CN110616267B

CN110616267B - 基于APN基因的小菜蛾对Bt杀虫蛋白Cry1Ac抗性的检测方法及其试剂盒

Info

Publication number: CN110616267B
Application number: CN201910684686.3A
Authority: CN
Inventors: 郭兆将; 康师; 周君雷; 龚莉君; 孙丹; 覃舰莹; 郭乐; 朱流红; 白杨; 张竹竹; 叶凡; 张友军
Original assignee: Institute of Vegetables and Flowers Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Vegetables and Flowers Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2019-07-26
Filing date: 2019-07-26
Publication date: 2022-08-19
Anticipated expiration: 2039-07-26
Also published as: CN110616267A

Abstract

本发明公开了一种基于四个APN基因的小菜蛾对Bt杀虫蛋白Cry1Ac抗性的实时荧光定量PCR检测方法及其试剂盒，该试剂盒包含特异引物序列：正、反向引物如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示；或如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示；或如SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9所示；或如SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12所示。本发明方法检测周期短，检测数量大，需人力及样品量少，且灵敏度高、特异性强、准确可靠，能有效的检测小菜蛾对Bt杀虫蛋白Cry1Ac的抗性，适合于小菜蛾对Bt杀虫蛋白Cry1Ac抗性的早期快速诊断，可用于田间小菜蛾Bt杀虫蛋白Cry1Ac抗性的实时监控和预警预报，应用前景广泛。

Description

基于APN基因的小菜蛾对Bt杀虫蛋白Cry1Ac抗性的检测方法及其试剂盒

技术领域

本发明涉及生物领域，涉及小菜蛾对Bt杀虫蛋白Cry1Ac抗性的实时荧光定量PCR检测方法及其试剂盒。

背景技术

小菜蛾Plutella xylostella (L.)，属于鳞翅目(Lepidoptera)菜蛾科(Plutellidae)，是一种十字花科蔬菜作物重要害虫，广泛分布于世界各地。小菜蛾主要以幼虫取食寄主植物叶片造成危害，大大降低了蔬菜的产量和质量，个别田块严重发生时可导致绝产。据报道，小菜蛾在全世界范围内每年造成约40-50亿美元的经济损失。目前，田间防治小菜蛾的主要措施仍是叶面喷施杀虫剂。但是小菜蛾繁殖力强和世代周期短的特点使其能对各种杀虫剂快速进化产生抗药性，其中包括生物源农药苏云金芽胞杆菌。

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis, Bt)属于革兰氏阳性杆状细菌，它在产孢过程中能产生多种杀虫蛋白从而高效专一的杀死不同靶标害虫。Bt因其杀虫谱广、高效专一且对人畜环境无害成为世界上产量最大和用途最广的微生物杀虫剂，同时多个编码Bt杀虫蛋白的基因被转入到多种重要经济作物中。多年来，Bt制剂和Bt作物在害虫防治和环境保护中发挥了极其重要的作用。但是Bt的大量和不合理应用导致了害虫对Bt产生抗性。目前在世界范围内已有9种害虫被报道在田间对Bt制剂或Bt作物产生抗性。其中，小菜蛾是世界上第一个被报道在田间产生Bt抗性的害虫，加之小菜蛾基因组测序的完成和公布，使其成为害虫Bt抗性分子机制研究的模式昆虫。因此，小菜蛾Bt抗性机制的研究和抗性关键基因的鉴定为其抗药性检测、监测及预警提供理论支持，同时对Bt的可持续应用以及害虫综合治理具有重要的理论和实践意义。

实时荧光定量PCR (Real Time-quantitative Polymerase Chain Reaction,RT-qPCR)，是在普通PCR反应体系中加入荧光染料或者探针，利用荧光信号对整个PCR反应扩增过程进行实时监测和连续分析，最终依据PCR扩增指数期荧光信号达到所设定阈值所需的循环数Ct值与该模板的起始拷贝数之间的线性关系对未知模板进行定量。目前实时荧光定量PCR不仅广泛应用于基础科学研究、疾病诊断以及食品检疫等领域，同时在昆虫Bt抗药性靶标基因转录水平表达量的检测中大规模应用。实时荧光定量PCR以其特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、操作简便、高通量等优点，相较于周期长、灵敏度低、操作繁琐的小菜蛾毒力生物测定等常规性检测方法而言，在抗药性检测上显示出强大的应用前景。

氨肽酶N (Aminopeptidase N, APN)，是一种外肽酶，属于锌结合的金属蛋白酶超家族，具有催化肽链氨基端肽键水解的功能，在动植物中发挥多种重要的生理功能。在鳞翅目幼虫中肠中，除了具有消化食物中蛋白的功能，APN还作为Bt杀虫蛋白的关键受体基因得到广泛研究。目前小菜蛾、烟草天蛾、棉铃虫、甜菜夜蛾等昆虫的APN被鉴定为Bt杀虫蛋白的受体，而APN基因的突变或者表达量的变化可以导致害虫的Bt抗性。这就为害虫田间检测提供了很好的靶标基因。根据本实验室敏感和抗性种群中肠转录组和最近的实时荧光定量PCR检测以及基因功能研究发现，APN家族中APN1和APN3a基因表达量下调以及APN5和APN6基因表达量上调与Bt杀虫蛋白Cry1Ac抗性密切相关，那么利用实时荧光定量PCR技术检测这4个APN基因表达量差异表达水平则可以作为一种检测小菜蛾对Bt Cry类杀虫蛋白抗性的有效方法。不容置疑的是，小菜蛾早期抗药性分子检测与诊断技术的开发将为其抗药性风险评估和抗性治理措施评价提供技术手段，同时在减少害虫危害、保护生态环境和保障人类饮食结构等方面具有重要的意义。因此，建立一种高效、快速、准确以及简便的小菜蛾Bt抗性检测手段就显得尤为迫切，而为了更好的监测田间小菜蛾对Bt杀虫蛋白Cry1Ac的抗性情况，开发出更有效的小菜蛾Bt杀虫蛋白Cry1Ac抗性检测手段，我们开展了该研究内容。

发明内容

本发明针对现有小菜蛾Bt杀虫蛋白Cry1Ac抗性检测技术中存在的检测周期长、灵敏度低、重复性差及材料要求高等问题，通过特异性实时荧光定量PCR引物筛选及其反应体系的优化等步骤，建立一种快速准确的实时荧光定量PCR分子检测方法及简便、准确、快速、高效的检测小菜蛾Bt抗性的检测试剂盒，为小菜蛾Bt抗性有效检测提供有效工具。

本发明的一个目的是提供了一种用于检测小菜蛾对Bt杀虫蛋白Cry1Ac抗性的特异性PCR引物对，所述引物对的序列：正向引物如SEQ ID NO. 2所示，反向引物如SEQ IDNO. 3所示；或正向引物如SEQ ID NO. 5所示，反向引物如SEQ ID NO. 6所示；或正向引物如SEQ ID NO. 8所示，反向引物如SEQ ID NO. 9所示；或正向引物如SEQ ID NO. 11所示，反向引物如SEQ ID NO. 12所示。

所述特异性引物对包括以小菜蛾四龄幼虫中肠 APN1、APN3a、APN5或APN6基因为靶目标序列设计得到的靶标基因特异性引物对以及本发明人实验室已报道稳定表达的内参基因RPL32特异性引物对序列，所述小菜蛾APN1、APN3a、APN5或APN6基因，其基因序列分别为SEQ ID NO. 13、SEQ ID NO. 14、SEQ ID NO. 15、SEQ ID NO. 16所示序列；靶目标序列分别为SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 7、SEQ ID NO. 9所示序列。

本发明还提供一种用于检测小菜蛾对Bt杀虫蛋白Cry1Ac抗性的PCR检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包含所述的特异性PCR引物对。

进一步地，本试剂盒中还包括本发明人实验室已发表的以小菜蛾持家基因核糖体蛋白RPL32基因的保守片段区为靶目标序列设计得到的内参基因RPL32特异性引物序列（正向引物：5′-CCAATTTACCGCCCTACC-3′；反向引物：5′-TACCCTGTTGTCAATACCTCT-3′），用于校正样品间实验误差。本试剂盒中含有的特异性引物，逆转录酶，DNase，RNase抑制剂，dNTP混合物，MgCl₂溶液，热启动Taq DNA聚合酶，荧光定量反应液，Buffer缓冲液，RNase-free水等。此外，本试剂盒还应包括符合该试剂盒要求的阳性对照及阴性对照样品。

本发明还提供一种检测小菜蛾对Bt杀虫蛋白Cry1Ac抗性的PCR检测方法，具体包括以下步骤：

(1)提取待测小菜蛾的RNA样品，并反转录为cDNA模板；

(2)将所述cDNA模板加入到含有上述特异性引物对的PCR反应液中得到PCR反应体系；

(3)进行实时荧光定量PCR检测；

所述实时荧光定量PCR检测的扩增程序为：95 ℃预变性15 min，95 ℃变性15sec，50-55 ℃（APN1和APN5基因为55 ℃；APN3a为50 ℃；APN6为53 ℃）退火30 sec，72 ℃延伸32 sec，40个循环。

