CN116590176A

CN116590176A - 一种解淀粉芽孢杆菌的发酵培养基及其应用

Info

Publication number: CN116590176A
Application number: CN202310389675.9A
Authority: CN
Inventors: 王淑芳; 吕忠华; 陈玉玲; 方世杰; 覃强盛; 焦豫良; 陈静; 周向红; 杭新楠
Original assignee: Jiangsu Ocean University
Current assignee: Jiangsu Ocean University
Priority date: 2023-04-13
Filing date: 2023-04-13
Publication date: 2023-08-15

Abstract

本发明公开了一种解淀粉芽孢杆菌的发酵培养基，发酵培养基的组分由玉米糊精5‑25g/L，豆饼粉7.5‑17.5g/L，碳酸钙0.6‑1.4g/L；本发酵培养基的原料主要来自廉价的农副产品，同时进行单因素实验对最适发酵培养基成分进行发酵pH、发酵时间、装液量、接种量、温度和转速的优化，确定解淀粉芽孢杆菌SS‑26菌株的最佳发酵条件，在进行解淀粉芽孢杆菌的发酵过程中，不仅提高了菌种量，而且提高了抑菌活性，对水产常见致病菌有拮抗作用。

Description

一种解淀粉芽孢杆菌的发酵培养基及其应用

技术领域

本发明属于微生物发酵领域，具体涉及一种解淀粉芽孢杆菌的发酵培养基及其应用。

背景技术

目前，我国已经在水产养殖产品里发现致200多种病菌。在上世纪50年代初，我国科研人员就已经开始尝试使用抗生素来抑制或治疗由病原菌引起的各种水产疾病。然而，过量使用抗生素导致人类的健康也受到了威胁。目前，许多国家已明令禁止和限制使用抗生素，因此各国科研人员投身于动物健康养殖的研究，努力寻找抗生素的代替品。

全面禁止抗生素的使用，导致优质饲料短缺，而微生物发酵饲料因其安全无污染，能促进动物生长发育，提高机体免疫力，所以受到了越来越广泛的应用。利用微生物的新陈代谢和繁殖的生理活动，能够生产或调制出绿色、安全的高效发酵饲料，其在促进动物生长、替代抗生素和废弃物再生资源化等方面具有良好的发展前景。

近年来，芽孢杆菌因无毒性和无致病性而得到国内外的广泛关注，特别是解淀粉芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌。其中，解淀粉芽孢杆菌具有良好的抗菌性，在动物养殖中具有促进肠道健康、节约饲养成本、保护自然生态等优点，在动物养殖中应用广泛。解淀粉芽孢杆菌在代谢过程中可以产生大量的酶类、抑菌物质以及具有抗氧化和免疫作用的活性物质等。解淀粉芽孢杆菌因其高效的产酶特性，常被用于发酵饲料原料，可以有效改善饲料适口性、增加饲料营养成分、提高饲料利用率、增强动物机体免疫力、改善动物肠道微生态环境和降低养殖污染等优点，所以解淀粉芽孢杆菌已经成为饲料添加剂行业中不可替代的重要成员。

发明内容

本发明是针对国内外已有发酵培养基的不足，提供一种解淀粉芽孢杆菌的发酵培养基，确定解淀粉芽孢杆菌SS-26菌株的最佳发酵条件，提高解淀粉芽孢杆菌SS-26菌种量和抗弧菌KX1菌株活性。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种解淀粉芽孢杆菌的发酵培养基，，发酵培养基的组分由玉米糊精5-25g/L，豆饼粉7.5-17.5g/L，碳酸钙0.6-1.4g/L

进一步的，发酵培养基的组分由玉米糊精15g/L，豆饼粉10g/L，碳酸钙1.4 g/L混合而成。

进一步的，发酵培养基的最适发酵温度为30℃，最适发酵pH值为7，最适发酵装液量是50 mL，最适接种量为2%，最适发酵转速为200rpm/min，最适发酵时间为44h。

