CN115197869A - 一株具有广谱抑菌活性的解淀粉芽孢杆菌zjlmba1908及其应用 - Google Patents

一株具有广谱抑菌活性的解淀粉芽孢杆菌zjlmba1908及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株具有广谱抑菌活性的解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)ZJLMBA1908菌株及其应用。ZJLMBA1908菌株于2019年11月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.18907。本发明研究表明ZJLMBA1908菌株对多种动植物病原菌具有广谱抑菌性，平均抑菌率为50.79％；其中，ZJLMBA1908菌株可强烈抑制柑橘溃疡病菌，抑制率达72.5％；经过ZJLMBA1908菌株处理后能显著降低柑橘溃疡病菌对柑橘的危害，为动植物病原菌的防治提供新的微生物菌株和防治方法策略，具有很好的生物防治效果。

Description

一株具有广谱抑菌活性的解淀粉芽孢杆菌ZJLMBA1908及其 应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域。更具体地，涉及一株具有广谱抑菌活性的解淀粉芽孢杆菌ZJLMBA1908及其应用。
背景技术
在农业生产中，无论是动物还是植物都会因为病原菌感染而导致动植物患病，从而不能完成正常的生长发育过程，造成产品品质下降甚至减产。在生产上，对动植物病害的防治多选择化学药剂进行，然而因为化学药剂长期、大量使用，导致病原菌出现不同程度的抗药性，逐渐出现田间药剂防效降低的情况。再加上化学药剂的滥用导致环境污染、农药残留等，不仅带来了食品安全问题，还破坏了生态系统。近年来，因为“绿色防控”理念深入人心，研发以减少农药化肥施用为目的环境友好型防治药剂逐渐发展成为主流。
目前不仅需要降低化学农药的使用，还需要采取不同的防治措施进行防治，在生物防治中，筛选对动、植物病原菌感染具有防治效果的微生物菌株是目前的研究热点，其制备的微生物菌剂因为对病原菌选择性强、对人畜、环境和天敌安全，具有绿色无污染等特点，已经成为当前生防资源研究的热点。在农业种植领域筛选新型的生防菌，深入研究其抗菌活性成分及其抑菌机制对于开发新型的生物农药具有重要意义。而在水产领域，将微生物菌剂作为抗生素的替代品用于水产养殖中，也将具有更广泛的应用前景。
芽胞杆菌(Bacillus)具有抑菌谱广、抗逆性强、可分泌多种抗菌物质、生产成本低、安全性高等优点，在生物防治中占有重要地位，而解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)是目前研究得最多的芽孢杆菌之一。目前研究表明解淀粉芽孢杆菌及其代谢产物可用于防治多种植物病害，其防治效果是优于化学药剂的防治效果，如中国专利公开的解淀粉芽孢杆菌BA-KA3和解淀粉芽孢杆菌SCAU-070，能够抑制小麦赤霉病菌、小麦纹枯病菌、烟草赤星病菌、辣椒疫霉病菌、辣椒炭疽病菌、花生褐斑病菌、梨黑斑病菌、大蒜菌核病菌、无乳链球菌、海豚链球菌、藤黄微球菌和副溶血性弧菌等植物或动物病原菌等；但目前具有广谱抑菌性的菌株还较少，其抑菌效果还有待提升，还未见能抑制其他不同病原菌的菌株，因此，亟需用研发出更多的具有优良性能和对多种动植物病害具有较强防治效果的拮抗菌，以期得到新的抗菌谱更宽的生防菌，或从中获取其合成的特异性抗菌活性物质，为种植业和水产养殖业中常见的病害防治提供更安全、更高效的防治手段和途径。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服上述问题的缺陷和不足，提供一株具有广谱抑菌活性的解淀粉芽孢杆菌ZJLMBA1908及其应用。
本发明的第一个目的是提供一株具有广谱抑菌活性的解淀粉芽孢杆菌ZJLMBA1908。
本发明的第二个目的是提供所述解淀粉芽孢杆菌ZJLMBA1908的应用。
本发明的第三个目的是提供一种动植物病原菌抑制剂剂。
本发明的第四个目的是提供一种抑制动植物病原菌和/或防治动植物病害的方法。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