PCR过程完成后，按0.1 ℃•s^-1的升温速率从72 ℃升至95 ℃进行熔解曲线的分析验证，具体过程为：95 ℃进行15 s，然后60 ℃进行1 min，95 ℃进行30 s，最后60 ℃进行15 s。

所述的方法，所述待测的小菜蛾RNA样品为小菜蛾四龄幼虫中肠RNA样品。

所述的方法，本发明使用ABI Prism 7500实时荧光定量PCR仪进行检测。

本发明使用ABI Prism 7500实时荧光定量PCR仪进行检测。

ABI Prism 7500实时荧光定量PCR仪进行结果分析时，基线设置取3-15个循环的荧光信号。为便于比较，待测样品、阴性对照及阳性对照的所有扩增曲线的阈值均设定为0.050153 (位于扩增曲线对数期中间位置，其它仪器基线和阈值设定可根据仪器作相应调整)。

对上述步骤中实时荧光定量PCR反应产物进行荧光定量检测，在特定的波长条件下，根据荧光检测的抗敏样品间各自靶标基因APN1、APN3a、APN5或APN6与内参基因RPL32之间的Ct值差值（即△Ct值）来判断结果。对于APN1基因，若所述待测小菜蛾中肠样品产生典型的“S”型扩增曲线及单峰熔解曲线，且△Ct值≥ 11，则说明所述小菜蛾待测样品对Bt杀虫蛋白Cry1Ac产生抗性；若△Ct值≤ 10，则说明待测小菜蛾样品未对Bt杀虫蛋白Cry1Ac产生抗性。对于APN3a基因，若所述待测小菜蛾中肠样品产生典型的“S”型扩增曲线及单峰熔解曲线，且△Ct值≥ 3，则说明所述小菜蛾待测样品对Bt杀虫蛋白Cry1Ac产生抗性；若△Ct值≤ 2，则说明待测小菜蛾样品未对Bt杀虫蛋白Cry1Ac产生抗性。对于APN5和APN6基因，若所述待测小菜蛾中肠样品产生典型的“S”型扩增曲线及单峰熔解曲线，且△Ct值≤ 1，则说明所述小菜蛾待测样品对Bt杀虫蛋白Cry1Ac产生抗性；若△Ct ≥ 2值，则说明待测小菜蛾样品未对Bt杀虫蛋白Cry1Ac产生抗性。对于所有APN基因，若△Ct值位于两者中间，则建议重做，样品对Bt杀虫蛋白抗性产生与否视重做结果而定。

本发明系选择小菜蛾中肠APN1、APN3a、APN5或APN6基因的保守片段区为靶标序列，根据该基因的特点和荧光定量PCR引物设计的原则，设计了一对特异性引物，与本发明人实验室已报道的内参基因RPL32特异性引物共同建立了一种用于小菜蛾Bt杀虫蛋白Cry1Ac抗性检测的实时荧光定量PCR试剂盒及其检测方法。与生物测定等常规性检测方法相比，本发明所提供的小菜蛾Bt杀虫蛋白抗性检测实时荧光定量PCR检测试剂盒及其使用方法，具有如下优点及效果：

(1)检测周期短。传统的生物测定方法需要经过药剂配置、试虫选取、试虫死亡率检测等繁琐过程，至少需要48小时；而本方法仅需3小时完成，且一次可同时检测多个样品，适合大批量样品的快速检测。

(2)特异性强。本发明利用APN1、APN3a、APN5或APN6基因为靶序列，设计了一对特异性引物，对靶序列进行特异性扩增，通过将待测样品和阴性对照间APN1、APN3a、APN5或APN6表达量差异比较即可测定待测样品是否产生抗性；而传统的生物测定方法则是通过不同浓度梯度Bt杀虫蛋白Cry1Ac处理后试虫的死亡率判断小菜蛾是否对Bt杀虫蛋白Cry1Ac产生抗性，与基因检测方法相比特异性差得多。

(3)灵敏度和准确度高。本发明通过实时荧光定量PCR技术对整个PCR特异性扩增过程进行监控，对靶标基因APN1、APN3a、APN5或APN6表达量进行确定，与传统粗略及重复性差的生物测定方法相比，更加灵敏和准确。

(4)材料要求少。小菜蛾传统的生物测定中一次测定至少需要200头标准试虫，而且试虫的饲养及挑取均需投入一定的人力、物力和财力。本发明方法则只需要少量试虫即可进行，甚至可以单头检测。

综上所述，本发明的方法可替代传统的生物测定方法，它可以准确、简便、快速、特异的检测出供试小菜蛾是否具有Bt抗性，对田间小菜蛾Bt抗性的监控及预警具有重要意义。本发明所提供的小菜蛾对Bt杀虫蛋白Cry1Ac抗性的PCR检测方法，准确可靠，快速简便，灵敏度高，特异性强，需人力及样品量少，检测数量大，因而能有效的检测小菜蛾对Bt杀虫蛋白的抗性，适合于田间小菜蛾对Bt杀虫蛋白Cry1Ac抗性的早期快速诊断，同时可用于田间小菜蛾Bt杀虫蛋白Cry1Ac抗性的实时监控和预警预报，应用前景广泛。

附图说明

图1是本发明中所用特异性引物对扩增小菜蛾幼虫中肠APN1基因cDNA片段序列(157-bp)，其中斜体加下划线为扩增时使用的引物，分别是正向引物(APN1-F)和反向引物(APN1-R)，箭头标明了上下游引物的方向。

图2是使用标准品梯度稀释进行实时荧光定量PCR所得到的标准扩增曲线。其中，横坐标代表循环数(Cycle)，纵坐标代表第n次PCR循环时的荧光信号强度(Rn)，图中平行且远离横坐标的直线代表荧光阈值，字母代表样品cDNA的5个2×梯度稀释浓度。

图3是根据图2得出的数据所绘制出的标准曲线。其中，横坐标代表标准样品cDNA浓度的对数值，纵坐标代表循环阈值即Ct值。

图4为实例1的检测小菜蛾Bt杀虫蛋白Cry1Ac抗性的实时荧光定量PCR检测结果。其中，A为对Bt杀虫蛋白Cry1Ac敏感小菜蛾种群DBM1Ac-S的4龄幼虫中肠cDNA样品；B为对Bt杀虫蛋白Cry1Ac产生抗性的小菜蛾种群SZ-R的4龄幼虫中肠cDNA样品。

图5是实施例2的检测小菜蛾Bt杀虫蛋白Cry1Ac抗性的实时荧光定量PCR检测结果。其中，A为实施例1中对Bt敏感的小菜蛾种群DBM1Ac-S的4龄幼虫中肠cDNA阴性对照样品；B为实施例1中对Bt杀虫蛋白Cry1Ac产生抗性的小菜蛾种群SZ-R的4龄幼虫中肠cDNA阳性对照样品；C为对Bt杀虫蛋白Cry1Ac产生抗性的近等基因系小菜蛾种群DBM1Ac-R的4龄幼虫中肠cDNA待测样品；D为对Bt杀虫蛋白Cry1Ac产生抗性的小菜蛾种群NIL-R的4龄幼虫中肠cDNA待测样品；E为对Btk制剂产生抗性的小菜蛾种群SH-R的4龄幼虫中肠cDNA待测样品。

图6是本发明中所用特异性引物对扩增小菜蛾幼虫中肠APN3a基因cDNA片段序列(110-bp)，其中斜体加下划线为扩增时使用的引物，分别是正向引物(APN3a-F)和反向引物(APN3a-R)，箭头标明了上下游引物的方向。

图7是使用标准品梯度稀释进行实时荧光定量PCR所得到的标准扩增曲线。其中，横坐标代表循环数(Cycle)，纵坐标代表第n次PCR循环时的荧光信号强度(Rn)，图中平行且远离横坐标的直线代表荧光阈值，字母代表样品cDNA的5个2×梯度稀释浓度。

图8是根据图7得出的数据所绘制出的标准曲线。其中，横坐标代表标准样品cDNA浓度的对数值，纵坐标代表循环阈值即Ct值。

图9为实例3的检测小菜蛾Bt杀虫蛋白Cry1Ac抗性的实时荧光定量PCR检测结果。其中，A为对Bt杀虫蛋白Cry1Ac敏感小菜蛾种群DBM1Ac-S的4龄幼虫中肠cDNA样品；B为对Btk制剂产生抗性的小菜蛾种群SH-R的4龄幼虫中肠cDNA样品。

图10是实施例4的检测小菜蛾Bt杀虫蛋白Cry1Ac抗性的实时荧光定量PCR检测结果。其中，A为实施例3中对Bt敏感的小菜蛾种群DBM1Ac-S的4龄幼虫中肠cDNA阴性对照样品；B为实施例3中对Btk制剂产生抗性的小菜蛾种群SH-R的4龄幼虫中肠cDNA阳性对照样品；C为对Bt杀虫蛋白Cry1Ac产生抗性的近等基因系小菜蛾种群DBM1Ac-R的4龄幼虫中肠cDNA待测样品；D为对Bt杀虫蛋白Cry1Ac产生抗性的小菜蛾近等基因系种群NIL-R的4龄幼虫中肠cDNA待测样品；E为对Bt杀虫蛋白Cry1Ac产生抗性的小菜蛾种群SZ-R的4龄幼虫中肠cDNA待测样品。

