CN110669676A - 莱氏绿僵菌mrjcbt190808及其在草地贪夜蛾防治方面的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种莱氏绿僵菌MRJCBT190808及其在草地贪夜蛾防治方面的应用，该莱氏绿僵菌MRJCBT190808于2019年08月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.18122，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。莱氏绿僵菌MRJCBT190808的获得过程为：从采集到的罹病草地贪夜蛾幼虫体分离获得野生莱氏绿僵菌菌株，在萨氏培养基上培养，将分生孢子转接到新的培养基上进行纯化，然后进行单孢分离获得纯化的莱氏绿僵菌MRJCBT190808。本发明提供的莱氏绿僵菌MRJCBT190808是一种能用于防治草地贪夜蛾的生防真菌，具有对草地贪夜蛾幼虫致病性强、环保无污染、不易产生抗药性的特点，可以广泛用于生物防治草地贪夜蛾。

Description

莱氏绿僵菌MRJCBT190808及其在草地贪夜蛾防治方面的应用

技术领域

本申请属于微生物技术领域，具体地说，涉及一种莱氏绿僵菌MRJCBT190808及其在草地贪夜蛾防治方面的应用。

背景技术

草地贪夜蛾[Spodoptera frugiperda(J.E.Smith)]又名秋黏虫，隶属于鳞翅目，夜蛾科，是一种原产于美洲热带和亚热带地区的杂食性害虫，尤其对玉米的危害较为严重。自2019年1月首次入侵进入我国云南省普洱市江城县以来，已蔓延至我国的19个省1000余个县，严重危害玉米等作物，已成为严重影响玉米产业发展的重要因素。

现有技术中，目前对于草地贪夜蛾的防治主要采用化学防治方式，该虫已对许多农药产生了较强的抗药性。另外，采用化学防治方式带来的农药残留等问题，存在人畜安全隐患和生态环境影响的风险。探求绿色、安全、高效、持续的防治草地贪夜蛾的措施已势在必行。

发明内容

针对现有技术的上述缺陷，本申请提供一种莱氏绿僵菌MRJCBT190808及其在草地贪夜蛾防治方面的应用。

本发明提供的莱氏绿僵菌(Metarhizium rileyi)MRJCBT190808，于2019年08月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.18122，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

所述莱氏绿僵菌MRJCBT190808的获得过程为：从采集到的罹病草地贪夜蛾幼虫体分离获得野生莱氏绿僵菌菌株，在萨氏培养基上培养，将分生孢子转接到新的培养基上进行纯化，然后进行单孢分离获得纯化的莱氏绿僵菌MRJCBT190808。

如上所述的莱氏绿僵菌MRJCBT190808，在草地贪夜蛾[Spodoptera frugiperda(J.E.Smith)]防治方面的应用；

将草地贪夜蛾3龄幼虫置于浓度为2.96×10⁶个孢子/mL–2.96×10⁸个孢子/mL的莱氏绿僵菌MRJCBT190808孢子悬浮液中浸渍5s。

本发明提供的莱氏绿僵菌MRJCBT190808及其在草地贪夜蛾防治方面的应用具有以下优点：

1、分离获得的莱氏绿僵菌MRJCBT190808菌株是对草地贪夜蛾具有强致病性的真菌菌株。

2、莱氏绿僵菌MRJCBT190808菌株培养简单，生长快速，产孢量大，孢子萌发率高，易于在室内大量培养繁殖。

3、莱氏绿僵菌MRJCBT190808菌株的分生孢子对草地贪夜蛾幼虫致病力强，环保无污染、不易产生抗药性，可以广泛用于生物防治草地贪夜蛾。

具体实施方式

以下将配合实施例来详细说明本申请的实施方式，藉此对本申请如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。

昆虫病原真菌是一类能通过昆虫体表感染昆虫并在其体表和体内繁殖，导致昆虫发病死亡的真菌。因其对环境友好，对害虫具有持续的控制能力，不易产生抗药性，被认为是最有可能替代化学农药的下一代新型生物农药。