本发明提供一株具有广谱抑菌活性的解淀粉芽孢杆菌ZJLMBA1908，已于2019年11月5日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏登记号为：CGMCC No.18907，该菌株是从感染柑橘溃疡病的柠檬叶片内生菌中分离得到，经形态学、16S rDNA等方法鉴定为出该菌株属于芽孢杆菌属(Bacillus sp.)-解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。ZJLMBA1908菌株的菌落呈白色，菌落边缘不整齐，裂片状，初期表面粘液状，后期表面干燥并向外扩展，逐渐变干，形成皱褶。革兰氏阳性，细胞杆状，有芽孢，无荚膜，最适生长温度为30℃。
本发明通过对多种不同动植物病原菌的拮抗活性测定表明，ZJLMBA1908菌对植物病原菌柑橘黄单胞柑橘亚种(Xanthomonas citri subsp.citri)、香蕉枯萎病菌(Fusariumoxysporum f.sp.Cubense，FOC4)，火龙果溃疡病菌(Neoscytalidium dimidiatum(Penz.)Crous&Slippers)、野生稻叶斑病菌(Nigrospora oryzae)、蓖麻根腐病菌(Fusariumsolani)和动物病原菌鱼类链球病病原菌海豚链球菌(Streptococcus iniae)都具有较强的拮抗活性，抑菌圈直径分别为327、224、335、262、320、150mm，抑菌率分别为72.5％、46.38％、38.51％、52.15％、32.70％和62.5％。其中，ZJLMBA1908菌株可明显抑制柑橘黄单胞柑橘亚种的生长，抑制效果达72.5％，具有强烈的抑制作用，同时可以有效的抑制柑橘溃疡病菌对柑橘的侵染。
本发明提供所述解淀粉芽孢杆菌ZJLMBA1908菌株和/或其菌液在抑制动植物病原菌、在制备动植物病原菌抑制剂或在防治由动植物病原菌引起的动植物病害中的应用。
优选地，所述动植物病原菌为柑橘黄单胞柑橘亚种溃疡病菌(Xanthomonas citrisubsp.citri)、香蕉枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.Cubense，FOC4)，火龙果溃疡病菌(Neoscytalidium dimidiatum(Penz.)Crous&Slippers)、野生稻叶斑病菌(Nigrosporaoryzae)、蓖麻根腐病菌(Fusarium solani)和/或鱼类链球病病原菌海豚链球菌(Streptococcus iniae)ZJ0903菌株中的一种或多种。
特别地，本发明研究表明解淀粉芽孢杆菌ZJLMBA1908对上述几种动植物病原菌都具有较好的抑制效果，那么ZJLMBA1908菌株对由这几种动植物病原菌引起的病害也具有一定的防治效果。
优选地，所述农业病害为柑橘溃疡病、香蕉枯萎病、火龙果溃疡病、野生稻叶斑病、蓖麻根腐病和/或鱼类链球病中的一种或多种。
本发明提供一种动植物病原菌抑制剂剂，含所述解淀粉芽孢杆菌ZJLMBA1908菌株和/或其菌液。
本发明提供一种抑制动植物病原菌和/或防治农业病害的方法，采用所述解淀粉芽孢杆菌ZJLMBA1908菌株对患病寄主进行处理。
优选地，将解淀粉芽孢杆菌ZJLMBA1908菌株配制成菌液后直接喷施到患病寄主上。
优选地，所述菌液的配制方法为：将ZJLMBA1908菌接种于培养基中，置于25～50℃培养24～36h，150～200rpm，即得。
优选地，置于30℃培养24～36h，180rpm。
优选地，所述菌液的浓度为1.0×103～1.0×1010cfu/mL。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供的ZJLMBA1908菌株对多种动植物病原菌具有广谱抑菌性，平均抑菌率为50.79％；可以抑制植物病原菌柑橘黄单胞柑橘亚种、香蕉枯萎病菌、火龙果溃疡病菌、野生稻叶斑病菌和蓖麻根腐病菌以及水产动物病原菌海豚链球菌；同时ZJLMBA1908菌株还可以有效的抑制柑橘溃疡病菌对柑橘的侵染，经过ZJLMBA1908菌株处理后能显著降低柑橘溃疡病菌对柑橘的危害。因此，该菌株可以作为一种环境友好型的绿色药剂替代化学农药用于柑橘溃疡病、香蕉枯萎病、火龙果溃疡病、野生稻叶斑病和蓖麻根腐病以及鱼类链球菌病的防治中，提供新的微生物菌株和防治方法策略，具有很好的生物防治效果。
