CN105670976B - 一种解淀粉芽孢杆菌的发酵培养基及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种解淀粉芽孢杆菌的发酵培养基，它的pH值为6.8—7.8，包括蔗糖5—10g/L，玉米粉3—10g/L，豆粕粉20—40g/L，酵母粉0—2g/L，磷酸氢二钾1—10g/L，磷酸二氢钾1—5g/L，氢氧化钠0—2 g/L，硫酸镁0—3g/L，碳酸钙0—2 g/L，硫酸锰0—1 g/L，氯化铁0—2g/L，尿素1—5g/L；还公开了其用于制备解淀粉芽孢杆菌，包括摇瓶发酵培养和种子罐培养两大步骤；本发酵培养基的主要原料为廉价的农副产品，在进行大规模发酵时大大降低了生产成本，可以为解淀粉芽孢杆菌的发酵提供均衡的营养物质，促使解淀粉芽孢杆菌可以在短时间内大量的增殖并最终形成芽孢。

Description

一种解淀粉芽孢杆菌的发酵培养基及其应用

技术领域

本发明属于微生物发酵领域，具体涉及一种提高解淀粉芽孢杆菌（Bacillusamyloliquefaciens）生物量、缩短解淀粉芽孢杆菌发酵周期的发酵培养基及应用该发酵培养基培养解淀粉芽孢杆菌的方法。

背景技术

随着水产养殖模式向工厂化、集约化等方向转变，养殖密度和投饵量也大大增加，经济动物排泄物、残饵量、施药量等也相应增加，养殖水体污染更加严重。水质变坏的同时也极易引起经济动物疾病的爆发，伴随着抗生素等药物的大量使用。

众所周知，抗生素的应用对防治水产动物病害发挥了极其重要的作用，但抗生素的施用一方面严重破坏了养殖水体微生态环境，造成养殖水体自我修复功能的丧失，而且长期施用抗生素将造成耐药微生物的产生和增殖。另一方面，抗生素的施用也会通过食物链进入人体，直接危害人类健康。因此限制抗生素的施用，找到抗生素的替代品已经成为水产养殖业发展的必然趋势。

近年来， 人们开始尝试在养殖生产中使用有益微生物， 以改善养殖生态环境，提高养殖动物的免疫力， 抑制病原微生物， 从而减少疾病的发生等方面已经取得显著成效。其中， 芽孢杆菌制剂是一种常用高效益生菌添加剂。芽孢杆菌具有很多优点，包括耐酸、耐盐、耐高温及耐挤压等特性，因而在饲料的加工、贮藏以及通过动物胃肠道酸性环境等的过程中具有较高的稳定性。芽孢杆菌制剂在水产养殖中也得到广泛应用，并被公认为是具有发展前景的优良益生菌。

解淀粉芽孢杆菌是一种与枯草芽孢杆菌亲缘性很高的细菌，在其自身的生长过程中可以产生一系列的代谢产物 。这些代谢产物使得解淀粉芽孢杆菌具有广泛的抑制真菌和细菌的活性。目前国内外对解淀粉芽孢杆菌发酵的优化主要集中在产抗菌脂肽、α-淀粉酶、蛋白酶等酶类物质，较少研究解淀粉芽孢杆菌数量发酵优化，而研究此类菌数量发酵优化中，多数研究的目标在于提高单位体积发酵液活菌数量，对提高芽孢数量研究较少。但从微生物菌剂的保存、使用角度考虑，芽孢数量较活菌数量在生产上更具实际意义。

发明内容

本发明的目的之一是针对国内外已有发酵培养基的不足，提供一种解淀粉芽孢杆菌的发酵培养基，采用该发酵培养基具有成本低、发酵周期短、芽孢形成率高等特点。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种解淀粉芽孢杆菌的发酵培养基，它的pH值为6.8—7.8，包括如下重量的各组分

蔗糖5—10g/L，玉米粉3—10g/L，豆粕粉20—40g/L，酵母粉0—2g/L，磷酸氢二钾1—10g/L，磷酸二氢钾1—5g/L，氢氧化钠0—2 g/L，硫酸镁0—3g/L，碳酸钙0—2 g/L，硫酸锰0—1 g/L，氯化铁0—2g/L，尿素1—5g/L。

所述一种解淀粉芽孢杆菌的发酵培养基，其pH值为7.4—7.8，包括如下重量的各组分:蔗糖6g/L、玉米粉3.5g/L，豆粕粉30g/L，酵母粉0.3g/L，磷酸氢二钾6g/L，磷酸二氢钾3g/L，硫酸镁 0.6g/L，碳酸钙0.5g/L，硫酸锰 0.1g/L，氯化铁0.1g/L以及尿素1.5g/L。

所述一种解淀粉芽孢杆菌的发酵培养基，其蔗糖为一级白砂糖，所述的尿素为农业尿素，所述的豆粕粉为粉碎后的豆粕。

本发明的目的之二是提供上述发酵培养基用于制备解淀粉芽孢杆菌。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：发酵培养基用于制备解淀粉芽孢杆菌。

