CN103627660B

CN103627660B - 一株对田间抗Bt小菜蛾有高活性的苏云金芽孢杆菌菌株及应用

Info

Publication number: CN103627660B
Application number: CN201310615455.XA
Authority: CN
Inventors: 张友军; 朱勋; 杨峰山; 王少丽; 吴青君; 谢文; 徐宝云
Original assignee: Institute of Vegetables and Flowers Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Vegetables and Flowers Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2013-11-28
Filing date: 2013-11-28
Publication date: 2016-06-08
Anticipated expiration: 2033-11-28
Also published as: CN103627660A

Abstract

本发明公开了一株对田间抗Bt小菜蛾有高活性的苏云金芽孢杆菌菌株Bacillus？thuringiensis？AHB-5及应用，保藏号：CGMCC？No.8444，该菌携带有杀虫蛋白编码基因cry1Ac、cry2Ab和cry9Ea。该菌株以相对敏感小菜蛾、田间抗Bt小菜蛾、田间抗Cry1Ac毒蛋白小菜蛾为试虫，经毒力生物测定筛选对抗Bt及Cry1Ac毒蛋白小菜蛾有毒力的菌株。利用该菌株生产高效、广谱的杀虫剂，用于防治鳞翅目重要害虫小菜蛾，同时对抗性害虫具有很好的效果，有利于田间抗性小菜蛾的防治，提高了经济价值，且对人、畜及其他动物无害，不污染环境，具有良好经济、生态效益，具有良好的应用推广前景。

Description

一株对田间抗Bt小菜蛾有高活性的苏云金芽孢杆菌菌株及应用

技术领域

本发明涉及一株对田间抗Bt小菜蛾有高活性的苏云金芽孢杆菌BacillusthuringiensisAHB-5菌株，以及该菌株在防治鳞翅目害虫或/和抗Bt鳞翅目害虫中的应用。

背景技术

苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis，简称Bt)是一种从土壤或死亡昆虫体内分离出来的革兰氏阳性细菌。此类菌在芽孢形成时期产生一种或多种杀虫晶体蛋白（InsecticidalCrystalProteins,ICPs，又被称为δ-内毒素)，可对鳞翅目、鞘翅目、半翅目、双翅目、同翅目、膜翅目、直翅目、等翅目、毛翅目、脉翅目、蚤目、缨翅目、食毛目、蜚蠊目、螨类、虱目、吸虫、绦虫、鞭毛虫、变形虫和草履虫等多种昆虫及原生生物产生毒素活性。这种杀虫晶体蛋白对人畜无害，不污染环境，因而Bt在害虫的生物防治中得到了最广泛的应用。该菌菌剂作为喷洒型杀虫剂主要成分的使用时间已经超过50年，是目前世界上用途最广、产量最大的微生物杀虫剂，占微生物杀虫剂总量的90％-95％。

苏云金芽孢杆菌的不同杀虫毒素由不同种类的cry基因控制，各种cry基因已经被成功克隆，并根据不同需要，利用转基因技术转入到不同作物中，用于害虫等有害生物的防治。我国最早用于防治小菜蛾的Bt菌是库斯塔克亚种(B.thuringiensisvar.kurstaki)，其主效成分是cry1Ac基因。目前已发现对小菜蛾Plutellaxylostella(L.)有毒力的基因有：cry1Aa、cry1Ab、cry1Ac、cry1B、cry1C、cry1F、cry2A、cry1I、cry7Ba1和cry9A、cry9B，部分基因已在我国应用。自1996年转Btcry基因作物的种植开始，转Bt基因作物在世界范围内被广泛种植，种植面积逐年增长。据2012年的统计显示，转Bt基因作物的种植面积已增长至17,030万公顷。