进一步的，通过发酵培养基使得发酵液中的菌种量达4.649×10⁹CFU/mL，抑菌带宽度达15.82mm。

一种解淀粉芽孢杆菌的发酵培养基的应用，用于制备解淀粉芽孢杆菌。

一种解淀粉芽孢杆菌的发酵培养基的应用，用于测定海洋解淀粉芽孢杆菌SS-26对弧菌KX1菌株的拮抗作用，包括病原菌菌液的制备和抑菌活性的测定，其中弧菌KX1是哈氏弧菌（Vibrio harveyi）。

与现有发酵培养基相比，本发明得到以下有益效果：

本发酵培养基的原料主要来自廉价的农副产品，同时进行单因素实验对最适发酵培养基成分进行发酵pH、发酵时间、装液量、接种量、温度和转速的优化，确定解淀粉芽孢杆菌SS-26菌株的最佳发酵条件，在进行解淀粉芽孢杆菌的发酵过程中，不仅提高了菌种量，而且提高了抑菌活性，对水产常见致病菌有拮抗作用。

采用本发明所提供的解淀粉芽孢杆菌发酵培养基及其培养方法，其发酵液中菌种量达4.649×10⁹CFU/mL，抑菌带宽度达15.82mm。

附图说明

图1是解淀粉芽孢杆菌SS-22菌株基础培养基的筛选结果图。

图2是碳源试验结果图。

图3是玉米糊精不同浓度下发酵液的OD600值和抑菌带宽度结果图。

图4是氮源试验结果图。

图5是豆饼粉在不同浓度下发酵液OD600值和抑菌带宽度结果图。

图6是无机盐试验结果图。

图7是CaCO3在不同浓度下发酵液OD600值和抑菌带宽度结果图。

图8是正交试验结果图。

图9是不同pH对SS-26菌株发酵液的抑菌带宽度及OD600值的影响分析图。

图10是不同温度对SS-26菌株发酵液的抑菌带宽度及OD600值的影响分析图。

图11是不同装液量对SS-26菌株发酵液的抑菌带宽度及OD600值的影响分析图。

图12是不同接种量对SS-26菌株发酵液的抑菌带宽度及OD600值的影响分析图。

图13是不同摇床转速对SS-26菌株发酵液的抑菌带宽度及OD600值的影响分析图。

图14是不同发酵时间对SS-26菌株发酵液的抑菌带宽度及OD600值的影响分析图。

实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的说明：

一种解淀粉芽孢杆菌的发酵培养基，发酵培养基的组分由玉米糊精5-25g/L，豆饼粉7.5-17.5g/L，碳酸钙0.6-1.4g/L。

作为优先实施例：发酵培养基的组分由玉米糊精15g/L，豆饼粉10g/L，碳酸钙1.4g/L混合而成。

基于上述实施例中，发明人通过知网搜索国内外的期刊，对解淀粉芽孢杆菌的发酵培养基进行收集、整理，然后利用发酵培养基成分及发酵原理对发酵培养基进行筛选；再利用单因素实验和正交试验对筛选出的发酵培养基成分进行优化，筛选出最适碳源、氮源和无机盐及其浓度，得出最佳培养基组成及组分含量。

下面进一步阐述本发明的具体构建步骤，主要包括以下几个步骤：

1、解淀粉芽孢杆菌发酵培养基的筛选：

在解淀粉芽孢杆菌的发酵培养基18种，然后结合菌种生长条件、发酵原理和产孢条件等对18种发酵培养基进行筛选，最后确定8种芽孢杆菌发酵培养基，进行发酵实验，筛选出最适发酵培养基。

在本发明应用到制备解淀粉芽孢杆菌时包括以下步骤：

a）、种子液制备

取1环活化24 h的解淀粉芽孢杆菌SS-26菌株接种于盛有50 mL PDB培养基的三角瓶中，放入摇床于28 ℃、180 r /min条件下振荡培养24 h，调整菌液浓度为10⁸CFU/mL，作为发酵用的种子液。