所述发酵培养基的应用，制备解淀粉芽孢杆菌时包括以下步骤：

a）、摇瓶发酵培养

将活化后的菌液接到摇瓶中培养，制成菌悬液后，在转速为200rpm/min、温度为35℃的条件下震荡培养6—10小时，当OD600=0.8—1.2时，即可接种种子罐，所述的摇瓶发酵培养基由5g/L的酵母提取物，10g/L的氯化钠，10g/L的胰蛋白胨和3g/L的蔗糖混合而成；

b）、种子罐培养

在种子罐内设置解淀粉芽孢杆菌的发酵培养基，将摇瓶培养菌液按接种量为1—3%的比例接入种子罐中，在通气量为1.4、温度为33℃、转速为180rpm/min的条件下，发酵培养8—18小时，待溶氧量下降到20—30%时，按照5—10%的接种量接种发酵罐。

进一步，所述的步骤b）中设置培养条件为pH7.2—8.0，优选pH值7.6±0.2，温度28—32℃，优选为31℃，转数170rpm/min。

进一步，所述的步骤b）中通气量、溶氧量和温度的控制如下：

开始发酵时，气液比为0.4—0.7；

发酵中期：当溶氧量下降至50%时，将气液比调整为1.2—1.7；

发酵后期：当溶氧量下降至50%时，将气液比调整为2.0—2.5，保持通气量，直至发酵结束，此过程中温度维持在30—32℃，转速160—200rpm/min。

本发明的有益效果是：

本发酵培养基的原料主要来自廉价的农副产品，且在进行解淀粉芽孢杆菌的发酵过程中，不仅提高了菌种数量，而且缩短了发酵周期、提高了产孢率，本发酵培养基对于解淀粉芽孢杆菌的临床生产更具有实际意义。

本发酵培养基用于制备解淀粉芽孢杆菌时，能够为解淀粉芽孢杆菌的大量增殖和最终形成芽孢提供均衡的营养物质，并在短时间内达到菌体的大量增殖并形成芽孢，并通过调节发酵过程中的通气量来控制发酵进程，进而控制菌种量的富集与芽孢的形成。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细说明。

本发明公开了一种解淀粉芽孢杆菌的发酵培养基，它的pH值为6.8—7.8，包括如下重量的各组分：蔗糖5—10g/L，玉米粉3—10g/L，豆粕粉20—40g/L，酵母粉0—2g/L，磷酸氢二钾1—10g/L，磷酸二氢钾1—5g/L，氢氧化钠0—2 g/L，硫酸镁0—3g/L，碳酸钙0—2 g/L，硫酸锰0—1 g/L，氯化铁0—2g/L，尿素1—5g/L。

当其pH值为7.4—7.8，各组分为蔗糖6g/L、玉米粉3.5g/L，豆粕粉30g/L，酵母粉0.3g/L，磷酸氢二钾6g/L，磷酸二氢钾3g/L，硫酸镁 0.6g/L，碳酸钙0.5g/L，硫酸锰 0.1g/L，氯化铁0.1g/L以及尿素1.5g/时达到最优配方。

所述的蔗糖为主要成分为蔗糖的一级白砂糖，所述的尿素为农业尿素，所述的豆粕粉为粉碎后的豆粕。

本发明发酵培养基的配方经过下面两个步骤得到：

先通过Google学术在数据库中搜索国内外的期刊，对解淀粉芽孢杆菌的发酵培养基进行收集、整理，然后利用发酵培养基成分及发酵原理对发酵培养基进行筛选；然后利用正交实验对筛选出的发酵培养基成分进行优化，得出最佳培养基组成及组分含量。

本发明还公开了上述发酵培养基用于制备解淀粉芽孢杆菌，包括以下步骤：

a）、摇瓶发酵培养

将活化后的菌液接到摇瓶中培养，制成菌悬液后，在转速为200rpm/min、温度为35℃的条件下震荡培养6—10小时，当OD600=0.8—1.2时，即可接种种子罐，所述的摇瓶发酵培养基由5g/L的酵母提取物，10g/L的氯化钠，10g/L的胰蛋白胨和3g/L的蔗糖混合而成；

b）、种子罐培养

在种子罐内设置解淀粉芽孢杆菌的发酵培养基，将摇瓶培养菌液按接种量为1—3%的比例接入种子罐中，在通气量为1.4、温度为33℃、转速为180rpm/min的条件下，发酵培养8—18小时，待溶氧量下降到20—30%时，按照5—10%的接种量接种发酵罐。

步骤b）中设置培养条件为pH7.6±0.2，温度28—32℃，转数170rpm/min。

步骤b）中通气量、溶氧量和温度的控制如下：

开始发酵时，气液比为0.4—0.7；发酵中期：当溶氧量下降至50%时，将气液比调整为1.2—1.7；发酵后期：当溶氧量下降至50%时，将气液比调整为2.0—2.5，保持通气量，直至发酵结束，此过程中温度维持在30—32℃，转速160—200rpm/min。

下面进一步阐述本发明的具体构建步骤，主要包括以下几个步骤：

1、解淀粉芽孢杆菌发酵培养基的筛选：

本发明利用Google学术搜素国内外期刊，查找出关于解淀粉芽孢杆菌的发酵培养基18种，然后结合菌种生长条件、发酵原理和产孢条件等对18种发酵培养基进行筛选，最后确定7种芽孢杆菌发酵培养基，进行后续实验。