苏云金芽孢杆菌菌剂的应用及转Btcry基因作物的种植，在控制田间害虫方面效果显著，有利于作物的产量和质量的提高，同时减少了化学农药的使用，对农林业生产和环境保护发挥了积极的作用。然而苏云金芽孢杆菌制剂和转Bt基因作物广泛应用，也使得部分害虫对Bt产生了一定抗性。目前在田间，已有3种害虫(草地贪夜蛾Spodopterafrugiperda、玉米茎夜蛾Busseolafusca、谷实夜蛾Helicoverpazea)对Bt作物产生了抗性；温室中粉纹夜蛾也已对Bt制剂产生抗性，但小菜蛾是最早在田间对Bt制剂产生抗药性的害虫。从田间采集并结合室内的继续抗性筛选得到了害虫抗性品系，而且目前田间抗性水平仍在继续发展。

1985年McGaughey报道利用Bt粉剂在实验室对印度谷螟Plodiainterpunctella进行抗性筛选得到抗Bt种群，随后国内外学者陆续报道鳞翅目、鞘翅目、双翅目等十余种害虫室内选育也可以使其对Bt产生抗性。目前大多数抗性品系昆虫都是通过实验室的筛选获得，实验室筛选的抗性品种通常基因变化相对有限，不能涵盖所有在大田中出现的抗性基因的可能。Tabashnik等于1989年检测到田间种群对Bt制剂（kurstaki亚种）产生了25倍的抗药性，首次报道了田间小菜蛾对Bt杀虫剂产生了抗药性。Tang等测定弗罗里达州田间小菜蛾对Bt制剂（BtKNRD12）的抗药性大于1500倍。Wright等报道马来西亚田间小菜蛾种群在室内筛选饲养7代后对BtA和BtK制剂的抗药性分别为330倍和160倍。此外，日本、中美洲、墨西哥和印度等国家和地区也有抗Bt小菜蛾的报道。2000年Zhao等报道从美国南卡罗尼那州田间采集的对Cry1C有31倍抗性的小菜蛾抗性品系，在实验室先用Cry1C原毒素继续汰选，然后用表达高剂量的Cry1C毒素的转基因花椰菜汰选，26代后，该品系对Cry1C毒素抗性高达63100倍（2龄幼虫）。

国内，冯夏等报道深圳、东莞地区等供港菜区小菜蛾对Bt的抗药性为17.2-30.2倍。李建洪等通过对深圳、东莞和广州菜区的田间小菜蛾种群检测，发现小菜蛾对苏云金芽孢杆菌标准品Cs3ab-1991的抗药性倍数分别为8.9、6.5、2.1倍。周程爱等报道长沙地区的小菜蛾对Bt的抗药性由1997-1999年的敏感性由1.1-4.1倍发展到2000年的6.2倍的低水平抗药性。余德亿等报道福建地区田间种群的小菜蛾对湖北Bt和福建Bt的抗药性分别由1997年的2.1倍和3.1倍上升到1999年的8.2倍和10.1倍。郭世俭等报道浙江省杭州、萧山、金华、温州四地的小菜蛾对Bt制剂还没有产生抗药性。王崇利等报道广东惠州田间小菜蛾种群对Cry1Ab和Cry1Ac的抗性达到了高抗水平；对Btk制剂的抗性达到了中抗水平；对Cry1Aa和Cry2Aa具有低水平抗性；福建福州、浙江杭州和江苏南京田间小菜蛾种群对Cry1Ab、Cry1Ac具有低至中等水平抗性（8-28倍），对Btk制剂具有低水平抗性（3.5-7倍）。害虫对Bt抗药性的产生，是Bt在农业生产应用中有效性和持效性最大的威胁。

以上可以看出，小菜蛾对Bt产生的抗性问题已经十分突出，因此筛选到对抗Bt小菜蛾高活性的菌株，用于防治抗Bt害虫已迫在眉睫。

发明内容

本发明目的在于提供一株对抗Bt小菜蛾有活性的苏云金芽孢杆菌菌株，该菌株对鳞翅目害虫、抗Bt鳞翅目害虫、抗Cry1Ac毒蛋白鳞翅目害虫及鞘翅目害虫具有毒杀作用，利用该菌株能开发一种广谱、高效且对抗Bt害虫有效的Bt杀虫剂。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术措施：

