CN107058163A - 一株解淀粉芽孢杆菌及其在防治柑橘溃疡病中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株解淀粉芽孢杆菌F9(Bacillus amyloliquefaciens F9)及其在防治柑橘溃疡病中的应用。该F9菌株，于2016年9月26日，保藏于中国武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2016519。在平板拮抗实验中发现，该F9菌株具有抑制柑橘溃疡病菌活性，抑菌圈26.5mm；该F9菌株4天的发酵液上清具有抑菌活性，抑菌圈直径能达到26.5mm；在体外接种实验中发现，该F9菌株可以抑制柑橘溃疡病菌的扩展和定植。因此，该解淀粉芽孢杆菌F9能作为生防菌应用于柑橘溃疡病的防治。

Description

一株解淀粉芽孢杆菌及其在防治柑橘溃疡病中的应用

技术领域

本发明涉及生物高技术领域，特别涉及一株解淀粉芽孢杆菌及其在防治柑橘溃疡病中的应用。

背景技术

随着科学技术的发展，化学农药被研发出来。因其高效、广谱受到了全世界的青睐。但是，也因为化学农药的滥用导致了严重的生态、食品安全问题，如：环境污染、农药残留，不仅破坏了生态系统，也影响了食品的价值以及人类的健康。而生物防治则不同，其利用自然的或经过改造的生物、基因或基因产物来减少有害生物的作用，使其有利于有益生物如作物、树木、动物和益虫及微生物。利用生物防治的原理研究出的生物农药具有广阔的应用前景。

生物农药区别于化学农药是其利用生物活体或其代谢产物，针对农业有害生物进行杀灭或抑制的制剂，具有绿色、安全、无污染的优点。其主要作用机制有很多种包括：拮抗作用，竞争作用，促进植物生长和激发抵抗系统提高抵抗力。中国农业科学院植物研究所邱德文课题组从真菌中提取出一种激活蛋白能够诱导植物免疫，商品名为‘阿泰灵’。该蛋白不仅能诱导植物免疫而且能促进植物的生长。施用激活蛋白制剂后植株的叶绿素大概能增长10％，对根系、株高都有促进作用。华东理工大学张道敬课题组分离到多粘类芽孢杆菌以及海洋芽孢杆菌，它们在杀菌、促植物生长方面有很好的效果。汪华等发明的‘高氏15号微生物菌剂’可以延后了青枯病的发生时间，使病害爆发的时间控制在果实全部转化成商品后，从而减少了青枯病对作物的危害，提高经济效益。在已发明的100多种细菌类生物农药中，苏云金杆菌(Bacillus thuringiersis,B.t.)是目前世界上用途最广、应用最成功的生物杀虫剂，占生防制剂总量90％以上。还有许多其他细菌可以分泌抗菌物质，如芽孢杆菌产生的抗菌肽，可以拮抗细菌、真菌、病毒及肿瘤等。近年来多肽类抗生素的研究受到广泛的关注。筛选新型的生防菌，深入研究其抗菌活性成分及其抑菌机制对于开发新型的生物农药具有重要意义。

柑橘溃疡病菌(Xanthomonas axonopodis pv.citri)，菌体短杆状，两端圆，极生单鞭毛，能游动，革兰氏染色反应阴性，好气性，有荚膜，无芽胞，大小为1.5-2.0μm×0.5-0.7μm。柑橘树染病后，落叶落果，影响树势和产量。果实发病，品质变劣，商品价值降低，且不耐贮藏。苗木感病，生长受阻，叶片脱落，延迟出圃或不能出圃。陈力(2008)筛选到一株柑橘溃疡病病菌的拮抗菌CQBS03，经鉴定为枯草芽孢杆菌，其发酵液对柑橘溃疡病菌的抑制效果很好。筛选柑橘溃疡病菌生防菌的研究还刚刚起步，科学家们依然不断筛选对柑橘溃疡病具有防治效果的不同微生物，以期制备更多更好的生防制剂。我们采用平板抑菌圈法筛选对柑橘溃疡病具有较强防治效果的拮抗菌，以期得到新的防治柑橘溃疡菌的生防菌。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一株解淀粉芽孢杆菌。

