饲料，直至幼虫化蛹。每天观察记录幼虫的死亡数、化蛹数及羽化的成虫数；羽化的成虫成对地接入圆柱形纸筒（直径9 cm，高21 cm）中，并饲喂10%的蜂蜜水，记录成虫寿命和产卵量。带菌人工饲料中PS-1菌悬液的浓度分别为为2.5×10cfu/ml、2.5×10³ cfu/ml、2.5×10⁵cfu/ml和2.5×10⁸cfu/ml。用同等剂量的无菌水加入到人工饲料中饲喂甜菜夜蛾幼虫作为对照处理，每个处理重复3次。

粘质沙雷氏菌PS-1菌悬液饲喂甜菜夜蛾幼虫后对甜菜夜蛾成虫的寿命及产卵量有显著的抑制作用，见表3所示。从表3可以看出，甜菜夜蛾幼虫取食了含有不同浓度粘质沙雷氏菌PS-1菌株的人工饲料后表现出明显的后致死作用，且有明显的浓度效应。4个菌悬液处理组甜菜夜蛾的羽化率明显低于对照（F=28.67, P=0.0001），寿命缩短（F=25.387，P=0.0001）)，产卵量也显著降（F=33.672, P=0.0001）。浓度为2.5×10⁸ cfu/ml处理组甜菜夜蛾的羽化率只有12.50%，羽化出的成虫不能正常展翅，未产一粒卵，其寿命比对照缩短了5d。粘质沙雷氏菌PS-1菌悬液饲喂甜菜夜蛾幼虫后对甜菜夜蛾实验种群的抑制作用见表4所示。

表3 甜菜夜蛾幼虫感染粘质沙雷氏菌PS-1后对其成虫羽化率、寿命和产卵量的影响

注：表中同列数据后字母相同者表示经DMRT检验在5%水平上差异不显著。

表4  粘质沙雷氏菌PS-1处理的甜菜夜蛾实验种群生命表

注：① 表中数据为3次重复平均值；② 标准卵量(F) 是试验中观察到的单头雌虫最大的产卵量，为385粒/雌虫；③ 表中同行数据后字母相同者表示经DMRT 检验在5%水平上差异不显著。

从表4可以看出，粘质沙雷氏菌PS-1菌株对甜菜夜蛾实验种群的增长有很强的控制作用。在供试的浓度范围内，随着粘质沙雷氏菌PS-1菌株浓度的不断提高，其控制作用愈来愈强，用2.5×10cfu/ml、 2.5×10³cfu/ml 、2.5×10⁵cfu/ml 和2.5×10⁸cfu/ml浓度的粘质沙雷氏菌PS-1处理甜菜夜蛾幼虫后，其实验种群的增长分别比对照降低了74.4%、87.4%、90.3%和100%。

实施例6 粘质沙雷氏菌PS-1菌株对甜菜夜蛾成虫的致死作用测定

测定方法：将同一天羽化的甜菜夜蛾成虫配对，接入圆柱形纸筒（直径9 cm，高21 cm）中。用含有不同浓度粘质沙雷氏菌PS-1菌悬液的10%的蜂蜜水饲喂甜菜夜蛾成虫2d，然后改用正常的10%蜂蜜水饲喂，以无菌的10%蜂蜜水饲喂成虫作为对照。每天更换一次饲料，直至成虫死亡。每处理重复10次。每天记录成虫的产卵量和雌雄成虫的死亡时间。

    结果表明：用不同浓度粘质沙雷氏菌PS-1菌体悬浮液的蜂蜜水饲喂甜菜夜蛾成虫后，对其存活率有明显的影响。附图16提供了粘质沙雷氏菌PS-1对甜菜夜蛾成虫存活率的影响，其中，图中1、2和3分别代表粘质沙雷氏菌PS-1的浓度为1×10³cfu/ml、1×10⁵cfu/ml和1×10⁷cfu/ml。从附图16可以看出，甜菜夜蛾成虫取食了含有PS-1菌体的蜂蜜水后，在短时间内就会迅速死亡。1d～4d，3个PS-1菌体处理的成虫存活率呈直线性急剧下降，6d时，1×10⁷ cfu/ml处理组成虫全部死亡，1×10³ cfu/ml和1×10⁵ cfu/ml处理组的存活率仅为12.5%和29.17%，而此时对照组的存活率为95.8%；1×10³ cfu/ml和1×10⁵ cfu/ml处理组成虫在8d、9d也全部死亡。与对照组相比，1×10³ cfu/ml、1×10⁵ cfu/ml和1×10⁷ cfu/ml浓度处理组的成虫寿命明显缩短（F=83.83，P=0.0001），分别比对照缩短了5.70d、5.91d和7.16d，产卵量也明显减少（F=24.158, P=0.0001），见表5所示。