从非正常饲养小菜蛾幼虫体内分离的一株苏云金芽孢杆菌。用发酵培养基进行发酵，培养至伴孢晶体脱落。对相对敏感小菜蛾、抗Bt小菜蛾及抗Cry1Ac毒蛋白小菜蛾进行生物测定，对上述供试害虫均具有较强杀虫作用。对菌株进行形态学、生理生化特征分析，分析菌株所含的杀虫晶体蛋白基因类型。其命名为苏云金芽孢杆菌BacillusthuringiensisAHB-5，简称Bt.AHB-5。该菌株于2013年11月8日为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC所保藏（保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号），其保藏号为CGMCCNo.8444，经检测存活。

本发明与先有技术相比，具有以下优点：本发明选择了鳞翅目主要害虫（小菜蛾）、为靶标昆虫，同时从田间采集对Bt（Kurstaki亚种）粉剂具抗性的小菜蛾种群并继续汰选得到高抗的抗Bt小菜蛾种群和对Cry1Ac毒蛋白具有高抗的抗Cry1Ac毒蛋白小菜蛾种群，作为靶标昆虫，苏云金芽孢杆菌BacillusthuringiensisAHB-5同时对上述鳞翅目主要害虫及田间抗Bt及Cry1Ac毒蛋白害虫，均具有较强的毒杀作用。含有的杀虫基因组合不同，不同的Bt菌株所含有的Bt杀虫Cry蛋白的种类不同，也相应的对应的杀虫活性有差别，包括杀虫谱，本发明菌株活性较好，对抗Cry1Ac小菜蛾和抗Bt小菜蛾均有明显的活性。利用该菌株生产高效、广谱的杀虫剂，用于防止鳞翅目重要害虫小菜蛾，同时对抗性害虫具有很好的效果，有利于田间抗性小菜蛾的防治，提高了经济价值，且对人、畜及其他动物无害，不污染环境，具有良好经济、生态效益，具有良好的应用推广前景。由于Bt粉剂及转Bt基因作物的广泛种植，小菜蛾对Bt抗性严重，对抗Bt小菜蛾有效的Bt杀虫剂产品尚为见报道。

具体实施方式

下面通过具体实施方式的详细描述来进一步阐明本发明，但并不是对本发明的限制，仅仅作示例说明。

实施例1菌株分离与培养

从田间采集的非正常死亡小菜蛾幼虫进行表面处理，方法如下：用镊子夹住幼虫头部，蘸取95%乙醇灼烧后，放入75%乙醇中2s，再放入3%次氯酸钠溶液中浸泡3min，取出幼虫用无菌水清洗3次。将处理好的虫体放入装有0.5ml无菌水的1.5ml离心管中打碎，制成虫体悬液。取虫体悬液0.1ml加入100ml无菌水中，30℃振荡培养30min，在75-80℃水浴中热处理14-20min将培养液稀释到适当浓度，均匀涂布于分离培养基平板上，置于28-30℃恒温培养箱中培养；培养3-4d后，挑选培养特征类似苏云金杆菌的菌株涂片，用石碳酸复红染色镜检，观察有无芽孢和伴孢晶体。

分离培养基：牛肉膏3g、蛋白胨5g、葡萄糖10g、15~20g琼脂、水1000ml，调pH值至7.0。

发酵培养基：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl10g，水1000ml，pH值7.0。

4、将产生芽孢和伴孢晶体的菌株检出纯化后，接种于发酵培养基中进行摇瓶发酵，至伴孢晶体脱落；

5、取5ml发酵液与50μl5%的Triton100混合均匀（Triton100终浓度为0.05%），采用浸叶法对相对敏感小菜蛾、抗Bt小菜蛾、抗Cry1Ac毒蛋白小菜蛾进行室内毒力测定。具体方法：选老嫩适中的甘蓝叶片洗净晾干，剪成直径2cm大小，放入药液（含Triton100终浓度为0.05%）中，浸泡10s晾干，放入铺有湿润滤纸的平皿中。以无菌水混合Triton100（Triton100终浓度为0.05%）浸泡叶片作为对照。选取2-3龄小菜蛾幼虫，每个处理10头，设4个重复，置（温度25℃、相对湿度65%-70%、光照比L：D=16:8）条件下饲养。3d后观察幼虫死亡情况，计算死亡率。