本发明的另一目的在于提供所述解淀粉芽孢杆菌的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一株解淀粉芽孢杆菌，名称为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)F9，于2016年9月26日保藏于位于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M 2016519。

所述的解淀粉芽孢杆菌的形态生理特征如下：菌落呈白色、圆形、边缘不整齐、有凸起、半透明、初期表面有光滑的膜包被、粘液状、后期表面形成褶皱；细胞呈杆状，两端钝圆，周生鞭毛，呈单个或短链排列。

所述的解淀粉芽孢杆菌在防治柑橘溃疡病中的应用。

一种用于防治柑橘溃疡病的微生物制剂，含有上述解淀粉芽孢杆菌。

一种抑制柑橘溃疡病菌活性的物质，来自于上述解淀粉芽孢杆菌的发酵上清液。

所述的发酵上清液通过如下步骤制备得到：将上述解淀粉芽孢杆菌接种于发酵培养基中培养，固液分离，所得液体即为发酵上清液。

所述的培养的条件优选为28～30℃、150～200rpm培养。

所述的培养的时间优选为1天以上。

所述的发酵培养基包括LB、Landy、YSB、BPY、NYD、PDB、YPG、YPD和玉米粉液体培养基；优选为YPD培养基。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

本发明提供的解淀粉芽孢杆菌对柑橘溃疡病的抑菌作用效果好，培养4天的发酵液抑菌圈直径能达到22mm。

附图说明

图1：菌株F9在复筛中产生的抑菌圈的照片图。

图2：菌株F9的形态照片图；其中，A为菌落的形态图；B为单个细菌的扫描电镜图。

图3：菌株F9的分类鉴定；β-甘露聚糖酶基因PCR扩增图片；其中，泳道M为DNAMarker(DS5000)，泳道1为16SrDNA，泳道2为使用引物Bsu-man-1F和Bsu-man-1R的扩增结果；泳道3为用Bam-man-1F和Bam-man-1R的扩增结果。

图4：菌株F9在LB液体培养基发酵得到上清液产生的抑菌圈的照片图。

图5：优化培养基提高上清液抑菌活性物质产量的检测结果图。

图6：柑橘叶片上测试F9菌对柑橘溃疡病的抑菌结果图；其中，叶片的左上角为无菌水阴性对照，右上角为F9阴性对照，左下角为xac阳性对照，右下角为实验组。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

(1)解淀粉芽孢杆菌的初步筛选：取湖南省一柑橘园土壤1g加到10ml无菌水中，200rpm培养30min，然后用水稀释，稀释梯度为10×、100×和1000×，取100μl各梯度的稀释液涂布于含有柑橘溃疡病菌(Xac-jx6,Xanthomonas citri pv.citri strain jx-6菌株,简称Xac-jx6，该菌株全长基因组已在NCBI GenBank上公开，序列号为NCBI ReferenceSequence:NZ_CP011827.2，网址为https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NZ_CP011827.2,)的LB固体培养基上。含有Xac的LB固体培养基的配制：用LB液体培养基培养Xac-jx6菌，于28℃，200rpm培养到OD₆₀₀大约在1左右，然后在40～50℃以每毫升LB培养基配比10μl菌悬液的比例混匀，每皿大约倒10ml的培养基，得到含Xac-jx6的平皿)，28℃培养48h，观察有无抑菌圈，有抑菌圈的菌落划线纯化，进行复筛。

(2)复筛：将初筛得到的菌划线纯化，挑取单菌落在含有200μl LB液体培养基的96孔板中培养至菌液浑浊(大约12h)，得到生防菌液。含有Xac-jx6X的LB固体培养基用直径5mm的打孔器打孔，取10μl生防菌液加入孔内，28℃培养1天，观察有无抑菌圈。共筛选到8株具有抑菌圈，其中一株抑菌圈较大，直径约26.5mm，如图1所示，命名为F9的菌株。保存该菌株，并接下来对该菌株进行分类鉴定。

