CN104130958B - 一株枯草芽孢杆菌及其在防治牡丹根结线虫病上的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株枯草芽孢杆菌及其在防治牡丹根结线虫病上的应用。该菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株SDBRM01，保藏编号为CGMCC No.8546。实验表明，本发明的枯草芽孢杆菌SDBRM01具有菌株新颖、高效、活体菌含量高的特点，在离体条件下，发酵液稀释5倍，作用48h，对线虫的抑制率为90.3％，在盆栽条件下，枯草芽孢杆菌SDBRM01可湿性粉剂200倍防治牡丹根结线虫病效果显著，防治效果达到72.05％，且牡丹生长健壮，无药害产生，冠重增加了11.3g/株，因而在生物防治牡丹根结线虫病中具有重要应用前景。

Description

一株枯草芽孢杆菌及其在防治牡丹根结线虫病上的应用

技术领域

本发明属于微生物应用领域。具体而言，本发明涉及一种枯草芽孢杆菌菌株及其用途。

背景技术

牡丹是我国的传统名花，是山东省菏泽市重要的旅游品牌和对外交往的城市名片，同时还是农业的六大主导产业之一，在菏泽市经济社会发展中有着特殊的地位和作用。目前，菏泽市牡丹总面积已发展到10万余亩，年产值近30亿元。但是，由于根结线虫的危害严重影响了牡丹的生产和销售，丹皮质量和产量严重下滑，同时根结线虫是国内外重要的检疫对象，直接影响了出口贸易。近些年来，在牡丹、芍药等花卉种植区，根结线虫病呈逐年加重的趋势，发病率一般在15％左右，病重地块达30％以上，严重影响牡丹、芍药的开花率和丹皮产量，给花农造成重大经济损失。

根结线虫属于线虫门、侧尾腺口纲、垫刃目、异皮总科、根结线虫属。全世界已报道的根结线虫有85种，其中在我国分布最为广泛的是南方根结线虫、北方根结线虫、花生根结线虫和爪哇根结线虫等4种。根结线虫是一种定居型内寄生线虫，寄生于作物、蔬菜和花卉中，其侵染性二龄幼虫侵入寄主根系，迁移至维管束后固定取食；幼虫持续取食，吸收植物体内营养，干扰寄主根系的正常生理过程，致使寄主植物显现特异性的根结病害症状，如根部膨大，出现肿瘤，破坏植物根系水分、养分的正常疏导。病株地上部分生长衰弱、矮小，有的甚至整株枯死。线虫代谢过程中的分泌物还会刺激寄主植物的细胞和组织，导致植株畸形。此外，由于根结线虫的侵染造成大量伤口，有利于土壤中植物病原菌的侵染，致使次生病害易于发生，造成农林作物产量的损失和品质下降。

防治植物寄生线虫的方法主要有物理、化学和生物防治方法及改变栽培措施等。物理防治主要通过温度、射线、声波等来杀死线虫，该方法存在很大的应用局限性。化学杀线虫剂多为剧毒农药(如24-D、铁灭克、克线磷等)，污染土壤和水体，破坏生态环境，严重威胁人类健康。生物方法主要是利用线虫天敌以及寄生线虫的真菌或细菌等来防治线虫，但由于生物防治主体存在一定的地域性和寄主特异性，影响了不同地区、不同寄主植物的防治效果。现在一般采用轮作等栽培措施来降低植物寄生线虫的发病率。而轮作并不适合牡丹种植。杀线虫剂的作用环境大多是土壤，而土壤是一个非常复杂的生态系统，其中的各种生物因素和非生物因素会影响到杀线细菌的对线虫的作用。

目前，文献报道的防治根结线虫病的生物菌剂主要是防治番茄根结线虫病的，且防治效果欠佳。由于牡丹为多年生落叶小灌木，番茄是一年生草本植物，两者的生活习性相差较大，根部土壤环境不同，牡丹根系分泌物与番茄根系分泌物不同，对根际细菌对寄主植物的识别、定殖影响不同。因此，现有的防治番茄根结线虫病的生物菌剂不容易在牡丹上定殖，防治效果不好。