图11是本发明中所用特异性引物对扩增小菜蛾幼虫中肠APN5基因cDNA片段序列(160-bp)，其中斜体加下划线为扩增时使用的引物，分别是正向引物(APN5-F)和反向引物(APN5-R)，箭头标明了上下游引物的方向。

图12是使用标准品梯度稀释进行实时荧光定量PCR所得到的标准扩增曲线。其中，横坐标代表循环数(Cycle)，纵坐标代表第n次PCR循环时的荧光信号强度(Rn)，图中平行且远离横坐标的直线代表荧光阈值，字母代表样品cDNA的5个2×梯度稀释浓度。

图13是根据图12得出的数据所绘制出的标准曲线。其中，横坐标代表标准样品cDNA浓度的对数值，纵坐标代表循环阈值即Ct值。

图14为实例5的检测小菜蛾Bt杀虫蛋白Cry1Ac抗性的实时荧光定量PCR检测结果。其中，A为对Bt杀虫蛋白Cry1Ac敏感小菜蛾种群DBM1Ac-S的4龄幼虫中肠cDNA样品；B为对Bt杀虫蛋白Cry1Ac产生抗性的小菜蛾种群SZ-R的4龄幼虫中肠cDNA样品。

图15是实施例6的检测小菜蛾Bt杀虫蛋白Cry1Ac抗性的实时荧光定量PCR检测结果。其中，A为实施例5中对Bt敏感的小菜蛾种群DBM1Ac-S的4龄幼虫中肠cDNA阴性对照样品；B为实施例5中对Bt杀虫蛋白Cry1Ac产生抗性的小菜蛾种群SZ-R的4龄幼虫中肠cDNA阳性对照样品；C为对Btk制剂产生抗性的小菜蛾种群SH-R的4龄幼虫中肠cDNA待测样品；D为对Bt杀虫蛋白Cry1Ac产生抗性的近等基因系小菜蛾种群DBM1Ac-R的4龄幼虫中肠cDNA待测样品；E为对Bt杀虫蛋白Cry1Ac产生抗性的小菜蛾种群NIL-R的4龄幼虫中肠cDNA待测样品。

图16是本发明中所用特异性引物对扩增小菜蛾幼虫中肠APN6基因cDNA片段序列(146-bp)，其中斜体加下划线为扩增时使用的引物，分别是正向引物(APN6-F)和反向引物(APN6-R)，箭头标明了上下游引物的方向。

图17是使用标准品梯度稀释进行实时荧光定量PCR所得到的标准扩增曲线。其中，横坐标代表循环数(Cycle)，纵坐标代表第n次PCR循环时的荧光信号强度(Rn)，图中平行且远离横坐标的直线代表荧光阈值，字母代表样品cDNA的5个2×梯度稀释浓度。

图18是根据图17得出的数据所绘制出的标准曲线。其中，横坐标代表标准样品cDNA浓度的对数值，纵坐标代表循环阈值即Ct值。

图19为实例7的检测小菜蛾Bt杀虫蛋白Cry1Ac抗性的实时荧光定量PCR检测结果。其中，A为对Bt杀虫蛋白Cry1Ac敏感小菜蛾种群DBM1Ac-S的4龄幼虫中肠cDNA样品；B为对Bt杀虫蛋白Cry1Ac产生抗性的小菜蛾种群SZ-R的4龄幼虫中肠cDNA样品。

图20是实施例8的检测小菜蛾Bt杀虫蛋白Cry1Ac抗性的实时荧光定量PCR检测结果。其中，A为实施例7中对Bt敏感的小菜蛾种群DBM1Ac-S的4龄幼虫中肠cDNA阴性对照样品；B为实施例7中对Bt杀虫蛋白Cry1Ac产生抗性的小菜蛾种群SZ-R的4龄幼虫中肠cDNA阳性对照样品；C为对Btk制剂产生抗性的小菜蛾种群SH-R的4龄幼虫中肠cDNA待测样品；D为对Bt杀虫蛋白Cry1Ac产生抗性的近等基因系小菜蛾种群DBM1Ac-R的4龄幼虫中肠cDNA待测样品；E为对Bt杀虫蛋白Cry1Ac产生抗性的小菜蛾种群NIL-R的4龄幼虫中肠cDNA待测样品。

具体实施方式

以下结合具体实例对本发明做进一步描述与说明，但本发明的保护范围并不仅限于此。

实验前材料样品准备：

(1)小菜蛾Bt杀虫蛋白敏感种群(DBM1Ac-S)：该小菜蛾种群在中国农业科学院蔬菜花卉研究所昆虫组昆虫饲养室内使用无虫甘蓝苗和萝卜苗饲养法继代饲养至今，期间从未接触过任何杀虫剂，对Bt制剂及Cry1Ac毒素敏感。

(2)小菜蛾Bt杀虫蛋白Cry1Ac抗性种群(DBM1Ac-R)：该小菜蛾种群在中国农业科学院蔬菜花卉研究所昆虫组昆虫饲养室内使用无虫甘蓝苗和萝卜苗饲养法连续饲养至今。同时在继代饲养期间，在3龄幼虫期使用Bt Cry1Ac原毒素进行抗性汰选和维持。

(3)小菜蛾Bt杀虫蛋白Cry1Ac抗性近等基因系种群(NIL-R)：该种群利用DBM1Ac-S和DBM1Ac-R两种群进行连续6代的杂交和回交，其后代连续使用Bt Cry1Ac原毒素汰选，成功建立了与DBM1Ac-S相对应的Bt Cry1Ac高抗小菜蛾近等基因系NIL-R种群。之后该种群在中国农业科学院蔬菜花卉研究所昆虫组昆虫饲养室内使用无虫甘蓝苗和萝卜苗饲养法连续饲养至今。在继代饲养期间，在3龄幼虫期使用Bt Cry1Ac原毒素进行抗性汰选和维持。

(4)深圳汰选种群(SZ-R)：该种群于2003年采自广东省深圳地区的甘蓝田中，之后在中国农业科学院蔬菜花卉研究所昆虫组昆虫饲养室内使用无虫甘蓝苗和萝卜苗饲养法连续饲养至今，同时在继代饲养期间，在3龄幼虫时期使用Bt Cry1Ac原毒素进行抗性汰选和维持。

(5)上海汰选种群(SH-R)：该种群于2005年采自上海市郊区的甘蓝田中，之后在中国农业科学院蔬菜花卉研究所昆虫组昆虫饲养室内使用无虫甘蓝苗和萝卜苗饲养法连续饲养至今，在继代饲养期间，在3龄幼虫期使用Btk制剂（16000 IU/mg的可湿性粉剂）进行抗性汰选和维持。

以上所用的5个种群：小菜蛾Bt杀虫蛋白敏感种群(DBM1Ac-S)、小菜蛾Bt杀虫蛋白Cry1Ac抗性种群(DBM1Ac-R)、小菜蛾Bt杀虫蛋白Cry1Ac抗性近等基因系种群(NIL-R)、深圳汰选种群(SZ-R)和上海汰选种群(SH-R)。

上述五个小菜蛾种群均在养虫室内进行隔离饲养，首先将蛹放入成虫饲养笼中（大小视蛹量而定），笼四周以80目的纱网包围；待到成虫羽化后，笼内挂浸过10%蜂蜜水的脱脂棉球一个，为成虫补充营养；最后使用新鲜的无虫甘蓝苗接孵化后的幼虫进行继代饲养。饲养温度是25 ± 1 ℃，相对湿度为65%左右，光周期为光照：黑暗=16h : 8h。

实施例1

利用实时荧光定量PCR技术对DBM1Ac-S及SZ-R的4龄幼虫中肠cDNA样品的检测及本检测试剂盒和其使用方法的建立。

1.以小菜蛾中肠APN1基因为靶序列(SEQ ID NO. 1)，根据实时荧光定量PCR设计的原则，设计特异性荧光定量引物如下：

正向引物(qAPN1-F)：5′- TCACTGAGTCCCATCCCA -3′(SEQ ID NO. 2)

反向引物(qAPN1-R)：5′- TGCCAGACGGCACATTTT -3′(SEQ ID NO. 3)

该特异性引物对扩增APN1片段为157bp（请参见图1），同时使用本实验室已报道的RPL32特异性引物对扩增该基因保守区域片段大小为120bp。两个扩增片段经测序验证和序列比对后确认是对应基因内相应序列。

2.提取两种群中肠RNA样品，并反转录为cDNA模板，在包括步骤1所述的特异性引物的实时荧光定量PCR反应体系内进行反应；

(1)小菜蛾中肠RNA提取步骤如下：

取两种群四龄幼虫，使用解剖镊冰上解剖中肠，并使用0.7% NaCl溶液中清洗干净。

②将中肠组织放入玻璃匀浆器内，并向匀浆器中加入l ml的Trizol试剂充分研磨匀浆，匀浆后将液体倒入1.5 ml离心管内，冰上放置5 min。

③向离心管内加入300 μl氯仿，剧烈震荡15 s，冰上放置5 min，4 ℃条件下12000rpm离心10 min。

④吸取上清于新的离心管中，加入400 μl异丙醇，轻轻颠倒混匀，冰上静置10min，4 ℃条件下12000 rpm离心10 min。

⑤弃上清，加入1 ml 75%乙醇洗涤沉淀。4 ℃条件下8000 rpm离心5 min。

⑥ RNA自然干燥后，加入50 μl水溶解，-80 ℃保存。测定OD₂₆₀/OD₂₈₀值，同时电泳检测RNA是否降解，选择合适的条件和试剂进行反转录实验或者-80 ℃保存备用。