莱氏绿僵菌(Metarhizium rileyi)又名莱氏野村菌，隶属子囊菌门，麦角菌科，是一种对鳞翅目幼虫极具生防潜能的虫生真菌，在适宜的环境条件下能引起害虫的病害流行，有效地防治害虫。研究表明，该菌对斜纹夜蛾、棉铃虫和小菜蛾等多种害虫具有较好的侵染致病力。然而，目前尚无可对草地贪夜蛾具有强致病性、可用于草地贪夜蛾生物防治的莱氏绿僵菌。本申请发明人于2019年8月8日在云南省玉溪市江川县宝塔营村从罹病草地贪夜蛾幼虫上采集到莱氏绿僵菌MRJCBT190808菌株。本申请发明人所在的课题组在调查采集到了田间自然罹病的草地贪夜蛾虫体后，经过分离、纯化、毒力测定和筛选，发现该种在田间具有流行性强、侵染致病力强的莱氏绿僵菌MRJCBT190808菌株对草地贪夜蛾幼虫的侵染致病力高于课题组之前在云南省曲靖市沾益县发现的莱氏绿僵菌ZYSP190701菌株。

下面给出的是本发明提供的莱氏绿僵菌MRJCBT190808及其在草地贪夜蛾防治方面的应用的实施例。

实施例一、莱氏绿僵菌MRJCBT190808的分离及鉴定

1.1材料

1.1.1供试菌株

菌株于2019年8月8日采自云南省玉溪市江川县宝塔营村罹病草地贪夜蛾幼虫。

1.1.2菌株的分离培养

将采集到的罹病草地贪夜蛾虫体置于5mL无菌EP管中带回实验室，采用划线法，在PDA培养基(马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH自然)上，于(25±1)℃，L//D＝16h//8h,湿度80％的光照培养箱中培养。培养7d后，将分生孢子转接到新的培养基上进行纯化。纯化的菌株采用SDAY斜面培养基保存于4℃冰箱。

1.1.3菌落形态观察

将分离并纯化的真菌分别接于PDA(马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂18g，蒸馏水1000mL，自然pH)和SDAY培养基上，置于(25±1)℃，L//D＝16h//8h光照培养箱中培养，于3、7和14d时，分别测定菌落直径并观察菌落形态特征。

1.2结果

获得纯培养莱氏绿僵菌MRJCBT190808菌株后，对其形态特征进行鉴定。结果如下，该菌在PDA培养基上于25℃下生长14d时，其菌落直径14.65～17.67mm，菌落正面白色，扁平，呈花瓣状，背面淡黄色，褶皱。在SDAY培养基上于25℃下生长至第14d时，菌落直径12.26～12.34mm，菌落正面呈白色、凸起、絮状，背面棕色、菌落不规则。分生孢子梗直立，分隔。分生孢子梗长为130～140μm，粗1.8～2.2μm，通常形成浓密的分支簇，其上着生2～3个瓶梗，表面光滑，圆柱形，一端较为膨大，一端尖细，大小(4.5～6)μm×(2～3)μm；分生孢子常成链珠状，长椭圆形、表面光滑，大小(3～4)μm×(2～3)μm。

实施例二、莱氏绿僵菌MRJCBT190808对草地贪夜蛾的致病性测定

1材料

1.1.1供试昆虫

草地贪夜蛾均采集于玉米田种植区(云南省曲靖市陆良县板桥镇)并于室内连续饲养3代，试验在温度25±1℃、相对湿度(RH)60±5％、光周期L∶D＝16∶8条件下的智能人工培养箱(RG-300)中进行。草地贪夜蛾用新鲜的玉米籽粒及叶片人工饲养。

1.1孢子悬浮液制备

将分离获得的菌株接种于PDA培养基，待其产生大量的分生孢子后(约20d)，用无菌解剖刀刮取培养基表面的分生孢子置于0.02％无菌吐温-80中，配制成2.96×10³–2.96×10⁸个/mL孢子悬浮液。