(3)F9菌株的分类鉴定：

①F9菌株在LB固体平板(28℃培养)上的生长形态如图2A所示：菌落呈白色、圆形、边缘不整齐、有凸起、半透明、初期表面有光滑的膜包被、粘液状、后期表面形成褶皱(如图2A所示)。

②F9菌株扫描电镜下的形态分析照片，如图2B所示，细胞呈杆状，两端钝圆，周生鞭毛，呈单或呈短链排列。

③将F9菌株按照标准方法根据MS(i)/C005-C01(《常见细菌系统鉴定手册》，《伯杰细菌鉴定手册》)对生防菌F9进行生理生化检测，得到的结果如表1所示：

表1：生防菌株F9生理生化特征

说明：“+”表示阳性；“-”表示阴性

④根据16S rDNA序列进行菌株分类。设计能特异扩增16SrDNA的引物，引物序列如下：1.F27：5’-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3；2.R1492：5’-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3’。以F9菌株基因组DNA为模板，以F27和R1492为引物对进行PCR扩增，获得约1500bp DNA片段测序。得到的16SrDNA序列如下所示：

TGGCAGTGCGGGTGCTATACATGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTCTGAACCGCATGGTTCAGACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCCGTTCAAATAGGGCGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTATGGAGCCAGCCGCCGAAGGTGATAAATTA。

在NCBI上进行同源性比对，选取5株同源性最高的菌株，结果如表2所示。

表2：16srDNA的同源序列比较分析

根据比对结果，初步确定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。

⑤设计能扩增β-甘露聚糖酶基因序列的引物。引物对Bsu-man-1F和Bsu-man-1R能特异扩增枯草芽孢杆菌β-甘露聚糖酶基因；引物对Bam-man-1F和Bam-man-1R能特异扩增解淀粉芽孢杆菌β-甘露聚糖酶基因。引物对序列如下所示：

1.Bsu-man-1F：5’-CAGGCTCACACTTTGTCTTG-3’；

2.Bsu-man-1R：5’-TGAACACAGTCCTGGGTTAG-3’；

3.Bam-man-1F：5’-TCGGTTTCACATCCTTCATC-3’；

4.Bam-man-1R：5’-TTTGTCAGCGTGTCTTCTG-3’；。

两对引物对的特异PCR扩增目的条带大小均为1287bp。

以扩增16S rRNA和β-甘露聚糖酶基因序列为引物，以F9菌株的基因组DNA为模板进行PCR扩增，结果如图3所示:泳道1是引物对(F27和R1492)PCR扩增16SrDNA片段的结果，电泳结果显示有一条大小约1500bp的条带；泳道2是引物对(Bsu-man-1F和Bsu-man-1R)特异扩增枯草芽孢杆菌β-甘露聚糖酶基因片段的结果，电泳结果显示没有扩增条带；泳道3是用引物对(Bam-man-1F和Bam-man-1R)特异PCR扩增解淀粉芽孢杆菌β-甘露聚糖酶基因片段的结果，显示有一条大小1287bp条带。F9菌株在泳道2没有出现枯草芽胞杆菌特异β-甘露聚糖酶基因条带扩增，而在泳道3出现解淀粉芽孢杆菌β-甘露聚糖酶基因1287bp特异扩增，说明F9菌株属于解淀粉芽孢杆菌。因此，最终确定得到的F9菌株为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)。

将F9菌株进行生物保藏，保藏信息如下：名称为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)F9，于2016年9月26日保藏于位于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M 2016519。

实施例2

(1)发酵上清液的制备

配制100ml LB液体培养基，按照1％的接种量接种实施例1获得的生防菌(即F9菌)，28℃、200rpm培养3天。发酵液用8000rpm离心15min，上清液用0.22μm的细菌过滤器过滤，得到发酵上清液，取10μl加入到有Xac-jx6的LB固体培养基(预先打直径5mm的孔)，28℃过夜培养，结果如图4，显示上清液含有抑菌物质。接着筛选最佳产活性物质的培养基。