(2)反转录合成cDNA模板

下面以日本TaKaRa公司去基因组的PrimeScript RT试剂盒为例，实验过程如下：

使用前按照说明书将试剂盒各组分解冻，震荡并离心混匀。

②去除基因组DNA反应：

表1

反转录反应（冰上进行）：

表2

(3)实时荧光定量PCR标准曲线的建立：

将样品cDNA模板标准品依次进行5个梯度2倍稀释，稀释倍数依次为1:1，1:2，1:4，1:8和1:16，然后采用SYBR Green I嵌合荧光法进行实时荧光定量PCR：

荧光定量PCR反应体系20 μl组成如下：

表3

*该产品为天根生化科技(北京)有限公司SuperReal PreMix Plus (SYBR Green)试剂盒。

荧光定量PCR反应条件为：

95 ℃预变性15 min，95 ℃变性15 sec，55 ℃退火30 sec，72 ℃延伸32 sec，40个循环。PCR过程完成后，按0.1 ℃•s^-1的升温速率从72 ℃升至95 ℃进行熔解曲线的分析验证，具体过程为：95 ℃进行15 s，然后60 ℃进行1 min，95 ℃进行30 s，最后60 ℃进行15 s。最终得到的荧光定量标准扩增曲线如图2所示；其中，横坐标代表循环数(Cycle)，纵坐标代表第n次PCR循环时的荧光信号强度(Rn)，图中平行且远离横坐标的直线代表荧光阈值，A、B、C、D、E字母代表样品cDNA的5个稀释浓度。

最终得到的标准曲线如图3所示；其中，横坐标代表标准样品cDNA浓度的对数值，纵坐标代表循环阈值即Ct值。

(4)实时荧光定量PCR反应过程：

实时荧光定量PCR反应过程的体系及条件如上面步骤(3)所述。

3. 检测

本发明使用ABI Prism 7500实时荧光定量PCR仪进行检测。

4. 结果分析

ABI Prism 7500实时荧光定量PCR仪进行结果分析时，基线设置取3-15个循环的荧光信号。为便于比较，待测样品（供试小菜蛾种群4龄幼虫中肠cDNA样品）、阴性对照（对Bt杀虫蛋白敏感的小菜蛾种群DBM1Ac-S的4龄幼虫中肠cDNA样品）及阳性对照（对Bt杀虫蛋白Cry1Ac产生抗性的小菜蛾种群SZ-R的4龄幼虫中肠cDNA样品）的所有扩增曲线的阈值均设定为0.050153 (位于扩增曲线对数期中间位置，其它仪器基线和阈值设定可根据仪器作相应调整)。

对上述步骤中荧光定量PCR反应产物进行实时荧光定量检测，如图4中所示，在特定的波长条件下，根据荧光检测的抗敏样品间各自靶标基因APN1与内参基因RPL32之间的Ct值差值（即△Ct值）判断结果，可知两样品产生了典型的“S”型扩增曲线，且DBM1Ac-S的样品的△Ct值为9.16 ± 0.18 (SEM)，SZ-R的样品的△Ct值为11.33 ± 0.32 (SEM)。通过统计学分析，两者之间的表达量差异达到了极显著水平，由此，通过Bt抗敏样品间该基因的表达量差异可知，可以很明显的区分出两者，那么区分标准可初步设定为：△Ct值≥ 11，则说明待测样品已对Bt杀虫蛋白产生抗性；若△Ct值≤ 10，则说明待测样品为敏感种群，尚未对Bt杀虫蛋白产生抗性；若△Ct值位于两者中间，则建议重做，样品对Bt杀虫蛋白抗性产生与否视重做结果而定。

实施例2

通过其他三个Bt抗性小菜蛾种群DBM1Ac-R，NIL-R及SH-R验证实施例1中的试剂盒及检测方法的可用性，具体实验过程如实施例1所示。

最终的实时荧光定量PCR反应检测结果如图5中所示，其中，A为实施例1中对Bt杀虫蛋白敏感的小菜蛾种群DBM1Ac-S的4龄幼虫中肠cDNA阴性对照样品；B为实施例1中对Bt杀虫蛋白Cry1Ac产生抗性的小菜蛾种群SZ-R的4龄幼虫中肠cDNA阳性对照样品；C为对Bt杀虫蛋白Cry1Ac产生抗性的小菜蛾种群DBM1Ac-R的4龄幼虫中肠cDNA待测样品； D为对Bt杀虫蛋白Cry1Ac产生抗性的小菜蛾近等基因系种群NIL-R的4龄幼虫中肠cDNA待测样品；E为对Btk产生抗性的小菜蛾种群SH-R的4龄幼虫中肠cDNA待测样品。

在特定的波长条件下，根据荧光检测的抗敏样品间各自△Ct值判断结果，可知两样品产生了典型的“S”型扩增曲线，且DBM1Ac-R样品的△Ct值为12.58 ± 0.92 (SEM)，NIL-R样品的△Ct值为12.78 ± 0.62 (SEM)，SH-R样品的△Ct值为13.09 ± 0.10 (SEM)。通过分析，相对于DBM1Ac-S阴性对照，三者的表达量均达到了极显著水平，与SZ-R阳性对照水平相当。由此可知，该区分标准设定合理，通过该实时荧光定量PCR检测试剂盒，可以很明显的区分出Bt杀虫蛋白Cry1Ac抗性及敏感小菜蛾。

实施例3

利用实时荧光定量PCR技术对DBM1Ac-S及SH-R的4龄幼虫中肠cDNA样品的检测及本检测试剂盒和其使用方法的建立。本实施例的方法与实施例不同之处如下（其余同实施例1）：

以小菜蛾中肠APN3a基因为靶序列(SEQ ID NO. 4)，根据实时荧光定量PCR设计的原则，设计特异性荧光定量引物如下：

正向引物(qAPN3a-F)：5′-GGCTACCGTTGGCTACAC-3′(SEQ ID NO. 5)

反向引物(qAPN3a-R)：5′-GCAGACATTCCTCCACTCC-3′(SEQ ID NO. 6)

该特异性引物对扩增APN3a保守TMD1区域片段为110 bp（请参见图6）。

本实施例中使用标准品梯度稀释进行实时荧光定量PCR所得到的标准扩增曲线请参见图7。根据图7得出的数据所绘制出的标准曲线请参见图8。图9为本实例的检测小菜蛾Bt杀虫蛋白Cry1Ac抗性的实时荧光定量PCR检测结果，如图9中所示，在特定的波长条件下，根据荧光检测的抗敏样品间各自靶标基因APN3a与内参基因L32之间的Ct值差值（即△Ct值）判断结果，可知两样品产生了典型的“S”型扩增曲线，且DBM1Ac-S的样品的△Ct值为1.63 ± 0.10 (SEM)，SH-R的样品的△Ct值为4.12 ± 0.11 (SEM)。通过统计学分析，两者之间的表达量差异达到了极显著水平，由此，通过Bt抗敏样品间该基因的表达量差异可知，可以很明显的区分出两者，那么区分标准可初步设定为：△Ct值≥ 3，则说明待测样品已对Bt杀虫蛋白产生抗性；若△Ct值≤ 2，则说明待测样品为敏感种群，尚未对Bt杀虫蛋白产生抗性；若△Ct值位于两者中间，则建议重做，样品对Bt杀虫蛋白抗性产生与否视重做结果而定。

实施例4

通过其他三个Bt抗性小菜蛾种群DBM1Ac-R，NIL-R及SH-R验证实施例3中的试剂盒及检测方法的可用性，具体实验过程如实施例3所示。

最终的实时荧光定量PCR反应检测结果如图10中所示，其中，A为实施例3中对Bt杀虫蛋白敏感的小菜蛾种群DBM1Ac-S的4龄幼虫中肠cDNA阴性对照样品；B为实施例3中对Btk产生抗性的小菜蛾种群SH-R的4龄幼虫中肠cDNA阳性对照样品；C为对Bt杀虫蛋白Cry1Ac产生抗性的小菜蛾种群DBM1Ac-R的4龄幼虫中肠cDNA待测样品；D为对Bt杀虫蛋白Cry1Ac产生抗性的小菜蛾近等基因系种群NIL-R的4龄幼虫中肠cDNA待测样品；E为对Bt杀虫蛋白Cry1Ac产生抗性的小菜蛾种群SZ-R的4龄幼虫中肠cDNA待测样品。

在特定的波长条件下，根据荧光检测的抗敏样品间各自△Ct值判断结果，可知两样品产生了典型的“S”型扩增曲线，且DBM1Ac-R样品的△Ct值为4.22 ± 0.32 (SEM)，NIL-R样品的△Ct值为4.56 ± 0.48 (SEM)，SZ-R样品的△Ct值为4.85 ± 0.13 (SEM)。通过分析，相对于DBM1Ac-S阴性对照，三者的表达量均以达到了极显著水平，与SH-R阳性对照水平相当。由此可知，该区分标准设定合理，通过该实时荧光定量PCR检测试剂盒，可以很明显的区分出Bt杀虫蛋白Cry1Ac抗性及敏感小菜蛾。