实施例2菌株的鉴定

根据上述实施方法，得到一株对鳞翅目害虫、抗Bt鳞翅目害虫、抗Cry1Ac毒蛋白鳞翅目害虫及鞘翅目害虫具有毒杀作用的苏云金芽孢杆菌菌株，命名为BacillusthuringiensisAHB-5，该菌株于2013年11月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCCNO.8444。具体鉴定结果如下：

1、苏云金芽孢杆菌BacillusthuringiensisAHB-5的杀虫活性：该菌株在发酵培养基中培养至伴孢晶体脱落，对鳞翅目害虫小菜蛾（Plutellaxylostalla）相对敏感种群的致死中浓度（LC₅₀）为2.94mg/L，对鳞翅目害虫小菜蛾抗Bt种群的致死中浓度（LC₅₀）为5.61mg/L，对鳞翅目害虫小菜蛾抗Cry1Ac毒蛋白种群的致死中浓度（LC₅₀）为5.92mg/L。显示出较强毒杀作用。

2、苏云金芽孢杆菌BacillusthuringiensisAHB-5的形态特征：菌落均呈白色圆形、扁平，表面干燥无光泽，边缘缺刻；在普通LB平板上能生长，为好氧菌；细胞杆状，有鞭毛，革兰氏染色为阳性，且一个营养细胞只有一个芽孢，芽孢为中生、次端生或端生，孢子囊不膨大，有晶体存在。

3、苏云金芽孢杆菌BacillusthuringiensisAHB-5的生理生化特性：

形态特征和生化特性	Bt. AHB-5菌株
		杆状：宽（μm）	1.4-1.9
长（μm）	3.5-4.9
		革兰氏染色	+
芽孢椭圆	+
		圆形	-
内生或偏内生	+
		芽孢囊膨大	-
伴孢晶体	菱形
		生长温度（℃）：最高	41-44
最低	11-16
		运动性	+
菌膜试验Bacteria film test	+
		伏普试验Voges-Prokauer test	+
卵磷脂酶Lecithinas	+
		水杨苷Salicin	-
蔗糖Sucrose	---
		纤维二糖Cellobiose	-++
甘露糖Carbinose	--
		七叶灵Esculin	-
甲基红Methyl Red test	+
		脲酶试验Urease test	+
明胶液化Gelatin Liquefaction	+
		乳糖Lactose	---
山梨醇Sorbitol	--
		果糖Fructose	-++
阿拉伯糖Arabinose	---
		麦芽糖Maltose	++
木糖Xylose	--
		葡萄糖Glucose	-+
几丁质酶chitinase	＋

4、苏云金芽孢杆菌BacillusthuringiensisAHB-5的携带的的杀虫晶体蛋白基因有cry1Ac、cry2Ab和cry9Ea。[x1]

实施例3菌株Bt.AHB-5对敏感小菜蛾的生物测定

一、供试昆虫：

小菜蛾相对敏感种群：在室内用干净无虫的萝卜苗和甘蓝苗饲养，期间从未施用过任何杀虫剂。小菜蛾种群在室内进行隔离饲养，将蛹放入成虫饲养笼中（R=10cm，L=40cm），饲养笼四周以80目的纱网包围，成虫羽化后，笼内挂浸过10%蜂蜜糖水的脱脂棉球一个，为成虫补充营养，让其在甘蓝苗上产卵，卵孵化后再转入新鲜的甘蓝苗上饲养。饲养温度是25±1℃，相对湿度为60%-70%，光周期为光照：黑暗=16h：8h。

二、菌株活性测定

挑单菌落接种于发酵培养基中，在30℃恒温摇床上200rpm培养72h。离心收集孢晶混合物，洗涤后真空抽干，得到干粉混合物。称取孢晶混合物，加入定量无菌水配成1000mg/L的溶液或悬浮液，置4℃备用。

