CN103966118A - 解淀粉芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一株海洋解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)M001及其应用，所述的解淀粉芽孢杆菌M001保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期2013年11月4日，保藏号为CGMCC No.8433。该菌株分离筛选自牙鲆鱼肠道，能明显提高养殖鱼非特异性免疫水平，增强养殖鱼抵御细菌病原感染的能力。

Description

解淀粉芽孢杆菌及其应用
技术领域
本发明涉及水产微生物应用技术领域，具体的说是一种解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)及其应用。
背景技术
我国水产养殖产量连续十多年居世界首位，成为大农业中发展最快的产业之一。由于养殖业多年的集约式快速发展，加上养殖环境不断恶化、养殖品种抗逆性衰退，最终导致养殖动物病害频繁发生，直接造成巨大的经济损失。病害已成为限制水产养殖产业持续健康发展的瓶颈。我国水产病害的防治手段主要依赖抗生素等化学药物，由于抗生素带来的生态、环境以及食品安全等的不良影响，其在水产养殖的应用在国内外受到很多限制。益生菌是一类能够抑制病原微生物、改善养殖生态环境、调节动物体内生态平衡、增强肌体免疫功能、提高饲料利用效率等作用的有益微生物，许多商品化的益生菌制剂已在畜牧养殖业中广泛应用，以达到减少抗生素使用、控制疾病发生、促进动物生长的目的。目前用于水产养殖的益生菌多数来源于陆生环境或陆生动物，这些益生菌多数不适合在水生环境特别是海洋环境中生长和繁殖，导致其益生效应难以有效发挥。因此，从海洋环境或海洋动物中分离筛选土著菌作为益生菌来源，对保证海洋益生菌制剂的高效性和安全性特别关键。
发明内容
本发明目的在于提供一种海洋解淀粉芽孢杆菌及其应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种海洋解淀粉芽孢杆菌，海洋解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)M001保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期2013年10月5日，保藏号为CGMCC No.8433，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
一种解淀粉芽孢杆菌的应用，所述解淀粉芽孢杆菌用于制备微生物制剂。
所述解淀粉芽孢杆菌作为添加剂用于抑制海水鱼类病原菌、增强鱼类免疫功能的微生物制剂。
将所述解淀粉芽孢杆菌制成干菌粉。
进一步的说，将解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)M001在Zobell2216E海水固体培养基上划线，取一单菌落接种于2216E液体培养基中，在25-30℃培养6-8小时，即为种子液，将所得种子液按体积比1：100转接于新鲜的2216E液体培养基，在25-30℃、120-200rpm培养24-36小时，即为发酵液；所得发酵液在5000g离心30min，取菌泥在60℃恒温 干燥至衡重，而后与玉米淀粉混合制成干菌粉。
海洋解淀粉芽孢杆菌，即来源于牙鲆鱼类消化道的内源性解淀粉芽孢杆菌M001，该菌株不仅有抑制病原菌的效果，还能增强养殖鱼非特异性免疫水平和抵御病原菌感染的能力。
本发明所涉及的菌株信息如下：
1.来源。该菌株分离自健康牙鲆（Paralichthys olivaceus）消化道，经高剂量注射和投喂确定对养殖大菱鲆、牙鲆、舌鳎、小白鼠等安全，无致病性。
2.形态学特征。革兰氏染色阳性，在Zobell2216E海水固体培养基上、28℃培养2天的菌落形态直径大小为2～3mm，圆形，凸起，乳白色，表面粗糙，边缘不整。具有荚膜和芽孢，芽孢呈椭圆形。
3.生理生化特征。氧化酶反应阴性，过氧化氢酶反应阳性，鸟氨酸脱羧酶反应阴性，精氨酸双水解酶阳性，赖氨酸脱羧酶反应阳性，脲酶反应阴性，L-阿拉伯糖醇反应阴性，半乳糖酸盐反应阴性，5-酮基-葡萄糖酸钠反应阴性，脂肪酶反应阳性，酚红反应阴性，β-葡萄糖苷反应阳性，甘露醇反应阳性，麦芽糖反应阳性，吲哚产生阴性，N-乙酰-β-葡萄糖反应阴性，β-半乳糖苷酶反应阴性，葡萄糖反应阳性，蔗糖反应阳性，L-阿拉伯糖反应阴性，α-葡萄糖反应阳性，α-半乳糖苷酶反应阳性，海藻糖反应阳性，鼠李糖反应阳性，肌醇反应阳性，侧金盏花醇反应阴性，帕拉金糖反应阴性，β-葡萄糖酸酶反应阳性，纤维二糖反应阴性，山梨醇反应阳性，α-麦芽糖苷反应阳性，丙二酸利用阳性，L-天门冬素芳胺酶反应阳性。
1）16SrRNA基因序列如SEQ ID：1所示。
2）抗生素敏感性。用药敏纸片扩散法检测解淀粉芽孢杆菌M001对抗生素的敏感性，结果表1所示，该菌对6种抗生素敏感。
表1M001的抗生素敏感性
3）抑菌特性。利用牛津杯法检测解淀粉芽孢杆菌M001在2216E海水液体培养基的培养物上清对常见海水病原菌的抑菌作用，结果表2所示，该菌可以抑制迟缓爱德华氏菌、海豚链球菌、坎贝氏弧菌、鳗弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌。