表5粘质沙雷氏菌PS-1对甜菜夜蛾成虫寿命和产卵量的影响

表中同行数据后字母相同者表示经DMRT 检验在5%水平上差异不显著。

实施例7 粘质沙雷氏菌PS-1菌体培养上清液对甜菜夜蛾2龄幼虫的生物活性测定

用实施例4所述方法培养的同一批次菌悬液离心后，分别取上清液10 ml进行不同处理：（1）在60℃加热15 min；（2）在100℃加热15 min；（3）加入蛋白酶K100 μl，37℃水浴1h；（4）不做任何处理；以LB液体培养基作为对照。按实施例4相同的方法测定上述不同处理溶液与人工饲料混配后饲喂甜菜夜蛾2龄幼虫。每天观察记录幼虫的死亡数、化蛹数及羽化的成虫数；羽化的成虫成对地接入圆柱形纸筒（直径9 cm，高21 cm）中，并饲喂10%的蜂蜜水，记录成虫寿命和产卵量。

在处理后1～3d，所有处理间甜菜夜蛾幼虫的死亡率差异不显著。从4d开始，粘质沙雷氏菌PS-1培养上清液对甜菜夜蛾幼虫的致死作用明显高于其他处理，且随着处理时间的延长死亡率不断提高，8d的死亡率达70.0%。经过60℃加热处理的上清液也有一定的致死作用，8d的死亡率达26.0%，但经过100℃加热和蛋白酶K处理后的上清液对甜菜夜蛾幼虫的死亡率与对照相比差异不显著（表6）。从表6可以看出，用粘质沙雷氏菌PS-1培养上清液饲喂甜菜夜蛾幼虫后对其成虫也表现出明显的后致死作用，成虫寿命缩短，产卵量明显减少。这些结果表明，粘质沙雷氏菌PS-1菌株培养上清液对甜菜夜蛾也有较强的毒力。

表6 粘质沙雷氏菌PS-1培养上清液对甜菜夜蛾幼虫和成虫的毒力

注：表中同列数据后字母相同者表示经DMRT检验在5%水平上差异不显著。

                         SEQUENCE LISTING

 

<110>  华南农业大学

 

<120>  一种从黄曲条跳甲分离的粘质沙雷氏菌PS-1菌株及其应用

 

<130> 

 

<160>  1    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  1423

<212>  DNA

<213>  PS-1菌株的菌体16SrDNA序列

 

<400>  1

gcttacacat gcaagtcgag cggtagcaca ggggagcttg ctccctgggt gacgagcggc     60

 

ggacgggtga gtaatgtctg ggaaactgcc tgatggaggg ggataactac tggaaacggt    120

 

agctaatacc gcataacgtc gcaagaccaa agagggggac cttcgggcct cttgccatca    180

 

gatgtgccca gatgggatta gctagtaggt ggggtaatgg ctcacctagg cgacgatccc    240

 

tagctggtct gagaggatga ccagccacac tggaactgag acacggtcca gactcctacg    300

 

ggaggcagca gtggggaata ttgcacaatg ggcgcaagcc tgatgcagcc atgccgcgtg    360

 

tgtgaagaag gccttcgggt tgtaaagcac tttcagcgag gaggaaggtg gtgagcttaa    420

 

tacgctcatc aattgacgtt actcgcagaa gaagcaccgg ctaactccgt gccagcagcc    480

 

gcggtaatac ggagggtgca agcgttaatc ggaattactg ggcgtaaagc gcacgcaggc    540

 

ggtttgttaa gtcagatgtg aaatccccgg gctcaacctg ggaactgcat ttgaaactgg    600

 

caagctagag tctcgtagag gggggtagaa ttccaggtgt agcggtgaaa tgcgtagaga    660

 