1.1.2浸渍法

挑选大小一致、健康的草地贪夜蛾3龄幼虫，采用浸渍法进行接种，将草地贪夜蛾幼虫置于孢子悬浮液中浸渍5s，取出后用灭菌滤纸吸干虫体表面多余水分。然后，将其置于加有玉米叶的12孔细胞培养板中，置于25℃、L//D＝16h//8h光照培养箱中饲养。每天定时观察，并将死亡虫体在(25±1)℃、L//D＝16h//8h条件下保湿培养，根据虫体是否长出目的菌确定各虫的死亡原因。设置3个重复，每重复30头虫。

1.1.3数据分析

采用Excel 2010进行数据整理，毒力回归方程采用DPS数据处理系统14.0软件的机值分析进行计算。

2.结果

2.1草地贪夜蛾幼虫的累积死亡率

由表1可知，在2.96×10³–2.96×10⁸个/mL孢子浓度下，莱氏绿僵菌MRJCBT190808侵染草地贪夜蛾3龄幼虫第8天的累积死亡率，分别为41.67％、71.67％、86.67％、91.67％、10.00％和100％。在2.96×10⁸个/mL孢子浓度下，接种后第3天时，草地贪夜蛾3龄幼虫的死亡率即达53.33％。到第6天时，草地贪夜蛾3龄幼虫的死亡率即可达100.00％。由此可以看出，莱氏绿僵菌MRJCBT190808对草地贪夜蛾具有较好的致病性。而本课题组于2019年6月在云南省曲靖市沾益县发现的莱氏绿僵菌ZYSP190701菌株对草地贪夜蛾3龄幼虫在接种后第7天时草地贪夜蛾的感染死亡率达到100％。由此，该莱氏绿僵菌MRJCBT190808菌株是当前发现的对草地贪夜蛾的致病力最高的莱氏绿僵菌菌株。

表1莱氏绿僵菌MRJCBT190808对草地贪夜蛾的累积死亡率(％)

2.2莱氏绿僵菌MRJCBT190808对草地贪夜蛾的致死剂量效应

根据莱氏野村菌MRJCBT190808菌株孢子悬浮液对草地贪夜蛾3龄幼虫的侵染致病效应，计算获得莱氏绿僵菌MRJCBT190808菌株对草地贪夜蛾3龄幼虫的LC₅₀为5.3×10³个/ml，LC₉₅为2.6×10⁶个/ml。由此表明，莱氏绿僵菌MRJCBT190808在较低的接种剂量下对草地贪夜蛾具有较好的致死效应。

综上所述，本发明提供的莱氏绿僵菌MRJCBT190808是一种能用于防治草地贪夜蛾的生防真菌，具有对草地贪夜蛾幼虫致病性强、环保无污染、不易产生抗药性的特点，可以广泛用于生物防治草地贪夜蛾。

上述说明示出并描述了本申请的若干优选实施例，但如前所述，应当理解本申请并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改，并能够在本申请构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本申请的精神和范围，则都应在本申请所附权利要求的保护范围内。

Claims (2)

1.一种莱氏绿僵菌(Metarhizium rileyi)MRJCBT190808，于2019年08月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.18122，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号；

所述莱氏绿僵菌MRJCBT190808的获得过程为：从采集到的罹病草地贪夜蛾幼虫体分离获得野生莱氏绿僵菌菌株，在萨氏培养基上培养，将分生孢子转接到新的培养基上进行纯化，然后进行单孢分离获得纯化的莱氏绿僵菌MRJCBT190808。

2.权利要求1所述的莱氏绿僵菌MRJCBT190808，在草地贪夜蛾[Spodopterafrugiperda(J.E.Smith)]防治方面的应用；

将草地贪夜蛾3龄幼虫置于浓度为2.96×10⁶个孢子/mL–2.96×10⁸个孢子/mL的莱氏绿僵菌MRJCBT190808孢子悬浮液中浸渍5s。