实施例5

利用实时荧光定量PCR技术对DBM1Ac-S及SZ-R的4龄幼虫中肠cDNA样品的检测及本检测试剂盒和其使用方法的建立。本实施例的方法与实施例不同之处如下（其余同实施例1）：

5.以小菜蛾中肠APN5基因为靶序列(SEQ ID NO. 7)，根据实时荧光定量PCR设计的原则，设计特异性荧光定量引物如下：

正向引物(qAPN5-F)：5′-GGACGATCAGGCTGTTAA-3′(SEQ ID NO. 8)

反向引物(qAPN5-R)：5′-TTCCCGAATCTGGTTGTG-3′(SEQ ID NO. 9)

该特异性引物对扩增APN5片段为160bp（请参见图11）。

本实施例中使用标准品梯度稀释进行实时荧光定量PCR所得到的标准扩增曲线请参见图12。根据图12得出的数据所绘制出的标准曲线请参见图13。图14为本实例的检测小菜蛾Bt杀虫蛋白Cry1Ac抗性的实时荧光定量PCR检测结果，如图14中所示，在特定的波长条件下，根据荧光检测的抗敏样品间各自靶标基因APN5与内参基因RPL32之间的Ct值差值（即△Ct值）判断结果，可知两样品产生了典型的“S”型扩增曲线，且DBM1Ac-S的样品的△Ct值为3.03 ± 0.16 (SEM)，SZ-R的样品的△Ct值为-0.56 ± 0.30 (SEM)。通过统计学分析，两者之间的表达量差异达到了极显著水平，由此，通过Bt抗敏样品间该基因的表达量差异可知，可以很明显的区分出两者，那么区分标准可初步设定为：△Ct值≤ 1，则说明待测样品已对Bt杀虫蛋白产生抗性；若△Ct ≥ 2值，则说明待测样品为敏感种群，尚未对Bt杀虫蛋白产生抗性；若△Ct值位于两者中间，则建议重做，样品对Bt杀虫蛋白抗性产生与否视重做结果而定。

实施例6

通过其他三个Bt抗性小菜蛾种群DBM1Ac-R，NIL-R及SH-R验证实施例5中的试剂盒及检测方法的可用性，具体实验过程如实施例5所示。

最终的实时荧光定量PCR反应检测结果如图15中所示，其中，A为实施例5中对Bt杀虫蛋白敏感的小菜蛾种群DBM1Ac-S的4龄幼虫中肠cDNA阴性对照样品；B为实施例5中对Bt杀虫蛋白Cry1Ac产生抗性的小菜蛾种群SZ-R的4龄幼虫中肠cDNA阳性对照样品；C为对Btk产生抗性的小菜蛾种群SH-R的4龄幼虫中肠cDNA待测样品；D为对Bt杀虫蛋白Cry1Ac产生抗性的小菜蛾种群DBM1Ac-R的4龄幼虫中肠cDNA待测样品；E为对Bt杀虫蛋白Cry1Ac产生抗性的小菜蛾近等基因系种群NIL-R的4龄幼虫中肠cDNA待测样品。

在特定的波长条件下，根据荧光检测的抗敏样品间各自△Ct值判断结果，可知两样品产生了典型的“S”型扩增曲线，且SH-R样品的△Ct值为-0.65 ± 0.13 (SEM)，DBM1Ac-R样品的△Ct值为-0.96 ± 0.15 (SEM)，NIL-R样品的△Ct值为-1.07 ± 0.39 (SEM)。通过分析，相对于DBM1Ac-S阴性对照，三者的表达量均以达到了极显著水平，与SZ-R阳性对照水平相当。由此可知，该区分标准设定合理，通过该实时荧光定量PCR检测试剂盒，可以很明显的区分出Bt杀虫蛋白Cry1Ac抗性及敏感小菜蛾。

实施例7

以小菜蛾中肠APN6基因为靶序列(SEQ ID NO. 10)，根据实时荧光定量PCR设计的原则，设计特异性荧光定量引物如下：

正向引物(qAPN6-F)：5′-CAGCAGGGACGGATAGAA-3′(SEQ ID NO. 11)

反向引物(qAPN6-R)：5′-ATCGGTAGCAACGAAGTTAA-3′(SEQ ID NO. 12)

该特异性引物对扩增APN6片段为146bp（请参见图16）。

本实施例中使用标准品梯度稀释进行实时荧光定量PCR所得到的标准扩增曲线请参见图17。根据图17得出的数据所绘制出的标准曲线请参见图18。图19为本实例的检测小菜蛾Bt杀虫蛋白Cry1Ac抗性的实时荧光定量PCR检测结果，如图19中所示，在特定的波长条件下，根据荧光检测的抗敏样品间各自靶标基因APN6与内参基因RPL32之间的Ct值差值（即△Ct值）判断结果，可知两样品产生了典型的“S”型扩增曲线，且DBM1Ac-S的样品的△Ct值为3.00 ± 0.11 (SEM)，SZ-R的样品的△Ct值为0.76 ± 0.18(SEM)。通过统计学分析，两者之间的表达量差异达到了极显著水平，由此，通过Bt抗敏样品间该基因的表达量差异可知，可以很明显的区分出两者，那么区分标准可初步设定为：△Ct值≤ 1，则说明待测样品已对Bt杀虫蛋白产生抗性；若△Ct ≥ 2值，则说明待测样品为敏感种群，尚未对Bt杀虫蛋白产生抗性；若△Ct值位于两者中间，则建议重做，样品对Bt杀虫蛋白抗性产生与否视重做结果而定。

实施例8

通过其他三个Bt抗性小菜蛾种群DBM1Ac-R，NIL-R及SH-R验证实施例3中的试剂盒及检测方法的可用性，具体实验过程如实施例7所示。

最终的实时荧光定量PCR反应检测结果如图20中所示，其中，A为实施例7中对Bt杀虫蛋白敏感的小菜蛾种群DBM1Ac-S的4龄幼虫中肠cDNA阴性对照样品；B为实施例7中对Bt杀虫蛋白Cry1Ac产生抗性的小菜蛾种群SZ-R的4龄幼虫中肠cDNA阳性对照样品；C为对Btk产生抗性的小菜蛾种群SH-R的4龄幼虫中肠cDNA待测样品；D为对Bt杀虫蛋白Cry1Ac产生抗性的小菜蛾种群DBM1Ac-R的4龄幼虫中肠cDNA待测样品；E为对Bt杀虫蛋白Cry1Ac产生抗性的小菜蛾近等基因系种群NIL-R的4龄幼虫中肠cDNA待测样品。

在特定的波长条件下，根据荧光检测的抗敏样品间各自△Ct值判断结果，可知两样品产生了典型的“S”型扩增曲线，且SH-R样品的△Ct值为0.24 ± 0.14 (SEM)，DBM1Ac-R样品的△Ct值为0.17 ± 0.33 (SEM)，NIL-R样品的△Ct值为-0.04 ± 0.21 (SEM)。通过分析，相对于DBM1Ac-S阴性对照，三者的表达量均以达到了极显著水平，与SZ-R阳性对照水平相当。由此可知，该区分标准设定合理，通过该实时荧光定量PCR检测试剂盒，可以很明显的区分出Bt杀虫蛋白Cry1Ac抗性及敏感小菜蛾。

<110> 中国农业科学院蔬菜花卉研究所

<120> 基于APN基因的小菜蛾对Bt杀虫蛋白Cry1Ac抗性的检测方法及其试剂盒

<160> 16

<210> 1

<211> 157

<212> DNA

<400> 1

TCACTGAGTCCCATCCCAGTTGACGATGTGGCTGAAGAAGATTGGGCAAGTTTCTATAGAATGTTGAGAGACCCTGCCTACCGCCTACCGACAACTACTAAACCACGTCTGTACAATGTGACGCTAACACCTTACTTTGAAAATGTGCCGTCTGGCA

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<400> 2

TCACTGAGTCCCATCCCA

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<400> 3

TGCCAGACGGCACATTTT

<210> 4

<211> 110

<212> DNA

<400> 4

GGCTACCGTTGGCTACACACCGTCGAACGCTAACGAAGCCTTCATGACCACGTACCTGCGCTACCAGCTGGCACCCTTCATGTGCAGGCTCGGAGTGGAGGAATGTCTGC

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<400> 5

GGCTACCGTTGGCTACAC

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<400> 6

GCAGACATTCCTCCACTCC

<210> 7

<211> 160

<212> DNA

<400> 7

GGACGATCAGGCTGTTAAAGAGTACTTGGAAATGGTACTGACTGACGCAGTGAAGGCTCAAGATCGCGTGAACGCTTTCACCTACTTGTACATGGGAGACCGCGGGAACGCACAGAAGGCTCTACAGTTCATTAAGACCAACCACAACCAGATTCGGGAA