2、解淀粉芽孢杆菌发酵培养基培养成分的确定：

分析发酵培养基的原理及产孢条件，并结合实际原料购买途径和价格等问题并结合单因素实验对培养基成分进行筛选，平板计数评价实验结果。最后确定主要培养基成分为：蔗糖、玉米粉、豆粕粉、尿素，其中蔗糖为主要成分是蔗糖的一级白砂糖，尿素为农业尿素，玉米粉和豆粕粉均为商品化产品。

3、解淀粉芽孢杆菌发酵培养基的成分含量的确定：

发酵培养基营养成分正交试验，最后确定培养基成分及含量：蔗糖6g/L、玉米粉3.5g/L，豆粕粉30g/L，酵母粉0.3g/L，磷酸氢二钾6g/L，磷酸二氢钾3g/L，硫酸镁 0.6g/L，碳酸钙0.5g/L，硫酸锰 0.1g/L，氯化铁0.1g/L以及尿素1.5g/。

4、发酵温度的确定：

将培养基接种后，调节pH为7.5±0.2，设定发酵温度分别为：28、29、30、31、32℃，摇床180rpm/min培养，测定菌种量和产孢率，实验重复三次。最后确定最佳温度31℃。

5、发酵pH的确定：

将培养基接种后，设定初始pH值分别为：7.2、7.4、7.6、7.8、8.0，摇床180rpm/min，温度31℃培养，测定菌种量和产孢率，实验重复三次。最后确定最佳pH为7.6±0.2。

6、发酵气液比的确定：

将培养基接种后，调节初始pH为7.5±0.2，发酵罐气液比分别为：0.5、1.5、2.0、2.3、2.5、3.0，转数170rpm/min，温度31℃发酵罐培养，测定菌种量和产孢率，实验重复三次。最后确定发酵气液比为2.5。当利用此最佳发酵条件：pH7.6±0.2，温度31℃，气液比2.5，发酵罐转数170rpm/min。发酵周期为55个小时，芽孢产生率达90%以上，菌种量达1.1×10¹⁰以上。

本解淀粉芽孢杆菌的发酵培养基及其应用，能够为解淀粉芽孢杆菌的大量增殖和最终形成芽孢提供均衡的营养物质，并在短时间内达到菌体的大量增殖并形成芽孢，并通过调节发酵过程中的通气量来控制发酵进程，进而控制菌种量的富集与芽孢的形成。

本发酵培养基的原料主要来自廉价的农副产品，且在进行解淀粉芽孢杆菌的发酵过程中，不仅提高了菌种数量，而且缩短了发酵周期、提高了产孢率，本发酵培养基对于解淀粉芽孢杆菌的临床生产更具有实际意义。

采用本发明所提供的解淀粉芽孢杆菌发酵培养基及其培养方法，其发酵液中芽孢形成率可达90%以上，菌种量达1.1×10¹⁰以上。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，以及部分运用的实施例，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (3)

1.一种解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens) 的制备方法，其特征在于：

使用的发酵培养基pH值为7.4-7.8，包括如下重量的各组分:蔗糖6g/L、玉米粉3.5g/L，豆粕粉30g/L，酵母粉0.3g/L，磷酸氢二钾6g/L，磷酸二氢钾3g/L，硫酸镁 0.6g/L，碳酸钙0.5g/L，硫酸锰 0.1g/L，氯化铁0.1g/L以及尿素1.5g/L；包括以下步骤：

a）、摇瓶发酵培养

将活化后的菌液接到摇瓶中培养，制成菌悬液后，在转速为200rpm/min、温度为35℃的条件下震荡培养6-10小时，当OD600=0.8-1.2时，即可接种种子罐，所述的摇瓶发酵培养基由5g/L的酵母提取物，10g/L的氯化钠，10g/L的胰蛋白胨和3g/L的蔗糖混合而成；

b）、种子罐培养

在种子罐内设置解淀粉芽孢杆菌的发酵培养基，将摇瓶培养菌液按接种量为1-3%的比例接入种子罐中，在通气量为1.4、温度为33℃、转速为180rpm/min的条件下，发酵培养8-18小时，待溶氧量下降到20-30%时，按照5-10%的接种量接种发酵罐；

其中通气量、溶氧量和温度的控制如下：

开始发酵时，气液比为0.4-0.7；

发酵中期：当溶氧量下降至50%时，将气液比调整为1.2-1.7；

发酵后期：当溶氧量下降至50%时，将气液比调整为2.0-2.5，保持通气量，直至发酵结束，此过程中温度维持在30-32℃，转速160-200rpm/min。

2.根据权利要求1所述的一种解淀粉芽孢杆菌的制备方法，其特征在于，所述的步骤b）中设置培养条件为pH7.2-8.0，温度28-32℃，转速170rpm/min。

3.根据权利要求2所述的一种解淀粉芽孢杆菌的制备方法，其特征在于，所述的pH值为7.6±0.2，温度为31℃。