(2)最佳产活性物质的培养基的筛选

配制Landy、YSB、BPY、NYD、PDB、YPG、YPD和玉米粉等八种液体培养基(具体组成见表3)各10ml，调节pH值在7.0左右，用无菌枪头挑取生防菌接种于培养基中，28℃、200rpm培养3天。培养生防菌得到的各种培养液各取1ml，12000rpm离心15min，用0.2μm细菌过滤器过滤除菌，得到待检测样品。各取10μl待检测样品加入到有xac的LB固体培养基(预先打直径5mm的孔)中，设三个重复，28℃过夜培养。测量抑菌圈大小，确定合适的培养基。抑菌圈越大，生防菌在该培养基中分泌的抑菌物越多。结果见图5，从图5中可以看出YSB的培养基活性物质最多，YPD次之但是较YSB差距不大。但是比较YSB和YPD的培养基配方，发现YPD的配方所需的物质较YSB少，但是活性产物差距不大，所以YPD被选为诱导F9菌株产抑菌活性物质最佳培养基。

表3:选用培养基配方

实施例3

(1)菌种的培养：

接种Xac-jx6单菌落LB液体培养基，在28℃、200rpm下培养，，生长到OD₆₀₀＝0.6左右，5000rpm离心10分钟收集菌体，用无菌水悬浮，调节OD₆₀₀＝1.0左右，得到xac菌液；

接种F9单菌落到LB液体培养基，在28℃、200rpm下培养，直到OD₆₀₀0.6左右，5000rpm离心10分钟收集菌体，用无菌水悬浮，调节OD₆₀₀＝1.0左右，得到F9菌液。

(2)F9菌株防治Xac-jx6柑橘活体接种实验

为测试生防菌F9在室外活体的抑制效果，进行了柑橘活体接种实验。接种主要采用针刺叶片接种菌液的方法。接种时用1ml注射器带(针头)，用针头在叶片背面刺出伤口，每个伤口接种3μl。以叶脉为分界线，左右两侧为相同条件的重复实验，一个叶片内设置无菌水阴性对照，F9阴性对照，Xac+水(1:1)阳性对照以及Xac+F9+水(2:1:1)实验组。第二天在叶片上喷水，用透明的塑料袋套住，使叶片保湿，便于叶片发病，经过一段时间(15天)后观察防治效果，结果如图6所示。

柑橘溃疡病病斑为黄色火山口的凸起，周围会有黄色晕圈。由结果如图6可以看出，只接种Xac-jx6菌阳性对照接种点周围，有黄色凸起病斑，周围扩散有黄色晕圈，表明在该试验中Xac-jx6可以成功感染柑橘叶片；而无菌水和菌株F9接种阴性对照叶片，则没有明显的黄色凸起病斑和晕圈症状，表明阴性对照没有感染；在同时接种Xac-jx6和F9的实验组中，可以看到黄色凸起病斑和晕圈大小均较阳性对照明显减小，表明F9菌株可以有效抑制Xac-jx6在柑橘体内的扩展和定值。这些结果表明解淀粉芽孢杆菌F9菌株在体内接种柑橘条件下，可以有效抑制柑橘溃疡病菌侵染。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 华南农业大学

