CN107058124A - 一种莱氏野村菌菌株及在防治淡剑灰翅夜蛾上的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物农药领域，提供了一种莱氏野村菌菌株，其保藏编号为CGMCC No.13564，属于半知菌纲、丝孢目、淡色菌科、绿僵菌属，分类命名Metarhizium rileyi。本发明还提供了上述的莱氏野村菌菌株在防治淡剑灰翅夜蛾中的用途。本发明克服了化学防治淡剑灰翅夜蛾的方法污染环境、易产生抗药性的缺点。本发明的菌株在25℃下对淡剑灰翅夜蛾的致死中时为4.47d，野外防治药后7d和10d的校正防效分别达到78.53％和89.85％，药后20d后仍具有46.17％的防效，表明本发明的菌株对淡剑灰翅夜蛾具有良好的杀虫活性和持效性。

Description

一种莱氏野村菌菌株及在防治淡剑灰翅夜蛾上的应用

技术领域：

本发明属于生物学领域，涉及一种杀虫真菌，具体来说是一种莱氏野村菌菌株及在防治淡剑灰翅夜蛾上的应用。

背景技术：

利用昆虫病原真菌防治害虫是有害生物防治的重要手段之一，与传统化学防治相比，真菌病原物具有以下优势：对非靶标生物(包括人)及环境安全、造成昆虫病害流行、不易产生抗药性。因此，真菌杀虫剂的研究开发目前受到广泛的关注和重视。

淡剑灰翅夜蛾Spodoptera depravata(名淡剑袭夜蛾Sidemia depravata)是近年来危害多种禾本科草坪草的一种重要的鳞翅目害虫，其在日本、韩国也均有分布。在我国，该虫被报道在上海、江苏、湖北、湖南、浙江、福建、河北、辽宁、安徽、天津和山东等地对草坪造成严重危害，虫口密度高时，可达数百头每平方米，对草坪造成毁灭性危害，因此，该虫是我国东部地区最为严重的草坪害虫。同时，由于因其产卵量大、世代重叠严重，化学防治难度较大，目前对该虫的防控多依靠有机磷农药，并不适宜在人们休闲休憩的草坪上使用，探寻安全高效的淡剑灰翅夜蛾生物防治技术的重要性日益凸显，但目前仍缺乏有效的生物防治制剂控制该虫。

莱氏野村菌Metarhizium rileyi是一种极具潜力的鳞翅目幼虫病原真菌，在一定环境条件下，能形成病害流行，有效降低害虫种群数量。已被广泛报道可侵染夜蛾科害虫，对斜纹夜蛾、棉铃虫、甜菜夜蛾、大豆夜蛾等鳞翅目害虫有较强的致病力。由于莱氏野村菌具有一定的遗传多样性，不同的莱氏野村菌菌株对不同的寄主昆虫的毒力差别很大，即使是分离自同一种寄主昆虫的不同菌株毒力也有显著差异。可见分离并筛选目标特异的莱氏野村菌菌株对于目标害虫的防治十分重要。但迄今为止，未见针对草坪害虫淡剑灰翅夜蛾生物防治的莱氏野村菌的报道，因此分离并筛选对淡剑灰翅夜蛾特异性的莱氏野村菌菌株对于此虫的生物防治十分重要。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种莱氏野村菌菌株及在防治淡剑灰翅夜蛾上的应用，所述的这种莱氏野村菌菌株及在防治淡剑灰翅夜蛾上的应用要解决现有技术中采用化学农药防治草坪害虫淡剑灰翅夜蛾污染环境、易产生抗药性的技术问题。

本发明提供了一种莱氏野村菌菌株，其保藏编号为CGMCC No.13564，属于半知菌纲、丝孢目、淡色菌科、绿僵菌属，分类命名Metarhizium rileyi。

本发明还提供了上述的莱氏野村菌菌株在防治淡剑灰翅夜蛾中的用途。

本发明的莱氏野村菌菌株(DT2011N7)，属于半知菌纲、丝孢目、淡色菌科、绿僵菌属，分类命名Metarhizium rileyi。该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号(中国科学院微生物研究所，邮编：100101)，保藏日期为2017年2月7号，保藏编号为CGMCC No.13564。