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<400> 8

GGACGATCAGGCTGTTAA

<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<400> 9

TTCCCGAATCTGGTTGTG

<210> 10

<211> 146

<212> DNA

<400> 10

CAGCAGGGACGGATAGAAATGAAAATGTGCTGTCAGAAACTGATTTACGTGATGAACTTAGTAGAGATTCAGAATATCGACTTCCAGTAGATGTTGTTCCTATAGAATATGACATTGATTTAGATCTTAACTTCGTTGCTACCGAT

<210> 11

<211> 18

<212> DNA

<400> 11

CAGCAGGGACGGATAGAA

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<400> 12

ATCGGTAGCAACGAAGTTAA

<210> 13

<211> 2967

<212> DNA

<213> APN1

<400> 13

ATGGATTCTCGCTGGTTCCTTTTGGTGTTGGTCCTGATTCAGGCTCATGACATAACGTCACTGAGTCCCATCCCAGTTGACGATGTGGCTGAAGAAGATTGGGCAAGTTTCTATAGAATGTTGAGAGACCCTGCCTACCGCCTACCGACAACTACTAAACCACGTCTGTACAATGTGACGCTAACACCTTACTTTGAAAATGTGCCGTCTGGCATAACACCATTCACATTTGATGGACAAGCTACCATATACATCAGTGCTACAGTCGCTAATGTATCCGAGATAGTTTTGCATTGTGAAGACTTGACGATCACTAAAGTCGAAGTGACTCGTAACATCAATGGGGAACCTCAACCAGTGCCTATATCGAACGACAGCCCGCAGTGTGAAATGCCTTACGCGTTTTTGAGGGTAGCTCCAACTCAGGCCTTGCAACTGAATCAAGAGTATACCGTAAACGTGACGTACCGGGGCAACCTACAAACAGACATGAGAGGGTTCTATCGCAGCTGGTACAGAGACTCATCGGGCACAAAAAGATGGATGGCCACAACCCAGTTCCAGCCAGGTCACGCCCGCAAAGCCTTCCCCTGCTACGATGAGCCTGGATTTAAGGCCTTATTCAATATCACCATCAACCGAGAGGATGACTTCAAGCCAAGTATTTCGAACATGCCTATTAGGCGGACTATTTCGTTGGGCAATGGAAGGACGGCAGAATCTTTTTACACTACGCCATTGACGTCTTCTTATCTGGTGGCTTTTATTGTTTCCCATTACGAAAAAGTCGAGTCTTCGAACAACACTTTGAGGCCATTCGACATTTATGCCAGAGACAACGTGGGTGTGACTGGCCAATGGTCTCTAGAGGTTGGAGAGAAATTGCTGGCATACATGGAGGGACATACCGATTACGAGTACTATTCAATGGCACCGTTCCTCAACATGAAACAAGCTGCTATTCCCGACTTCTCGGCTGGTGCTATGGAAAATTGGGGTCTTTTAACTTACAGGGAAGCAAATATCCTTTATCACCCTGAGAACTCGAACCACTTTTACAAGCAGAGAGTAGCCAATATAGTGGCCCACGAGATAGCCCACATGTGGTTCGGCAACTTGGTGACCTGCGCCTGGTGGGACAACCTCTGGCTCAACGAGGGCTTCGCGAGATACTACCAGTACTTCCTGACCGGACCTGTTCTACCTGATCTCGGCTACGAGACCCGGTTCATCGTGGAGCAAGTCCACACGGCGATGTTCTCCGACTCCCTGGACTCTGCGCACGCGCTGACCAACCCGTCGGTCAACGACCCCGCCGCCGTGTCCAGCCACTTCTCCACCATCACGTACGCCCGAGGCGCCGCCGTCCTCCGCATGACGCAGCAGTTACTGGGAGAGAACACCTACCTGACCGGTTTGAGGAACTATCTCAAGGATAGAGCATTCGACGTATCGGAGCCGCGTCACCTATTCTCGGCCCTGGACACAGTGGCCGCCGCTGACAGCGCCCTAGCGACGTACGGGGGAGTCACCATCGAGTCTTACCTCAAGTCCTGGTCGGAGCAGGCGGGACACCCGCTGCTGACTGTCGTGGTCAACCACGAGACCGGACTGATGCAAGTTACACAGGCTCGATGGGAGCGCAACACCGGTGTGTCGGGTGTGCCGACCCTGTACCAGATACCCATCACGTGGACCCGCGGCGGCGCGCCCAACTTCATCAACCTGAAACCCTCCCAGGTCCTGACACAAACCACCACCACCATCAATAGAGGATCCACCGGGTACGAGTGGGTTATCTTCAACAAGCAGGAATCAGGCTTTTACAGAGTTAACTACGATGACACTACTTGGGACCTCATAACTGCAGCATTGAAGAGCAATGAAAGGAGAGTTATCCATGATCTTAATCGGGCACAGATCGTTGACGATGTGTTCGCGTTGGCCCGCGCAGGAGTCATGTCGTACACCAAAGCAATGGACATCTTATCCTTCCTCGAGTACGAAGAACAATACGCGCCGTGGGTCGCGGCTATCTCTGGCTTCAACTGGCTCCTGCGCAGATTGGCTCACGATCCACAAACTTTGCAGAGCTTCCAGCAAGAGATCATAAAGCTGAGCTCGGCCGTGACCGCTCGTCTCGGCTTCGCTGAAGTCCCTGGAGAGCCCTTCATGGACGGACTCCTGCGCATGTACGTGCTCGACTTCCTGTGCAACGTGGGTCACGAGCAGTGCGTCGCGCAGGCCGTCACGAACTTCCGCAACCTCAGGAATGGCACTTTCTTGCCCGCTAACATGAGGCCGTGGGTGTACTGCGCCGGTCTCCGCGCTGGAACACCAGAAGACTTCCGATTCTTATGGTCACGTTTCGAATCCGAAGACCTGGCTAATGAAATCGTTGTGCTGCTAGAAAAGTTAGGGTGCACCAAGGATGCCGCGAGTCTCAATGTTCTTCTCAATAGTGTAGTAGAAGACAATGAGCTGGTGAGGCCTCAGGACTACAACGTCGCTCTGAACAGCGCTGTGTCCGGAAACGATGAGAATGTGCAAATAGTCTTTGAATGGCTAAAGAGAAATATTCCGCAAACTACTTCGGCGCTAGGCAGTGTCAGCACTCCGTTGAACTACATTGCTGGGCGACTGCTATCGGAAGCTGAAATAGTTGAATTCGAGACCTGGTTGAACGCCAATCAGAACCAAATCGGAGCAGCGTCTTACGCGACCGGTATGAGCGGGGCGCGAGCCGCCCGCGACAACCTGGCGTGGTCCGCGCGCCGCCTGCCCGAGATCCAGGAGTACCTGGAGTACGGCTACACCCCGCCGCCCAGCCCCAGCCCGCCGCCCACGGACGCGCCGCCCGTGGACACCACTCCCGACATGACCCCGCCCCAACCAGACGCCGCTTCCATCGCCACGCTGAGCGCGATCACGCTTGCATTAACCGTCGCTATCAATTTTGTTGTGTAA