发明内容

为了针对牡丹根结线虫病进行防治，本发明经诱变筛选获得一株枯草芽孢杆菌菌株SDBRM01，该菌株容易在在牡丹根系周围定殖，且防治牡丹根结线虫的效果好，具有良好的应用前景。

本发明的另一个目的是提供一种枯草芽孢杆菌菌株SDBRM01制备的发酵液和菌剂。

本发明所提供的菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)SDBRM01，它是以从山东省寿光市田柳镇王五村大棚土壤中分离获得的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)SGBs-02菌株为出发菌株，经过紫外诱变(UV处理30s)的正突变株离体筛选和活体试验，获得的一株对牡丹根结线虫具有较强杀线虫效果的生防菌株。该菌株已于2013年12月6日保藏于中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏号为CGMCC No.8546。其具有以下微生物学特性：菌体杆状，革兰氏阳性菌，周生鞭毛，兼性厌氧。NA培养基培养菌落圆形，黄白色，平展，表面略粗糙，中间有圆环形突起，边缘整齐。液体培养形成菌膜，液体颜色棕黄色，浑浊，有沉淀。该菌株的16S rRNA基因序列测定结果如SEQ-1所示。

本发明枯草芽孢杆菌(B.subtilis)(SDBRM01)CGMCC No.8546培养方法或繁殖方法：

普通培养采用NA培养基保存。实验室液体培养采用NYBD液体培养基。NYBD配方：牛肉浸膏8g，酵母浸膏5g，葡萄糖10g，氯化钠4.5g，水1000mL，pH 7.3。大量发酵培养配方(重量百分含量)：黄豆粉3.0％，玉米粉3.0％，轻质碳酸钙0.2％，氯化钠0.1％，其余为水，pH 7.3。培养条件：培养温度28℃，初始pH7.3，装液量70％，接菌量3.0％，培养时间30h，通风比1：0.8。采用此培养基发酵培养，菌数可达85亿/g。

另一方面，本发明提供一种枯草芽孢杆菌可湿性粉剂，所述可湿性粉剂通过包括以下步骤的方法制得：

(1)将保存的枯草芽孢杆菌菌株SDBRM01转移至NA试管斜面中，置于培养箱28℃恒温培养2-3d；

(2)在无菌条件下，将培养好的枯草芽孢杆菌SDBRM01用无菌水稀释(每个试管斜面加入5mL无菌水)，吸取1mL，置于NB或者NYBD液体培养基中，28℃摇床振荡培养12～18h得到种子液；

(3)按3.0％比例(体积比)将种子液接种到大量发酵培养基中，培养温度28℃，培养时间28～32h，通风比1：0.8(V/V)。发酵完成后，菌数可达85亿/g；

(4)将枯草芽孢杆菌SDBRM01发酵液与发酵基质按照1:1.2～1.8的质量比进行混合均匀，干燥，得到枯草芽孢杆菌SDBRM01菌粉；所述发酵基质选自草炭、微粉碳酸钙和膨润土中的一种或多种；然后加入辅料制成可湿性粉剂，优选配方及制备工艺如下：

(5)按下述重量份取各原料：干燥好的枯草芽孢杆菌SDBRM01菌粉30％；淀粉8％；十二烷基硫酸钠8％；羧甲基纤维素钠0.3％；拉开粉2％；豆粕粉10％；凹凸棒土余量；

(6)上述原料混合均匀，控制加工温度0-50℃，在气流粉碎机或其它高目粉碎机，粉碎到150筛目以上水分控制在6-8％(质量百分含量)，pH控制在7-7.5，可湿性粉剂中的枯草芽孢杆菌SDBRM01含量为≥0.1亿活菌/g。

该可湿性粉剂可以用作生物农药，用于防治牡丹根结线虫病。因此，又一方面，本发明提供枯草芽孢杆菌SDBRM01或者其发酵液或者本发明的可湿性粉剂用于具有防治牡丹根结线虫病中的用途，同时还具有用于促进牡丹生长的用途。