本发明从野外自然侵染的淡剑灰翅夜蛾罹病虫体中分离纯化多株真菌菌株，经过室内毒力筛选得到其中毒力较高的菌株DT2011N7。经形态鉴定并结合ITS序列比对，将其鉴定为莱氏野村菌。进一步的野外防治实验证明了菌株DT2011N7对草坪害虫淡剑灰翅夜蛾的有较好的防治效果和持效期。

本发明菌株DT2011N7的rDNA(核糖体脱氧核糖核酸)ITS(内转录间隔区)序列全长619bp(碱基)，如SEQ ID NO.1所示，在NCBI数据库中BLAST比对，未发现完全相同的序列。与其ITS序列最相近的种为莱氏野村菌Metarhizium rileyi，相似度达99％。结合菌株的形态特征，将菌株DT2011N7鉴定为莱氏野村菌Metarhizium rileyi的一株新菌株。

本发明和已有技术相比，其技术效果是积极和明显的。前人利用莱氏野村菌多用于防治斜纹夜蛾，未见有利用此菌防治草坪害虫淡剑灰翅夜蛾的报道。本发明通过室内毒力试验，从5株分离纯化的莱氏野村菌菌株中筛选出毒力最高的菌株DT2011N7，25℃下其对淡剑灰翅夜蛾的致死中时为4.47d。野外防治试验表明菌株DT2011N7药后7d开始表现出明显的防治效果，校正防效达到78.53％，药后10d达到最好防效89.85％，药后20d仍具有46.17％的防效。表明本发明菌株DT2011N7对淡剑灰翅夜蛾具有良好的杀虫活性和持效性，具有很好的开发利用潜力。

说明书附图：

图1是本发明的一种莱氏野村菌菌株DT2011N7的菌落形态照片。

图2是本发明的一种莱氏野村菌菌株DT2011N7的菌丝体和孢子形态的显微照片。

具体实施方式：

实施例1侵染淡剑灰翅夜蛾的莱氏野村菌菌株的分离与鉴定

1.1菌株分离

罹病淡剑灰翅夜蛾采集自上海。接种环蘸取少量罹病虫体体表孢子，采用平板划线分离法于含0.3％乳酸的PDA平板进行病原菌分离，25℃恒温培养3～5d，挑取单菌落，4℃冰箱保存备用。

1.2供试培养基

马铃薯葡萄糖琼脂培养基(potato dextrose agar，PDA)：去皮马铃薯200g煮沸后过滤取滤液、葡萄糖20g、琼脂粉16g，加水定容至1000mL；

萨氏麦芽糖酵母浸粉培养基(Sabouraud maltose agar with yeast extract，SMAY)：麦芽糖提取物40g、蛋白胨10g、酵母粉10g、琼脂粉16g，加水定容至1000mL。

1.3病原菌的回接试验及形态学观察

将4℃冰箱保存的菌株于SMAY平板25℃恒温培养7～10d，产孢待用。

用含0.05％吐温80的无菌水洗脱孢子，制备浓度为1×10⁸个/mL的孢子悬浮液。取淡剑灰翅夜蛾3龄幼虫10头，采用孢子悬浮液浸渍法回接试虫。将试虫放入已配好的待测孢子悬浮液中浸蘸10s后，置于无菌滤纸上，任其爬行晾干水分，移入灭菌的养虫盒中，每虫1盒。用含0.05％吐温80的无菌水处理对照试虫。将上述试虫置于L:D＝14:10光照，温度25℃，湿度75％的培养箱中培养。试虫感染死亡后，对罹病虫体再次分离病原菌。

将菌株转接至SMAY平板上25℃恒温培养5d，肉眼观察菌落特征；7～10d产孢后，制备临时玻片，在光学显微镜下观察菌丝及孢子形态特征；拍摄分生孢子照片，选取不同大小分生孢子100个，测量分生孢子的长度和宽度。

1.4病原菌的分子鉴定

用L型玻棒蘸取孢子悬浮液，均匀涂布于SMAY平板，25℃恒温培养5～7d至菌丝长满平板。在平板上倒入液氮，用灭菌载玻片刮取平板表面菌丝，转移至研钵，加入少量灭菌石英砂，研磨菌丝至细粉状，依据改良CTAB法提取DNA。