<210> 14

<211> 3075

<212> DNA

<213> APN3a

<400> 14

ATGGCGACAACGACAACAAGGATTCTCATTGCCTTGGTTGGCCTGGGAGCAGCCTTCGCTCTTCCCCCGGTTATAAAGATCCAAAGGAACACCATTTTCACCGATGAAATGCTTGAGGGTCAAGTATTTGAAAATGTTGACGCCTTCAGCAATGAAGAAATTGCCCTGTTCCAAACCTCTCAAAATGAGTACCGACTCCCTACCACCACTAAACCAATAAACTACAAAATTCTCTGGTCTTTTGACTTTAAAGACGATGACAATCTATCGTTCGCTGGAAACGTTGACATTCAACTAGTAGCCACTCAGGAAAACGTTAATGAGATCGTGATCCACTGTGGAAAGGACCTCAACATCGCCACTGTGGGGTTGAAAAAAGGAAACGAAGTGGTAACTGTACAAAATTATGAAAAGGTTGAACTTTACGAGTTTTTAAAAATTCAACCTGCTGAAAGTTTGGTATTCACTCCTGCCAGTGATACTGTCTACACTCTGAGCATTAGCTTCAACGGAGCGATGCGAAACGACATGTACGGCATTTACAAGAGCTGGTTCAAAACTGGCACAGAGACAAAATGGATGGCGTCGACCCAGTTTCAAGGGACCTCCGCTCGTTTTGCCTTCCCTTGCTACGACGAGCCCAGTTTCAAAGCTACCTTTGACATAACCCTGAGGCGGCCAACAGAGTATAGGAGCTGGTCTAACACGAAACTTAAGAGCTCTGATCCAACTGTGAATATAGAGAATTACGTGGACGATGTGTTTGCTACAACTCCAGTAATGTCTACATACTTAATAGCAATTATTGTTGCTGAGTACAAGTCTCTTGAAGATAATAATAACCCTCAACAGTTGAAATACGAAGTTATTGCTAGACCTGATGCTATCGACAATGGCCAAGGACAATATGCTTATGACGTTGGACAGAAACTGCTTGCAGAAATGAGCGACCACACGGGTCTTGATTTCTATGAAGTTGATGCTAACCTTAAAATGACTCAAGCTGCTATTCCTGATTTTTCTGCCGGTGCTATGGAAAACTGGGGACTGTTGACCTACAGAGAAGCGTACTTGATGTACGACGAGAAACAAACTAATTACAACTCGAAACAACTTATAGCGTACATATTGTCCCATGAGATCGCGCACATGTGGTTCGGCAACCTGGTCACCTGTGACTGGTGGGACGTCTTGTGGCTCAACGAGGGCTTCGCCAGATACTACCAGTACTTCCTCACGAACGCGGTCGAAACCGAAATGGGATTCGAAACCCGTTTCATCACCGAGCAAGTCCACACCGCGTTGTTGGCCGACGCTGCCAACAACCCGCACCCGCTCACCAACCCCGGCGTCGGCAGCCCCGCGCAGGTCAGCGGCATGTTCTCCACACTCAGCTACAACAAGGGAGCCTCCCTCATCAGGATGACGGAGCACCTCCTCGGCTACAACGTTCATAGAGAAGGCTTGCGGAAATACATTTCGGACTTCAAATTCAAAACTGCACTGCCAATCAATCTGTTTGAATCTTTGGAGGCGGCGGCCAAGGAGGCCGGTGCGCTGGCCGAGTATGGACCCAACTTCTCTCTGGTTGAGTACTACAAGAGCTGGACAGAACAAGGCAGCGCGCCGGTCCTGTTCGTTGAAGTGAACCACCAAACTGGGGACATGACTGTCACTCAGCAACGTTTCAACATCAACACTGGCATGTCTACCTCCAACTCGCTGTGGATCGTGCCGGTGTCGTTCGCCACCGCGAGCAAGCCCGACTTCTCTAACACCAAGCCCACGCACATCCTGTCTGCAACCGCCAACGTCATCCCCCGCGGTTCTCAGGGCGACGAATGGGTCATCTTCAACATCCAACAAACTGGTTACTACCGAGTCAACTACGATTCCTACACATGGGACTTGATCATCAGAGCGTTGAGAGGCGAAGACCGGATCAAAATTCATCCTTATAACCGAGCGCAGATCGTGAACGACGTGTTCTCATACGCGCGGTCTGGCATCATGACGTACCAGCGCGCCATGACGATCCTCTCGTTCCTGGAGTTCGAGACGGAGTACGCGCCGTGGGTGGCCGCCATCACCGGCTTCAACTGGCTCACCAACCGGCTGTCTGGCCCTGAGAACGCCGCCGTTTTGGACAAGCTCACTGCTGAGATCACCCGCTGGGGTTCACGGGCTATGGCTACCGTTGGCTACACAGCTTCGAACGCTAACGAAGCCTTCATGACCACGTACCTGCGCTACCAGCTGGCGCCCTTCATGTGCAGGCTCGGAGTGGAGGAATGTCTGCAGTCCGCGGATCGGCAGTTCGCTGCTCTGAAGGTCATCGCTCCTGCCCAGCCTGTCGAAGTGGACGTGAACAACCGCAACTGGGTTTACTGCAACGCGCTCCGCCGGGGCGACGCCAGCGACTTCGAGTTCCTCTGGCAGCGGTTCCTGGACCACCCCGTCTACACCGAGAAGATCCTGCTGCTTGGTACCCTCGGGTGCACCAAGGACGAGGAGTCTCTTAAGAAGTTCATGTCCGCTATTGTGACTGACAATCTGGTGATCCGGCCCCAGGACTACACGACTGCGTGGAACAGCGCTGTCACCGGCAATGAGGAAAACACTCAGATTGCCTTCCAGTTTGTACAAGGAAATCTGAACACTGTTGCCGCAGCATTCCCCCGAGACGGCATCGCTACGCCCTTATCCTACATCTCCTCCAGACTACGCACTGCTGCCGAAATTGATGCTTTCCAAAGTTGGGCTAAGGCCAACGAGAATACGTTGAACGGATTCCGTCCCGGCTCCTACGCGTCCATCAACGCCGGTGCGGAGAGCACTCGCCAGGCCCTCGAGTGGGCTGCAGAGATCAGTCCTACAATCCAGGACTTCCTCGACACTCCCGTGGAGCTGCCTCAGCTGTCGACCCCTGATCCGCCCCCGGAGGTGGACACCGAGACGACCCCGCAGCCAGACCTCCCCGAGCCAGAGGTCCCCGACCTGCCAGACTCAGCTGCCACCAGCTTCCTCTCAGTGTTCGCTATCACAGTCGCTGTGATCGCAAATATTCTGGTCTAA

<210> 15

<211> 2853

<212> DNA

<213> APN5

<400> 15

ATGGCTCTTCTTCTGAAGTTGGCAATTTTGCCAGCTCTTCTTGCCCTGGCTTGGGCAGACTTTCCAATAGACGCTGATTTTCTCTCGGATATTGTTGATACTCGCAATGACGATGACGTAAAGTACAGGCTGCCTGAAAGCCTCGACCCAGTTCACTGTGAAATTGAAATAACACCGCACTTCGACGCCACTGCTGATAGACCAGCTTTCTCTTTTGATGGAATTGTAACCATTAACGTTATTGCTAAAGAGGATGGCATCAACAGTCTCATTCTTCAGGAGAATGTAAGAGAAATAGGTGCTATTACAGTAACTGAGGAAAATGGGAGGTTGATAGATTTAAACCCATCATCACCCTTTGAAAGACTGACAGAATATCAGTTCCTGAAAATAAATCTGCGTAGTGGTGTTACTTTGTCTAAAAATGGGAAATACACCATAAGAATTGAATATGTAGGACATATGAATGAGACACCTCTTTCGAGGGGTATGTTTAGAGGTAGTTACGTGGGAAAAGATGGAAAAACTCACTGGTACGCTGCAACACATTTGCAGCCCACTCATTCCAGGCAGTTATTCCCAAGCTTTGACGAACCTGGTTTCAAATCCACCTTCAAAATTATCGTTAACCGACCAGCAAACTTTGCCGACACTCATTCCAATATGTACGCCGAGTCTCGAAGTGAACCGATCAACGGCTTAGTTAAAGAAGTTTTTTACACTACACCTCGAATGTCAGCATACTTGGTTACAATTCACATAAGTGATGAATTCACAATTATAGCTGATAACGGAGATGCTAAAAGACCCTACCGTATCTTAGCTCGTCCTGATGCTGCGAACCAAGGTCAATATGCTTTGGAGGTTGGCCCTCCACTGACGAAATGGCTGGAGGAATATTTGGGTAAGCCATACTATGAAATGGCTGAGAACATGAAGAATGACCAAATTGCTTCACCGTTTTGGGCGTCTGGTGCTACGGAGAACTGGGGATTGGTGACGTACAGAGAGCTCCGCCTCCTCTACGAAGAGGGGGAGACGAATGCCGTGGACAAGATGAGCATCGGCACCATCACGGCCCACGAGCTCGGCCACAAGTGGTTCGGCAACCTGGTGACGGCGCGCTGGTGGGACAACGTGTGGATCAACGAGGGCTACGCCAGCTACTTCGAGTACTTCGCTATGGATGCGGTCGACAAATCAATGGACTTGGCAGACCAGTTCAACATCATGTACACCCAGAGTGCCCTGGCCACCGACTCGTCGGCTTCCACCAGAGCCCTCCAACACACTGTCAACACCCCCACCCAGGTCTCAGGACACTTCAGTGGCATCAGCTACTCGAAGGGAGCAGCGCTATTGAACATGCTCAAACATTTCTTGGGAGAAAACACCTTCAAGAAATCGCTCAATTATTATCTGGATGAAATGAAATACGAGTACGCGAATCCGGATGATGTGTTCCGTGGTTTCGCAAGGGCCGTGCAAGAAGATGGCGCTCTCACTCAGTTCACGAATGTGAACATAACTGACTTCCTGTCCGACTGGGTCTACGAGCCAGGGTACCCCGTCATCAACGTCGACATCAATATGAACACGGGGAATATTTACATAGAACAGGAGCGTTTTTTCACGACGACTGGTTCGTCCAATCAAGTGTGGCCGCTGCCCCTGACGTATACTTCGGCCAGCAGCCCCGATTGGAGCAACACCAGGGCTAGCCACGTGATGACTGGCAAGAGTTACAACATCACCAAGACACCTGCTCACGAATGGACTATATTTAATGTGAAACAGAATGGGTACTACCGCGTAAATTATGATACACATAACTGGGAGCTCATTGCTGAAGCTCTACAAAAAGATGTCAACGCTATCCACTACCTCAATAGAGCTCAAATAGTGGATGACGTATTCGCCCTGATGCGTTCCGGAAGAATGACCCACGCGCTCGGGTTCCAAATCCTCGACTTTCTCAAGAAGGACGTCAGCTACTACTCGTGGTACCCCGCCATCAGTGGATTCAACTGGCTCAGAAACAGATTCCTTCACTTGCCTGATGTTTTAGCTGAATTTGATGAAATCCTGTACAAATACCTGGACGCCGTCGTCACAGACTTGGGCTACGAAGCCGTGGACTCCAACGAACCCCTCACCAGAACCCTGAACCGGTTCTACATCATGTCGTTCGCTTGCAACATCGGCCACGAGGGCTGCGTCCAACACGCTACTCAGAAGTACACTGAGATGGTCAATGGTGGAAAGGTGGACCCCAACATCCGTCGCCACGTGTACTGCACTGGTCTGCGACAGGGGAGCCTGGCGCAGTGGAAGGTGCTCCAAGTCCTGTACCTCGCCAGCAACAACCAAGCCGACGAGGTGGTGAAGCTGAGAGGACTCGGGTGCACCTCGGACGATCAGGCTGTTAAAGAGTACTTGGAAATGGTACTGACTGACGCAGTGAAGGCTCAAGATCGCGTGAACGCTTTCACCTACTTGTACATGGGAGACCGCGGGAACGCACAGAAGGCTCTACAGTTCATTAAGACCAACCACAACCAGATTCGGGAAGCTGTCGTTGGTTCAGTTCGCTTCAACACCGTGTTGGCGAACTTGGCCGCTTACACTGATGAAGAGGGACTACAGGATATGGAATCATGGCTAGAGGAGAACAAAGATTCGATTCCCGAGTATTCTGTCGGCGTGAGCGCGGTGGCATCAGCTCGGGCCAACATGGCGTGGGGCACCCAGAACGCTGACTCCATATTGAAAGCCGCCCGAGGGTCTGCCGCTATGGTCCTTCCTACTGCTTTGCTGCTGATTGCCAGCTTATTTGCGCTATTGATGAAGTAA