本发明还提供一种用于防治牡丹根结线虫病的方法，所述方法包括向发生根结线虫病的牡丹根部施用枯草芽孢杆菌SDBRM01或者其发酵液或者本发明的可湿性粉剂。

实验表明，本发明的枯草芽孢杆菌SDBRM01具有菌株新颖、高效、活体菌含量高的特点，在离体条件下，发酵液稀释5倍，作用48h，对线虫的抑制率为90.3％，在盆栽条件下，枯草芽孢杆菌SDBRM01可湿性粉剂200倍防治牡丹根结线虫病效果显著，防治效果达到72.05％，且牡丹生长健壮，无药害产生，冠重增加了11.3g/株，因而在生物防治牡丹根结线虫病中具有重要应用前景。同时相比其它的防治根结线虫病的生物菌剂，本发明的枯草芽孢杆菌在土壤中，通过牡丹根系分泌物SDBRM01更容易识别牡丹根系，更容易在在牡丹根系周围定殖，并且通过牡丹根系分泌的糖类、氨基酸以及维生素等获取生长和繁殖所需的营养，因此更适合于防治牡丹的根结线虫病。

附图说明

图1为以16SrDNA序列为基础的SDBRM01菌系统发育树。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是示例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1枯草芽孢杆菌菌株SDBRM01的诱变筛选与鉴定

一、菌株的诱变及筛选

(1)出发菌株：枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis SGBs-02菌株，山东省寿光市田柳镇王五村大棚土壤中分离获得。

(2)培养基：

NA培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂14g，水1000mL，pH7.3；

NB培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，水1000mL，pH7.3；

(3)诱变体准备

将SGBs-02菌株斜面28℃活化培养24h，挑取2-3环，接种于盛有100mL的NB培养液的三角瓶中(250mL)，200r/min振荡培养12h，作为种子液，吸取2mL种子液，接种到NYBD培养液中，振荡培养36h，4℃保存，备用。

(4)UV诱变处理

将培养好的菌液用无菌水稀释成105cfu/mL，取4mL加入灭菌的培养皿中，于30W紫外灯，垂直距离30cm，照射30s，暗处放置15min后，致死率为87.96％。将吸取100μL涂NA平板，28℃培养36h。

(5)杀线菌株筛选

将诱变获得所有菌株分别活化后，接种到NB液体培养基中，28℃，200r/min振荡培养30h，取发酵液1mL，加入30μL线虫液，以无菌水为对照，28℃恒温培养，48h观察线虫死亡情况，筛选杀线活性较强的菌株。

(6)对牡丹根系分泌液高亲和性菌株筛选

取10cm高牡丹幼苗，用蒸馏水多次冲洗后，置于装有50mL蒸馏水的三角瓶中，密封瓶口，培养15d后获得含有牡丹根系分泌物的培养液，将获得具有较强杀线活性的菌株分别接种于含有500μL/皿的牡丹根系分泌液的NA平板，28℃培养3d，从中获得对牡丹根系分泌液亲和性强的菌株，通过综合考虑杀线活性及与牡丹根系分泌物亲和性，筛选获得一株高效杀线活性，且易在牡丹根系定殖的生防菌株SDBRM01。

二、菌株鉴定

(1)微生物学特性：SDBRM01菌株杆状、具周生鞭毛，长为5-10μm，宽0.7-1.4μm，革兰氏染色阳性。菌株在NA和NB培养基上28℃培养48h后，菌落圆形，平展，呈黄白色，表面不规则，中间有圆环形突起，边缘整齐，不产色素。液体培养形成菌膜，液体颜色棕黄色，浑浊，有沉淀。菌株表现菌株好氧生长。

供试菌株SDBRM01在所处理的各种温度下，均可正常生长；强酸、强碱环境不适宜该菌株生长，pH5～9条件下，菌株可以正常生长；NaCl浓度在2％～10％之间，菌株生长性状一致。氧化酶阳性，硝酸盐还原试验弱阳性，能利用柠檬酸盐，不产生脲酶，不产H₂S，VP试验阳性，其它特性见下表1：