<120> 一株解淀粉芽孢杆菌及其在防治柑橘溃疡病中的应用

<130> 1

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 引物F27

<400> 1

agagtttgat catggctcag 20

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 引物R1492

<400> 2

tacggttacc ttgttacgac tt 22

<210> 3

<211> 1455

<212> DNA

<213> 解淀粉芽孢杆菌

<400> 3

tggcagtgcg ggtgctatac atgcaagtcg agcggacaga tgggagcttg ctccctgatg 60

ttagcggcgg acgggtgagt aacacgtggg taacctgcct gtaagactgg gataactccg 120

ggaaaccggg gctaataccg gatggttgtc tgaaccgcat ggttcagaca taaaaggtgg 180

cttcggctac cacttacaga tggacccgcg gcgcattagc tagttggtga ggtaacggct 240

caccaaggcg acgatgcgta gccgacctga gagggtgatc ggccacactg ggactgagac 300

acggcccaga ctcctacggg aggcagcagt agggaatctt ccgcaatgga cgaaagtctg 360

acggagcaac gccgcgtgag tgatgaaggt tttcggatcg taaagctctg ttgttaggga 420

agaacaagtg ccgttcaaat agggcggcac cttgacggta cctaaccaga aagccacggc 480

taactacgtg ccagcagccg cggtaatacg taggtggcaa gcgttgtccg gaattattgg 540

gcgtaaaggg ctcgcaggcg gtttcttaag tctgatgtga aagcccccgg ctcaaccggg 600

gagggtcatt ggaaactggg gaacttgagt gcagaagagg agagtggaat tccacgtgta 660

gcggtgaaat gcgtagagat gtggaggaac accagtggcg aaggcgactc tctggtctgt 720

aactgacgct gaggagcgaa agcgtgggga gcgaacagga ttagataccc tggtagtcca 780

cgccgtaaac gatgagtgct aagtgttagg gggtttccgc cccttagtgc tgcagctaac 840

gcattaagca ctccgcctgg ggagtacggt cgcaagactg aaactcaaag gaattgacgg 900

gggcccgcac aagcggtgga gcatgtggtt taattcgaag caacgcgaag aaccttacca 960

ggtcttgaca tcctctgaca atcctagaga taggacgtcc ccttcggggg cagagtgaca 1020

ggtggtgcat ggttgtcgtc agctcgtgtc gtgagatgtt gggttaagtc ccgcaacgag 1080

cgcaaccctt gatcttagtt gccagcattc agttgggcac tctaaggtga ctgccggtga 1140

caaaccggag gaaggtgggg atgacgtcaa atcatcatgc cccttatgac ctgggctaca 1200

cacgtgctac aatggacaga acaaagggca gcgaaaccgc gaggttaagc caatcccaca 1260

aatctgttct cagttcggat cgcagtctgc aactcgactg cgtgaagctg gaatcgctag 1320

taatcgcgga tcagcatgcc gcggtgaata cgttcccggg ccttgtacac accgcccgtc 1380

acaccacgag agtttgtaac acccgaagtc ggtgaggtaa cctttatgga gccagccgcc 1440

gaaggtgata aatta 1455

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 引物Bsu-man-1F

<400> 4

caggctcaca ctttgtcttg 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 引物Bsu-man-1R

<400> 5

tgaacacagt cctgggttag 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 引物Bam-man-1F

<400> 6

tcggtttcac atccttcatc 20

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 引物Bam-man-1R

<400> 7

tttgtcagcg tgtcttctg 19

Claims (8)

1.一株解淀粉芽孢杆菌，命名为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)F9，该菌于2016年9月26日，保藏于中国武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2016519。

2.权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌在防治柑橘溃疡病中的应用。

3.一种用于防治柑橘溃疡病的微生物制剂，其特征在于：含有权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌。

4.一种抑制柑橘溃疡病菌活性的物质，其特征在于：来自于权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌的发酵上清液。

5.根据权利要求4所述抑制柑橘溃疡病菌活性的物质，其特征在于：所述的发酵上清液通过如下步骤制备得到：将上述解淀粉芽孢杆菌接种于发酵培养基中培养，固液分离，所得液体即为发酵上清液。

6.根据权利要求5所述抑制柑橘溃疡病菌活性的物质，其特征在于：所述的培养的条件为28～30℃、150～200rpm培养。

7.根据权利要求6所述抑制柑橘溃疡病菌活性的物质，其特征在于：所述的培养的时间优选为1天以上。

8.根据权利要求5所述抑制柑橘溃疡病菌活性的物质，其特征在于：所述的发酵培养基为LB液体培养基、Landy液体培养基、YSB液体培养基、BPY液体培养基、NYD液体培养基、PDB液体培养基、YPG液体培养基、YPD液体培养基或玉米粉液体培养基。