<210> 16

<211> 2880

<212> DNA

<213> APN6

<400> 16

ATGTTCCGGGTAACAACTGTTGTTTTAAGCATTTTGCTCTTTGATGTAGCATTCACTGATCACCCAGCAGGGACGGATAGAAATGAAAATGTGCTGTCAGAAACTGATTTACGTGATGAACTTAGTAGAGATTCAGAATATCGACTTCCAGTAGATGTTGTTCCTATAGAATATGACATTGATTTAGATCTTAACTTCGTTGCTACCGATGATAGACCAGCCTACAGTTATAATGGGATAGTCAATATTATTGTTCAGGCAGTCGATGAAAATATTAAACAAATTGTATTACACGCCAATGTAGACCGCATCAAGGCAATAACTGTCCTAACCAGTGCAGGAAAACCAATGCCATTGAATCCCAATAGTCCTTTTGTTATAGAGCCACTTTATCACTTTCTTAGAATTAATATGCTAGAAAGTTTAAAAAAAGGTGACAAATACTTGTTGAGAATAGAATACTCAAGCACTATGAATGATGGACCACTTAAAAGAGGTATTTGGAAAGGACATTATAAGGATAATGATGGAATAAAAAGGACGTACGCTACAACTCATTTCCAGCCTTATAATGCTCGTCAAGCTTTCCCATGCTGGGATGAACCGATGTTCAAAGCAGAGTTTAAATTACATCTGACAAGACCCTCCAATTTTAATGCAGTTTTCACAAATACTGGACTAGAAAGTACCGAAACACTTTCAAATAACTGGGTCAGGGATACATTTAAGACTACTCCTAAGATGTCTTCATATCTATTAACCTTTTTGGTCAGCGAGTCATTTCAAGTCATTGCTGAAGATACGTCTTTTGATCCTCCAATCAGGTTAATAGGAAGATCCAATACTGCAGGACTTGGTGCTAAGGCTTTGAAGTTTGCTGTTGGCGTAGCCAGATTTTTTGACGAATACTTCGGAATGCCTTATAATACTCTCAACCCAAATTTGAATAACGATCACATTTCTTCACCTGATTGGGCTTCTGCTGGAACAGAAAACTGGGGAATGGTTAGCTACAGGGAGCTATACATGATAATGGACTCGGACCACACCATCATGTCGGTGGAGCACTACGCCGCTACCCTCATCTCCCACGAACTGGCTCACAAGTGGTTCGGCAACCTCGTCACTTGCGCCTGGTGGAGTGAGACCTGGATCAATGAGGGATTCGCCAGCTACTTTGGCTATTTGCCTAACTCTATTGTGTTCCCAGAGTACGAACATGATGAGCATTTCAACTCTCGCTATCTGCAGACGTCTCTGTCAGTAGACTCGGCAGTCAGCACCACAGCCCTCAGAACTGAGGTGAACACTCCCGCACAGGTCACCGGCAACTTCGGAACTATCAGCTATTCTAAAGGAGCTGCTTTCTTGAGAATGCTGTCGGATATGATAACGCCTGAAACGTTTCAGAAAGCTTGCCGTTATTTCTTATTGGGGCATGCCTACGAACCAGCTTATCATACAGATTTATACTACGCTTTCAAAGAAGCTATAGAAGAAGATGGAACACTGAATGGTTATGAGGGCTTTGACTTTTACAAGTTCTACGATACCTGGGTCAATGAACCTGGTTATCCTATTCTAGAAGTTGAAATTGACTATGTTACGGGAGAAATGCAACTCAAACAGGAACGATTTTTGCTCAGCGCGTCGGCAACCCCAGTCAACCCAGATGTAGTATACCCCATACCGATAACATTTTCATCCAAGAACAACCAATCTTTTACGGAGCTGAAGCCAATTTACATGATGTCAGGCAAAACTGGCGTTGTTTCAAAGCAGCCTGGTGAAGAATGGGTAATTTTCAATCATTTACAGCACGGACACTACAGAGTTAACTATGAAAGAAAGAATTGGGAACTTATAGCTGAAGCCTTAAAAGACGAATCGCAACCTATCCATCACTTAAACCGCGCTCAAATCGTCGATGATATGTATGCCTTTATGAGATCTGAAAGAATTGCTATCGAGTATGGCTTCAAAGTCTTAAGGTTTTTAAGCAATGAGACCAACTACCATGTTTGGAATCCCGCCATTACTATGTTCAGTTTTTATAGAAATCGATTGAGGTTTACTCCAGAATACAATATTTTTACGTCATTTGTTCTTGAAACCATGGAGCACTCTATTCAAAATCTTGGATATGATGTTAAACCCGATGAATCTTCCACTACCTCTCTACACCGACAAGAGATGCTCCAGTTTGCTTGTAACTTAGGTCACGAACAATGCATAAAGGAATCAAAGGAAAGATTTAATAGTTTTAAGGATGATTCAAAGAAATTGGATCCCCGCATCAGCCGTCATGTGTATTCTGTGGGCATCCGGGAAGGAGATATTGCTGACTTTGAATTTCTTTTAACTAGATTCCTTGAGTCAAACTTCGCTAATGAAAAGCTAGAAATGCTCAGAGGTTTGGCTGCCACAAGAAACCCGACGCTTATAAACAGATACTTACAGCTAACTCTAACTGAAGATATTAGAACTCAAGACAAGTCGACTGCTTTCAACTACGTTCTATCTGGAAATTTGGAAAGTGCGAGCACAGTTCTAGAATTTATCAAAAACAATATTGATTCGATAAGGGAAGTTTTCCAAGAAGATGCTCCGAACAATCCCGTGAACTCCGTGATTTCGAATGTTGCATCTTATTTGGATGAAGAGGGTCTGAATGATTATGAAAATTGGCTACGAACGACTCAGAGTGGCAGTGCCCAGTTCAATACTGGTATCAACGCCATCAGATCAGCTCGGAACAACATAGCTTGGGGGGCGGCCAACGCTGAAGCAATCATTGCCGCCACGAAGGATGGAGCAGCACAAATTGTTGCTTCAGCTACTTTGATGATCTTATTAGCAATGATTACTTTGATAGTTTAG

Claims

1.一种检测小菜蛾对Bt杀虫蛋白Cry1Ac抗性的PCR检测方法，其特征在于：具体包括以下步骤：

(1)提取待测小菜蛾4龄幼虫中肠的RNA样品，并反转录为cDNA模板；

(2)将所述cDNA模板加入到含有特异性引物对的PCR反应液中得到PCR反应体系；所述特异性引物对是以小菜蛾APN6基因为靶目标序列设计得到的靶标基因特异性引物对，所述特异性引物对由如SEQ ID NO. 11所示的正向引物和如SEQ ID NO. 12所示的反向引物组成；

(3)进行实时荧光定量PCR检测；

对于APN6基因，若所述待测小菜蛾的样品产生典型的“S”型扩增曲线及单峰熔解曲线，且△Ct值≤1，则说明所述小菜蛾待测样品对Bt杀虫蛋白Cry1Ac产生抗性；若△Ct值≥2，则说明待测小菜蛾待测样品未对Bt杀虫蛋白Cry1Ac产生抗性；其中，△Ct值就是靶标APN基因与内参基因RPL32之间的Ct值的差值。

2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述实时荧光定量PCR检测的扩增程序为：95℃预变性15min，95℃变性15sec，53℃退火30sec，72℃延伸32 sec，40个循环。

3.如权利要求2所述的检测方法，其中，PCR过程完成后，按0.1℃•s^-1的升温速率从72℃升至95℃进行熔解曲线的分析验证，具体过程为：95℃进行15s，然后60℃进行1min，95℃进行30s，最后60℃进行15s。