表2M001的抑菌特性
4）产酶特性。如表3所示，解淀粉芽孢杆菌M001能够产生较强的蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶和淀粉酶。
表3M001的产酶特性
5）生长特性。如图1－图4所示，解淀粉芽孢杆菌M001在20℃-40℃、pH6-8、1%-4%NaCl的条件下具有良好的生长能力（参见图1-图4）。
6）抗逆特性。解淀粉芽孢杆菌M001在不同浓度胆盐的生长及在人工胃液的存活情况如图5所示，该菌在0.03%胆盐条件下具有良好的生长能力；在pH4人工胃液中作用1小时、3小时后，数量分别下降了2个、3个数量级，在pH2人工胃液作用1小时、3小时后，数量均下降了5个数量级。结果说明该菌具有较好的耐受胆盐和胃酸的能力（参见图5）。
本发明所具有的优点：
1.本发明的海洋解淀粉芽孢杆菌M001制备的微生物制剂，能够抑制海水鱼类病原菌，增强鱼类免疫功能，减少疾病发生，适合水产养殖生产。
2.本发明的解淀粉芽孢杆菌M001具有生长速度快、抑菌谱广、抗逆性强等特点，生产工艺简单、成本低，具有良好的商业前景。
3.本发明的解淀粉芽孢杆菌M001来源于海洋鱼类肠道，为内源性肠道益生菌，不仅适合在海洋环境生长繁殖，而且对养殖动物和人类不存在危险，在应用方面具有高效性和安全性。
附图说明书
图1为本发明实施例提供的解淀粉芽孢杆菌M001的生长曲线图。培养基为2216E液体培养基，培养温度25℃。
图2为本发明实施例提供的解淀粉芽孢杆菌M001在不同温度条件下的生长图。培养基为2216E液体培养基，pH7.6。
图3为本发明实施例提供的解淀粉芽孢杆菌M001在不同pH值条件下的生长图。培养基为2216E液体培养基,培养温度25℃。
图4为本发明实施例提供的解淀粉芽孢杆菌M001在不同ＮaCl含量条件下的生长图。培养基为2216E液体培养基,pH7.6，培养温度25℃。
图5为本发明实施例提供的解淀粉芽孢杆菌M001在不同胆盐含量条件下的生长图。培养基为2216E液体培养基,pH7.6，培养温度25℃。
具体实施方式
现参照下列实施例对本发明作进一步说明，实施例对本发明进行举例描述，而非以任何形式对本发明进行限制。
实施例1
解淀粉芽孢杆菌M001的干菌粉制备：
从-80℃保存的菌种在2216E海水固体培养基划线，在25℃-30℃培养，挑取单菌落接种在2216E海水液体培养基摇瓶培养6-8小时后获得种子液，所得种子液按体积比为1：100的比例转接在新鲜的2216E海水液体培养基中，在25-30℃、120-200rpm发酵培养24-36小时获得发酵液，所得发酵液在5000g离心30min，收获菌泥在60℃恒温干燥至衡重，所得细菌与玉米淀粉按重量1：5的比例混合制成干菌粉，每克干菌粉的M001活菌数不低于1012CFU。
所述的2216E海水培养基的组成，按质量百分比为：蛋白胨0.5%，酵母粉0.1%，硫酸亚铁0.01%，其余为陈海水。
实施例2
解淀粉芽孢杆菌M001干菌粉的应用：
步骤1)饲料制备。将解淀粉芽孢杆菌M001干菌粉添加在鱼类基础饲料（按质量百分比为：鱼粉40%、花生仁粕10%、大豆粕10%、菜籽粕8.4%、面粉26%、鱼油2%、预混料2%）中，配制成每克饲料含活解淀粉芽孢杆菌M001在108-109CFU的有益菌饲料，以蛋清为粘合剂，加适量水混合，用小型绞肉机挤压制成颗粒饲料，在60℃烘干至水分含量低于10%，分袋包装保存在4℃备用。
步骤2）大菱鲆养殖。平均体重为40.7g的健康大菱鲆180尾，暂养在循环水养殖系统2周后随机分为实验组和对照组两个处理组，每个处理组3个平行，每个平行组放鱼30尾。实验组投喂M001益生菌饲料，对照组投喂基础饲料，每日投喂饲料2次，日投饵量为鱼总体重的3%；每日换水1次，日换水量1/3。每隔2周停食24小时，对每组鱼称重以矫正日投喂量。实验期间养殖水温16-18℃，连续充气。整个养殖试验周期为6周。
步骤3）血清免疫指标检测。步骤2）试验鱼在养殖第6周时，从每组鱼随机取5尾鱼采血制备血清，检测血清溶菌酶活力、一氧化氮合成酶活力、超氧化物歧化酶活力、酸性磷酸酶活力、碱性磷酸酶活力、血清总蛋白含量。结果如表4所示，实验组鱼的血清在一氧化氮合成酶和超氧化物歧化酶活力、总蛋白含量方面显著高于对照组。因此，解淀粉芽孢杆菌M001干粉制剂能增强大菱鲆血液的非特异性免疫因子能力。
表4大菱鲆血清免疫指标
＊p＜0.05
步骤4）消化酶活力检测。同步采集步骤3）样品鱼的胃、肠道、肝脏检测蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶活力。结果如表5所示，实验组鱼肠道蛋白酶活力明显高于对照组鱼；同时，实验组鱼肝脏的蛋白酶和脂肪酶活力也明显高于对照组鱼。因此，解淀粉芽孢杆菌M001干菌粉能增强消化系统的部分酶活力。
表5大菱鲆消化道及肝脏消化酶活力
＊p＜0.05
步骤5）养殖大菱鲆的抗病力。取活的鳗弧菌M3株细胞用无菌海水悬浮至浓度为4.8×104CFU/mL，即为攻毒菌液，取步骤2）的各组实验鱼，各组取鱼25尾，每尾腹部肌肉注射100μl上述攻毒菌液。14天后，统计各组鱼的累积死亡率：实验组为（33.3±2.5）%，对照组为（89.3±8.3）%。因此，解淀粉芽孢杆菌M001大干菌粉能提高大菱鲆抵御鳗弧菌感染的能力。