采用真菌通用引物ITS1/ITS4扩增核糖体转录间隔区(Internal transcribedspacer，ITS)序列。ITS1(5′TCC GTA GGT GAA CCT GCG G 3′)，ITS4(5′TCC TCC GCT TATTGA TAT GC 3′)。PCR反应体系总体积25μL，包括：10×PCR Buffer 2.5μL、dNTP mix(各25mM)2μL、MgCl₂(25mmol/L)1.5μL、引物ITS1-fungl/ITS4(20μmol/L)各0.5μL、DNA模板0.5μL(50ng/μL)、rTaq(5U/μL)0.125μL。反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性15s，50℃退火45s，72℃延伸45s，35个循环；72℃延伸5min。

扩增后用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，并用DNA凝胶回收试剂盒回收纯化，纯化后DNA片段通过pMD19-T Vector载体转入到JM109大肠杆菌感受态细胞中进行克隆，蓝白斑筛选后获得阳性单克隆。将单克隆送往上海生工生物技术有限公司测序。将ITS基因片段的测序结果在NCBI数据库中进行BLAST比对。

1.5形态鉴定及致病性测定结果

DT2011N7在SMAY培养基上，菌落早期为白色，产孢后菌丝上密布淡绿色孢子(图1)。显微镜下观察发现，菌丝光滑有分隔，分生孢子梗呈穗状，每个分支上有数个瓶梗，瓶梗短圆柱形，近基部略膨大，顶部短尖。分生孢子着生于顶部短尖处(图2)，多为椭圆形，光滑，大小为3.5～5.5×2.0～2.8μm。形态特征与前人对莱氏野村菌的描述基本一致。

采用浸渍接种法处理试虫3～8d后，其受侵染死亡，体僵硬，表面密布白色菌丝，后期表面密布淡绿色孢子；从罹病虫体分离获得菌株与保存菌株DT2011N7形态特征一致。

1.6分子鉴定结果

测序获得来自菌株DT2011N7的长度为619bp的ITS序列，将此序列在NCBI数据库进行Blast比对，结果显示菌株DT2011N7的ITS序列与M.rileyi一致性达99％。

1.7菌株鉴定结果

结合形态鉴定及分子鉴定结果，将菌株DT2011N7鉴定为一株可使草坪害虫淡剑灰翅夜蛾致病的莱氏野村菌M.rileyi。

菌株DT2011N7保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2017年2月7号，保藏编号为CGMCC No.13564。

实施例2室内毒力测定筛选对淡剑灰翅夜蛾高毒力菌株DT2011N7

2.1供试材料

供试菌株：野外采集罹病淡剑灰翅夜蛾，按照前述1.1的方法进行菌株分离。随机挑选其中5株分离获得的莱氏野村菌菌株DT2011N7，XW-DSN6，DT2014-1，DT2014-3，XW-DSN1进行对淡剑灰翅夜蛾的室内毒力测定。

供试昆虫：野外采集淡剑灰翅夜蛾虫卵，自然孵化后，将幼虫转移至养虫盒，置于光照培养箱中，光照L:D＝14:10，湿度75％，温度25℃，以禾本科草坪草为饲料人工饲养，至成虫羽化后交尾产卵，取下一代3龄幼虫作为供试虫。

2.2室内毒力测定

在SMAY平板上活化供试菌株，10～15d待孢子长满平板后，用含0.05％吐温80的无菌水洗脱孢子，制备浓度为1×10⁸个/mL的孢子悬浮液。采用浸渍法接种供试3龄淡剑灰翅夜蛾幼虫，每个处理3个重复，每个重复接种20头试虫。将上述试虫置于L:D＝14:10光照，温度25℃，湿度75％的培养箱中培养。每天观察记录试虫的死亡情况，计算校正死亡率。使用统计软件SAS 8.1计算致死中时LT₅₀。

2.3室内毒力测定结果

表1.莱氏野村菌不同菌株室内毒力测定结果

表1结果表明，5株莱氏野村菌菌株接种淡剑灰翅夜蛾后，均在4～5d达到对试虫的致死中时，其中DT2011N7的致死中时最短，为4.47d，表明DT2011N7对淡剑灰翅夜蛾具有较强的致病力。