表1 SDBRM01菌株的生理生化特性

(2)分子生物学特性：其16S rRNA基因序列测定结果如下(SEQ-1)：

TGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGACAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGCTTGTTTGAACCGCATGGTTCAAACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTAGAGCCAGCCGCCGAAGGTGACATT

将SDBRM01菌株的16SrDNA扩增序列在NCBI数据库中比对，与B.subtilissubsp.inaquosorum(JF411298)同源性为99％，结合SDBRM01菌株的形态特征、生理生化特性，确定SDBRM01属于枯草芽孢杆菌B.subtilis。

此菌株已于2013年12月6日保藏于中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏号为CGMCC No.8546。

实施例2枯草芽孢杆菌SDBRM01对牡丹根结线虫室内效果验证

1.实验方法

1.1根结线虫二龄幼虫悬浮液的制备

从牡丹根部挑取根结线虫新鲜卵块，置于贝曼漏斗中孵化，24h后开始收集1次，共收集7d。线虫液稀释为含二龄幼虫100条/mL，4℃保存、备用。

1.2卵悬浮液的制备

将有根结线虫的牡丹根剪碎后放入三角瓶中，加0.5％NaClO液100mL，用力摇1～2min后，快速倒入200～500目筛组中并用自来水冲洗10min，收集500目筛网中的卵，稀释成浓度为3000粒/mL的卵悬浮液。

1.3室内离体测定

采用室内离体培养法，分设2种试验：①在培养皿(直径为7.5cm)中加入2mL二龄幼虫的悬浮液，再加入SDBRM01发酵液5倍、10倍，清水作对照。重复3次。分别在12h、24h和36h观察线虫的活力；②在培养皿中加入2mL根结线虫卵悬浮液，再加入SDBRM01发酵液2倍、5倍、10倍，清水作对照，重复3次，分别在4d、6d、8d和10d观察卵的孵化情况。

2结果

2.1 SDBRM01发酵液对牡丹根结线虫二龄幼虫的抑制作用

从表1可以看出，处理后12h，SDBRM01发酵液稀释5倍和10倍对幼虫的抑制作用略高于清水对照组，但无显著差异。处理后24h、36h和48h，两处理组对牡丹根结线虫二龄幼虫(J2)的抑制作用逐渐加强，于对照差异显著，在处理后48h，5倍稀释发酵液的抑制率可达89.8％。

表1 SDBRM01对牡丹根结线虫二龄幼虫的抑制作用

2.2 SDBRM01发酵液对牡丹根结线虫卵孵化率的影响

表2 SDBRM01处理后牡丹根结线虫卵的孵化率

从表2可以看出，SDBRM01发酵液的3个处理的卵孵化率低于清水对照组，4～6d可以明显抑制卵的孵化。

实施例3枯草芽孢杆菌菌株SDBRM01可湿性粉剂的制备

(1)将保存的枯草芽孢杆菌SDBRM01转移至NA试管斜面中，置于培养箱26℃恒温培养2-3d；

(2)在无菌条件下，将培养好的枯草芽孢杆菌SDBRM01用无菌水稀释(每个试管斜面加入5mL无菌水)，吸取1mL，至于NB液体培养基中，28℃摇床振荡培养1～2d得到种子液；

(3)按3.0％比例(体积比)将种子液接种到大量发酵培养基中，培养温度28℃，培养时间36h，通风1：0.8。发酵完成后，菌数可达80亿/g；

(4)将枯草芽孢杆菌发酵液基质选自草炭、微粉碳酸钙和膨润土中的一种或多种进行混合均匀，干燥；

(5)可湿性粉剂的组分及其重量比：干燥好的枯草芽孢杆菌菌粉30％；淀粉10％；十二烷基硫酸钠8％；羧甲基纤维素钠0.3％；拉开粉2％；豆粕粉10％；凹凸棒土余量；