附图说明
图1为ZJLMBA1908在NA培养基上的菌落形态；
图2为ZJLMBA1908的营养细胞和芽孢的形态；
图3为ZJLMBA1908菌株的16S rDNA PCR电泳图；
图4为ZJLMBA1908菌株对植物病原菌的拮抗效果图。
图5为ZJLMBA1908菌株对动物病原细菌的拮抗效果图；
图6为ZJLMBA1908菌株在室外活体的抑制效果图。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
NA培养基：牛肉膏5.0g、蛋白胨10.0g、NaCl 5.0g、琼脂20.0g，蒸馏水定容至1000mL，121℃，20min，灭菌备用；
NA液体培养基：牛肉膏5.0g、蛋白胨10.0g、NaCl 5.0g，蒸馏水1000mL定容至1000mL，121℃，20min，灭菌备用。
实施例1菌株的筛选分离
将感染柑橘溃疡病的柠檬病叶用清水洗净，然后剪取大小约为4mm2的病健交界处组织，先放入75％酒精中浸泡30s，再用2％的次氯酸钠浸泡30s，随后用无菌水漂洗3次。收集最后一次冲洗液100μL在NA培养基上进行涂布，置于30℃培养过夜，以确定表面消毒完全。
将表面消毒好的样品组织块移入1.5mL离心管中，加入少量无菌水研磨后静置30min，用移液枪吸取100μL菌悬液，依次稀释至10-5，每个梯度3个重复，30℃培养2～6d，观察并记录结果。根据菌落的颜色及形态，将不同菌种在NA培养基上进行划线纯化以得到该菌株的单菌落，所得菌株于-80℃保存备用。
实施例2菌株的分类鉴定
1、形态学鉴定
将实施例1中分离得到的菌株置于NA固体平板上，30℃培养后，NA固体平板上菌落的生长形态如图1所示：菌落呈白色，菌落边缘不整齐，裂片状，初期表面粘液状，后期表面干燥并向外扩展，逐渐变干，形成皱褶。
将菌株进行革兰氏染色分析，结果如图2所示：细胞呈杆状，两端钝圆，单个或呈链状排列，产芽孢，芽孢位于细胞中间，革兰氏染色为紫色，为革兰氏阴性菌。
2、16Sr DNA鉴定
按照TaKaRa细菌基因组DNA提取试剂盒的方法提取上述菌株的DNA，作为16Sr DNA扩增的模板，16S rDNA的通用引物采用27F:5’-AGAGTTTGAT CCTGGCTCAG-3’，1492R:5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’进行PCR扩增，PCR反应体系(共25μL)，其中ddH2O 17.6μL，dNTP 2.5μL，buffer 2.5μL，上下游引物(27F+1492R)各0.5μL，Taq酶0.4μL，DNA模板μL；反应条件为96℃，5min；95℃，45s，55℃，30s，72℃，60s；35个循环，72℃，7min。
PCR扩增完成后取5μL产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，电压120V，电泳25min，凝胶成像系统观察目的条带如图3所述，扩增片段长度约为1500bp。将目的条带的PCR产物送至英潍捷基(上海)贸易有限公司测序，所得序列长度为1438bp，根据16S测序结果，菌株的16S rDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
将所得菌株序列与NCBI上登陆的核酸序列库进行同源比对分析，结果显示与该菌株16S rDNA序列相近的多为芽孢杆菌属(Bacillus sp.)-解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)，并挑选5株同源性最高的菌株进行比较，比较结果如下表1所示。
表1 16S rDNA的同源序列比较分析
Figure BDA0003653083450000051
Figure BDA0003653083450000061