实施例3 DT2011N7对淡剑灰翅夜蛾的野外防治效果

3.1供试材料

DT2011N7于SMAY培养基上25℃下恒温培养10～15天。用含0.05％吐温80的无菌水洗脱孢子，制备浓度为1×10⁸个/mL的孢子悬浮液，用此孢子悬浮液10稀释制备1×10⁷个/mL的孢子悬浮液。对照供试药剂为1000倍48％毒死蜱乳油(陶氏益农)。

3.2试验设置

野外试验于2016年9月在上海辰山植物园矮生百慕达草坪上进行。3个处理(1000倍48％毒死蜱乳油稀释液、1×10⁸个/mL莱氏野村菌孢子悬浮液、1×10⁷个/mL莱氏野村菌孢子悬浮液)，每处理3个重复，每个小区20m²，小区内9点棋盘式取样，每样方20cm*20cm，计数样方内的活虫数量。设置清水空白对照。施药前调查各处理小区内虫口基数，药后3d、7d、10d、20d再分别调查样区内活虫数，计算各处理的虫口减退率及校正防效，同时记录实验期间气温变化情况。应用Excel 2007计算虫口减退率及校正防效，使用SAS 8.1数据处理软件进行单因素方差分析。

3.3试验结果

莱氏野村菌DT2011N7对淡剑灰翅夜蛾防效的野外防治结果见表2，DT2011N7在药后3d无效果，药后7d开始表现出明显的防治效果，1×10⁸个/mL和1×10⁷个/mL孢子悬浮液的校正防效分别达到78.53％和54.29％。药后10d达到最好防效，1×10⁸个/mL和1×10⁷个/mL孢子悬浮液的校正防效分别达到79.33％和89.85％。药后20d后DT2011N7对淡剑灰翅夜蛾仍有一定的防效，1×10⁸个/mL和1×10⁷个/mL孢子悬浮液的校正防效分别为46.17％和41.55％。

表2 DT2011N7对淡剑灰翅夜蛾的野外防治效果

注：表中数据为三次重复的平均值，同列不同字母代表不同处理间有显著性差异(P＜0.05)。

上述结果表明，在适温条件下，莱氏野村菌DT2011N7表现出对淡剑灰翅夜蛾良好的杀虫活性和持效性，具有很好的开发利用的潜力。

序列表

<110> 上海市园林科学规划研究院

<120> 一种莱氏野村菌菌株及在防治淡剑灰翅夜蛾上的应用

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 619

<212> DNA

<213> DT2011N7真菌核糖体脱氧核糖核酸内转录间隔区

<400> 1

tccgtaggtg aacctgcgga gggatcatta ccgagtttac aactcccaaa ccccatgtga 60

acttataccc ttttcctgtt gcctcggcgg gtcatttgcc ccggaccggg ctcgtccaga 120

gcccgcccgg aaacaggcgc ccgccgcggg accgaaactc tgtatctctt agcctttggc 180

acgtctgagt ggaatcatac aaaaatgaat caaaactttc aacaacggat ctcttggttc 240

tggcatcgat gaagaacgca gcgaaatgcg ataagtaatg tgaattgcag aattcagtga 300

atcatcgaat ctttgaacgc acattgcgcc cgccagtatt ctggcgggca tgcctgttcg 360

agcgtcattt caaccctcaa gcccccgcgg tttggtgttg ggggccggcg attgtcagct 420

gggccgctca ggcggttccc tgcggcgccg cccccgaaat gaattggcgg ccccgtcgcg 480

gcctcctctg cgtagtagca caacctcgca acaggagcgc ggcgcggcca ctgccgtaaa 540

acgcacaaac ttctccaaga gttgacctcg aatcaggtag gaatacccgc tgaacttaag 600

catatcaata agcggagga 619

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> ITS1

<400> 2

tccgtaggtg aacctgcgg 19

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> ITS4

<400> 3

tcctccgctt attgatatgc 20

Claims (2)

1.一种莱氏野村菌菌株，其保藏编号为CGMCC No.13564，属于半知菌纲、丝孢目、淡色菌科、绿僵菌属，分类命名Metarhizium rileyi。

2.权利要求1所述的莱氏野村菌菌株在防治淡剑灰翅夜蛾中的用途。