SEQ ID：1
CTAATACATGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTG
AGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGG
ATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAGACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGAC
CCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTG
AGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGG
GAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGA
TCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCCGTTCAAATAGGGCGGCACCTTGACGGTAC
CTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTT
GTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCG
GCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCC
ACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTC
TGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAKCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCAC
GCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATT
AAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCA
CAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCC
TCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTC
GTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTG
CCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGAC
GTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGC
AGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAAC
TCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCC
GGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAAC
CTTTTAGGAGCCAGCCGCCGAA

Claims (5)

1.一种海洋解淀粉芽孢杆菌，其特征在于：海洋解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)M001保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期2013年11月5日，保藏号为CGMCC No.8433。
2.一种权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌的应用，其特征在于：所述解淀粉芽孢杆菌用于制备微生物制剂。
3.按权利要求2所述的解淀粉芽孢杆菌的应用，其特征在于：所述解淀粉芽孢杆菌作为添加剂用于抑制海水鱼类病原菌、增强鱼类免疫功能的微生物制剂。
4.按权利要求2或3所述的解淀粉芽孢杆菌的应用，其特征在于：将所述解淀粉芽孢杆菌制成干菌粉。
5.按权利要求4所述的解淀粉芽孢杆菌的应用，其特征在于：
将解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)M001在Zobell2216E海水固体培养基上划线，取一单菌落接种于2216E液体培养基中，在25-30℃培养6-8小时，即为种子液，将所得种子液按体积比1：100转接于新鲜的2216E液体培养基，在25-30℃、120-200rpm培养24-36小时，即为发酵液；所得发酵液在5000g离心30min，取菌泥在60℃恒温干燥至衡重，而后与玉米淀粉混合制成干菌粉。
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