根据上述形态学鉴定、16Sr DNA以及同源性比对结果确定该菌株为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，命名为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)ZJLMBA1908菌株，该菌株于2019年11月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏登记号为：CGMCC No.18907，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
实施例3菌株的广谱抑菌性
1、ZJLMBA1908菌株对植物病原细菌的拮抗活性测定：
采用病原菌：柑橘黄单胞柑橘亚种(Xanthomonas citri subsp.citri)zlm1908菌株、香蕉枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.Cubense，FOC4)和火龙果溃疡病菌(Neoscytalidium dimidiatum(Penz.)Crous&Slippers)、野生稻叶斑病菌(Nigrosporaoryzae)、蓖麻根腐病菌(Fusarium solani)上述病原菌均有由广东海洋大学植物保护教研室分离保存。
柑橘黄单胞柑橘亚种：挑取病原菌单菌落在NA液体培养基中，置于30℃培养24～36h，180rpm，得到OD600＝1的菌液。取50μL病原菌菌液，稀释102倍后取100uL涂布于NA固体平板上，直至菌液吸收完全。再取2μL拮抗菌ZJLMBA1908菌液(OD600＝1)滴于铺有病原菌的平板上，重复三次，30℃培养2～6d，记录抑菌圈大小并拍照。
香蕉枯萎病菌、火龙果溃疡病菌、野生稻叶斑病菌和蓖麻根腐病菌：采用平板对峙培养法进行病原真菌的拮抗作用测定。在PDA培养基中心接种直径4.0mm的病原真菌的菌饼，在距中心25.00mm左右2个点分别接种待测菌株，各处理3个重复，置于28℃黑暗培养，待对照组病原真菌长满整皿后，观察处理组有无抑菌圈及抑菌圈的大小，分别测定处理组及对照组的菌落直径，计算抑菌率。
抑菌率＝(对照真菌菌落直径-处理真菌菌落直径)/对照真菌菌落直径×100％结果如图4所示，表明ZJLMBA1908菌株对香蕉枯萎病原菌(图4A)、火龙果溃疡病菌(图4B)、野生稻叶斑病菌(图4C)、蓖麻根腐病菌(图4D)和柑橘黄单胞柑橘亚种(图4E)有抑制作用；再对各植物病原菌的抑菌圈直径进行统计分析，表明ZJLMBA1908菌株对各植物病原菌的抑菌圈直径分别为327、224、335、262、320mm，并计算得到抑菌率分别为46.38％、38.51％、52.15％、32.70％和72.5％。
2、ZJLMBA1908菌株对动物病原菌的拮抗活性测定：
采用病原真菌：水产动物鱼类的病原菌海豚链球菌(Streptococcus iniae)ZJ0903菌株，无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)ZQ0903菌株，由广东海洋大学广东省水产动物病害防控与健康养殖重点实验室提供。
具体检测方法同上述步骤1中柑橘黄单胞柑橘亚种的测定方法。
结果如图5所示，表明ZJLMBA1908菌株对鱼类链球病病原菌海豚链球菌ZJ0903菌株有较强的拮抗活性(见图5F)，其抑菌圈直径为150mm，抑菌率达62.5％；但从图5G中显示出ZJLMBA1908菌株对鱼类链球菌病病原无乳链球菌ZQ0903菌株不产生抑菌圈没有拮抗活性。
实施例4 ZJLMBA1908菌株对柑橘溃疡病的防治
为了测试ZJLMBA1908菌株在室外活体的抑制效果，进行了柑橘盆栽苗活体接种实验，接种主要采用针刺叶片接种菌液的方法。接种时用灭菌的昆虫针针头沾上柑橘溃疡病菌，并在叶正面刺出伤口，然后每个伤口接种3μLZJLMBA1908菌液，然后用灭菌的脱脂棉滴入适量的无菌水保湿，三天后去掉保湿的脱脂棉，统一水肥管理。本实施例设置两个处理组，第一个处理组为接种后让植物自然发病，另一个处理组为每天对接种叶片的接种部位施加含ZJLMBA1908生防菌(浓度为1.0×108cfu/mL)的菌液约150μL，每天观察发病情况，20天左右观察防治效果。