取10ml孢晶混合液与100μl5%的Triton100混合均匀（Triton100终浓度为0.05%），选老嫩适中的甘蓝叶片洗净晾干，剪成直径2cm大小，放入孢晶悬液（含Triton100终浓度为0.05%）中，浸泡20s晾干，放入铺有湿润滤纸的平皿中。以无菌水混合Triton100（Triton100终浓度为0.05%）浸泡叶片作为对照。选取2龄初小菜蛾幼虫，每个处理10头，设4个重复，25℃下饲养3d。记录幼虫死亡情况，计算死亡率和校正死亡率。

三、LC₅₀测定

通过预试验测定小菜蛾在90%和10%死亡率的孢晶混合物的浓度，在其范围内设计5-7个浓度梯度，每个浓度4个重复，每重复10头2龄初小菜蛾幼虫，25℃饲养3d，记录幼虫死亡情况，利用POLO软件计算菌株的LC₅₀值。

四、结果

经过测定，苏云金芽孢杆菌Bt.AHB-5对鳞翅目害虫小菜蛾（Plutellaxylostalla）相对敏感种群的致死中浓度（LC₅₀）为2.94mg/L。

实施例4菌株Bt.AHB-5对抗Bt小菜蛾的生物测定

一、供试昆虫：

小菜蛾抗Bt种群：采自上海田间，在室内进行隔离饲养，将蛹放入成虫饲养笼中（R=10cm，L=40cm），饲养笼四周以80目的纱网包围，成虫羽化后，笼内挂浸过10%蜂蜜糖水的脱脂棉球一个，为成虫补充营养，让其在甘蓝苗上产卵，卵孵化后再转入新鲜的甘蓝苗上饲养。饲养温度是25±1℃，相对湿度为60%-70%，光周期为光照：黑暗=16h：8h。利用Bt（Kurstaki亚种）制剂进行抗性选育。对Bt粉剂已有近千倍抗性。

二、菌株活性测定

三、LC₅₀测定

四、结果

经过测定，苏云金芽孢杆菌Bt.AHB-5对鳞翅目害虫小菜蛾（Plutellaxylostalla）抗Bt种群的致死中浓度（LC₅₀）为5.61mg/L。

实施例5菌株Bt.AHB-5对抗Cry1Ac毒蛋白小菜蛾的生物测定

一、供试昆虫：

小菜蛾抗Cry1Ac毒蛋白种群：采自深圳田间，在养虫室内，利用甘蓝苗结合养虫纱笼法在室内饲养，将蛹放入成虫饲养笼中（R=10cm，L=40cm），笼四周以80目的纱网包围，成虫羽化后，笼内悬挂浸过10%蜂蜜糖水的脱脂棉球一个，为成虫补充营养，让其在甘蓝苗上产卵，卵孵化后再转入新鲜的甘蓝苗上饲养。饲养温度是25±1℃，相对湿度为60%-70%，光周期为光照：黑暗=16h：8h。其间只施用Cry1Ac毒蛋白进行汰选，不施用其它任何药剂。其对Cry1Ac毒蛋白的LC₅₀大于5000mg/L，抗性高于5000倍。

二、菌株活性测定

三、LC₅₀测定

四、结果

经过测定，苏云金芽孢杆菌Bt.AHB-5对鳞翅目害虫小菜蛾（Plutellaxylostalla）抗Cry1Ac毒蛋白种群的致死中浓度（LC₅₀）为5.92mg/L。

利用PCR的方法对菌株所含的基因型进行检查得到，这个在业内是比较普遍的方法。

Claims

1.一株苏云金芽孢杆菌（Bacillusthuringiensis），保藏号：CGMCCNO.8444。

2.如权利要求1所述的苏云金芽孢杆菌在防治鳞翅目害虫中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于：所述鳞翅目害虫是抗Bt鳞翅目害虫。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述鳞翅目害虫是小菜蛾。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于：所述小菜蛾是抗Bt小菜蛾。