(6)上述原料混合均匀，控制加工温度0-50℃，在气流粉碎机或其它高目粉碎机，粉碎到150筛目以上水分控制在6-8％(质量百分含量)，pH控制在7-7.5。

实施例4枯草芽孢杆菌SDBRM01可湿性粉剂的作用验证

本实施例提供了枯草芽孢杆菌SDBRM01可湿性粉剂针对牡丹根结线虫病的相关实验。

1.1供试药剂

本发明实施例3制备的枯草芽孢杆菌SDBRM01可湿性粉剂。

1.2温室盆钵试验

将供试3年生牡丹苗播种于直径为21.5cm的塑料盆中(盆中土壤为高温灭菌土)。移栽2d后，分别加入200、400和600倍稀释的可湿性粉剂100mL，2d后以每株3000粒卵的接种量分别滴注到盆栽牡丹的根部，各处理重复3次。接种后在20～28℃培养56d后缓慢取出各接种植株，在水中洗净根系，分别称根重和冠重。将根系置于解剖镜下，记录根结数、卵块数(用0.05％薯红溶液染色3～4min)和每卵块平均卵量(以随机取10块卵块的平均卵量计，将10块卵块溶于1ml的0.5％NaClO溶液中，震荡1min后吸取50ul记数，重复3次)。按Duncan多重比较测验各处理间的差异显著性(p﹤0.01)。

1.3药效计算方法

药效按式(1)计算：

2.结果

2.1盆栽试验

从表3可以看出，可湿性粉剂稀释200倍处理牡丹植株56 d后，植株的冠重比对照增加11.3g/株，明显促进牡丹的生长，抑制根结线虫的侵入，根系上的根结数目比对照明显减少。200倍处理还对雌虫的产卵能力有抑制作用，平均每卵块卵量显著少于对照组。

表3 SDBRM01可湿性粉剂对牡丹根结线虫病防治的温室盆钵试验结果

注：表中数据后不同的小写字母表示经Duncan多重比较后差异显著(P<0.05)。

3.小结

从牡丹根重、冠重、卵块数、根结数以及卵数来看，枯草芽孢杆菌SDBRM01对牡丹根结线虫病具有较好的防治效果，稀释200倍后防治效果可达72.05％，可以控制根结线虫对牡丹的危害。同时牡丹生长健壮，无药害产生，冠重增加了11.3g/株，因此具有促进植株生长的作用。

Claims (8)

1.枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株SDBRM01，所述菌株的保藏编号为CGMCC No.8546。

2.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株SDBRM01在防治牡丹根结线虫病上的应用。

3.一种含有权利要求1所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株SDBRM01的可湿性粉剂。

4.权利要求3所述的可湿性粉剂的制备方法，其特征是，

(1)将保存的枯草芽孢杆菌菌株SDBRM01转移至NA试管斜面中，置于培养箱28℃恒温培养2-3d；

(2)在无菌条件下，将培养好的枯草芽孢杆菌菌株SDBRM01置于NB液体培养基或者NYBD液体培养基中，28℃摇床振荡培养12～18h得到种子液；

(3)按3.0％的体积比将种子液接种到大量发酵培养基中，培养温度28℃，培养时间28～32h，通风比1：0.8(V/V)；所述大量发酵培养基的组分及其重量比为：黄豆粉3.0％，玉米粉3.0％，轻质碳酸钙0.2％，氯化钠0.1％，其余为水，pH 7.3；

(4)将枯草芽孢杆菌SDBRM01发酵液与发酵基质按照1:1.2～1.8的质量比进行混合均匀，干燥，得到枯草芽孢杆菌SDBRM01菌粉；然后加入辅料制成可湿性粉剂。

5.如权利要求4所述的制备方法，其特征是，所述可湿性粉剂的组分及重量比为：枯草芽孢杆菌SDBRM01菌粉30％；淀粉8％；十二烷基硫酸钠8％；羧甲基纤维素钠0.3％；拉开粉2％；豆粕粉10％；凹凸棒土余量。

6.如权利要求4所述的制备方法，其特征是，所述发酵基质选自草炭、微粉碳酸钙和膨润土中的一种或多种。

7.权利要求3所述的可湿性粉剂在防治牡丹根结线虫病上的应用。

8.一种用于防治牡丹根结线虫病的方法，其特征是，向发生根结线虫病的牡丹根部施用权利要求1所述的枯草芽孢杆菌菌株SDBRM01及其发酵液或者权利要求3所述的可湿性粉剂。