柑橘溃疡病病斑刚开始针头大小，后为灰褐色木栓化，呈火山口开裂，周围有黄色晕圈，结果如图6所示，可以看出自然发病的叶片上，接种点周围，有黄色凸起病斑，周围扩散有黄色晕圈，叶片部分组织坏死，表明在该试验中柑橘黄单胞柑橘亚种可以成功感染柑橘叶片。而每天施加含ZJLMBA1908菌株菌液的叶片，接种部位有出现针头大小的凸起，但是没有木栓化，没有黄色晕圈，叶片组织没有坏死。结果表明含解淀粉芽孢杆菌ZJLMBA1908菌株的菌液可以有效的抑制柑橘溃疡病菌对柑橘的侵染。
综上所述，本发明开了一株具有广谱抑菌活性的解淀粉芽孢杆菌ZJLMBA1908菌株，本发明研究表明ZJLMBA1908菌株对多种动植物病原菌具有广谱的抑菌作用；在平板拮抗实验中表明，该菌株可以抑制植物病原菌：柑橘黄单胞柑橘亚种、香蕉枯萎病菌4号小种、火龙果溃疡病菌、野生稻叶斑病菌和蓖麻根腐病菌以及抑制水产动物病原菌海豚链球菌，抑菌率分别为72.5％、46.38％、38.51％、52.15％、32.70％和62.5％；而解淀粉芽孢杆菌ZJLMBA1908菌株还可以有效的抑制柑橘溃疡病菌对柑橘的侵染。因此，该菌株可以作为一种环境友好型的绿色药剂替代化学农药用于柑橘溃疡病、香蕉枯萎病、火龙果溃疡病、野生稻叶斑病和蓖麻根腐病以及鱼类链球菌病的防治中，提供新的微生物菌株和防治方法策略，具有很好的生物防治效果。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一株具有广谱抑菌活性的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)ZJLMBA1908菌株，其特征在于，该菌株于2019年11月5日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.18907。
2.权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌ZJLMBA1908菌株和/或其菌液在抑制动植物病原菌或在制备动植物病原菌抑制剂中的应用。
3.权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌ZJLMBA1908菌株和/或其菌液在防治由动植物病原菌引起的农业病害中的应用。
4.根据权利要求2或3所述应用，其特征在于，所述动植物病原菌为柑橘黄单胞柑橘亚种(Xanthomonas citri subsp.citri)、香蕉枯萎病菌(Fusarium oxysporumf.sp.Cubense，FOC4)，火龙果溃疡病菌(Neoscytalidium dimidiatum(Penz.)Crous&Slippers)、野生稻叶斑病菌(Nigrospora oryzae)、蓖麻根腐病菌(Fusarium solani)和/或鱼类链球病病原菌海豚链球菌(Streptococcus iniae)中的一种或多种。
5.根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述农业病害为柑橘溃疡病、香蕉枯萎病、火龙果溃疡病、野生稻叶斑病、蓖麻根腐病和/或鱼类链球病中的一种或多种。
6.一种动植物病原菌抑制剂剂，其特征在于，含权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌ZJLMBA1908菌株和/或其菌液。
7.一种抑制动植物病原菌和/或防治农业病害的方法，其特征在于，采用权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌ZJLMBA1908菌株对患病寄主进行处理。
8.根据权利要求7所述方法，其特征在于，将权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌ZJLMBA1908菌株配制成菌液后直接喷施到患病寄主上。
9.根据权利要求8所述方法，其特征在于，所述菌液的配制方法为：将ZJLMBA1908菌接种于培养基中，置于25～50℃培养24～36h，150～200rpm，即得。
10.根据权利要求9所述方法，其特征在于，所述菌液的浓度为1.0×103～1.0×1010cfu/mL。
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