tctggaggaa taccggtggc gaaggcggcc ccctggacga agactgacgc tcaggtgcga    720

 

aagcgtgggg agcaaacagg attagatacc ctggtagtcc acgctgtaaa cgatgtcgat    780

 

ttggaggttg tgcccttgag gcgtggcttc cggagctaac gcgttaaatc gaccgcctgg    840

 

ggagtacggc cgcaaggtta aaactcaaat gaattgacgg gggcccgcac aagcggtgga    900

 

gcatgtggtt taattcgatg caacgcgaag aaccttacct actcttgaca tccagagaac    960

 

tttccagaga tggattggtg ccttcgggaa ctctgagaca ggtgctgcat ggctgtcgtc   1020

 

agctcgtgtt gtgaaatgtt gggttaagtc ccgcaacgag cgcaaccctt atcctttgtt   1080

 

gccagcggtt cggccgggaa ctcaaaggag actgccagtg ataaactgga ggaaggtggg   1140

 

gatgacgtca agtcatcatg gcccttacga gtagggctac acacgtgcta caatggcata   1200

 

tacaaagaga agcgacctcg cgagagcaag cggacctcat aaagtatgtc gtagtccgga   1260

 

ttggagtctg caactcgact ccatgaagtc ggaatcgcta gtaatcgtag atcagaatgc   1320

 

tacggtgaat acgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt cacaccatgg gagtgggttg   1380

 

caaaagaagt aggtagctta accttcggga gggcgctacc act                     1423

 

 

Claims (9)

1.一种粘质沙雷氏菌PS-1菌株（Serratia marcescens），于2013年7月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.7948。

2.根据权利要求1所述粘质沙雷氏菌PS-1菌株，其菌体16SrDNA序列如SEQ ID NO：1所示。

3.权利要求1或2所述粘质沙雷氏菌PS-1菌株的应用，其特征在于，是将所述菌株应用于黄曲条跳甲和/或甜菜夜蛾的生物防治方面。

4.权利要求1或2所述粘质沙雷氏菌PS-1菌株的应用，其特征在于，是将所述菌株的菌体培养上清液应用于甜菜夜蛾的生物防治方面。

5.一种权利要求1或2所述粘质沙雷氏菌PS-1菌株的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1.病原菌的分离   取被粘质沙雷氏菌感染、体色变红而死的黄曲条跳甲幼虫体接种到平板LB琼脂培养基中，倒置于恒温箱中培养，待菌落形成后，挑取深红色菌落用平板划线法分离，重复操作，得到单株菌落，转入试管斜面LB琼脂培养基上，保存备用；

S2.病原菌的复感染  将S1分离到的单菌落菌株接种于装有LB液体培养基的三角瓶中，置于恒温摇床中活化；活化后吸取菌液转接到另一个装有LB液体培养基的三角瓶中，继续培养后，离心弃去上清液，用无菌水洗涤细菌沉淀，加入无菌水，磁力漩涡震荡溶解作为初始菌悬液；将新鲜萝卜块浸入到初始菌悬液中约5～10s，置于通风处晾干表面水分，放入垫有湿润滤纸的培养皿中，培养皿中接入黄曲条跳甲3龄幼虫，保鲜膜封口；24h后，用无菌萝卜块继续饲养，每天更换新鲜萝卜块；3天后，挑取受感染死亡的黄曲条跳甲幼虫，按S1方法分离得到致病PS-1菌株并保存。

6.根据权利要求5所述粘质沙雷氏菌PS-1菌株的制备方法，其特征在于，所述LB琼脂培养基组成为：琼脂15～20g，氯化钠10g，胰蛋白胨10g，酵母浸出粉5g，水1L ，pH7.2。

7.根据权利要求5所述粘质沙雷氏菌PS-1菌株的制备方法，其特征在于，所述LB液体培养基组成为：蛋白胨10 g，酵母浸出粉5 g，氯化钠10 g，水1L ，pH7.2。

8.权利要求5所述方法制备得到的粘质沙雷氏菌PS-1菌株的菌体培养上清液。

9.权利要求8所述粘质沙雷氏菌PS-1菌株的菌体培养上清液在生物防治甜菜夜蛾方面的应用。

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