b）、初始发酵液制备

准备八种解淀粉芽孢杆菌液体培养基：

1、2216E培养基：蛋白胨5g，酵母膏1g，磷酸高铁0.01g，水1000mL；

2、NA培养基：蛋白胨10g，牛肉膏3g，NaCl 10g，水1000mL；

3、YPAD培养基：蛋白胨20g，酵母膏10g，葡萄糖20g，水1000mL；

4、NYD培养基：牛肉膏8g，酵母膏5g，葡萄糖10g，水1000mL；

5、BPY培养基：蛋白胨10g，牛肉膏5g，葡萄糖5g，NaCl 5g，水1000mL；

6、LB培养基：蛋白胨10g，酵母膏5g，NaCl 10g，水1000mL；

7、PDB培养基：土豆200g，葡萄糖20g，水1000mL；

8、NB培养基：牛肉膏3g，酵母膏5g，葡萄糖2.5g，NaCl 3g，MnSo₄5mg，水1000mL。

将种子培养液按2%的接种量接种到八种装有50mL发酵培养基的250 mL三角瓶中，pH 7.0、28 ℃、180 r/min条件下摇床振荡培养40h。将种子培养液按2%的接种量接种到八种装有50mL发酵培养基的250 mL三角瓶中，pH 7.0、28 ℃、180 r/min条件下摇床振荡培养40h，以上述摇瓶发酵初始条件进行试验，筛选出菌体密度最大的发酵培养基。

由图1可知，8种供试培养基中NYD培养基发酵液中的菌体密度OD₆₀₀值最高且抑菌带宽度最大，分别为3.832×10⁹CFU/mL和11.26mm，菌体密度OD₆₀₀值显著高于其它组培养基（P<0.05）。抑菌带宽度PDB和NYD的差异不显著，但显著高于其它组培养基（P<0.05），综合考虑选取NYD号培养基为解淀粉芽孢杆菌SS-26菌株的基础培养基

2、解淀粉芽孢杆菌发酵培养基培养成分的确定：

本发明在筛选出最适发酵培养基后，再利用单因素实验替换筛选出最适碳源：分别用等量的可溶性淀粉、乳糖、蔗糖、玉米糊精替代基础培养基中的碳源，以基础培养基为对照，其他发酵条件不变，进行发酵，每种碳源为1个处理，每个处理3次重复。测定不同处理发酵液的OD₆₀₀值和抑菌带宽度，筛选出最佳碳源。在筛选出的最佳碳源的基础上，在相同条件下设置(0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、0.25%)等不同浓度碳源的发酵培养基进行发酵，筛选最佳碳源浓度。

由图2可知，以玉米糊精为碳源的培养基的发酵液OD₆₀₀值和抑菌带宽度最高，分别为4.12×10⁹CFU/mL和13.68 mm，显著高于其它碳源培养基组（P<0.05）。因此，选择玉米糊精为最佳碳源。由图3可知，当玉米糊精浓度为15 g/L时，发酵液的OD₆₀₀值和抑菌带宽度最高，分别为4.34×10⁹CFU/mL和14.54mm，显著高于其它碳源浓度组（P<0.05）；当浓度低于或高于15 g/L时，发酵液中的抑菌带宽度和菌体密度均有所下降。因此，选用10、15、20 g/L作为正交试验碳源浓度的3个水平。

本发明继续利用单因素实验替换筛选出最适氮源：分别用等量的豆饼粉、牛肉膏、蛋白胨、(NH4)2SO4作为氮源加替代基础培养基中的氮源，以基础培养基为对照，其他发酵条件不变，进行发酵，每种氮源为1个处理，每个处理3次重复。测定不同处理发酵液的OD₆₀₀值和抑菌带宽度，筛选出最佳氮源。在筛选出的最佳氮源的基础上，在相同条件下设置(0.075%、0.1%、0.125%、0.15%、0.175%)等不同浓度氮源的发酵培养基进行发酵，筛选最佳氮源浓度。

由图4可知，以豆饼粉为氮源的培养基的发酵液OD₆₀₀值和抑菌带宽度最高，分别为4.168×10⁹CFU/mL和12.78 mm，显著高于其它氮源培养基组（P<0.05）。因此，选择豆饼粉为最佳氮源。

由图5可知，浓度为10 g/L时，发酵液OD₆₀₀值和抑菌带宽度最高，分别为4.26×10⁹CFU/mL和12.48mm，显著高于其它氮源浓度组（P<0.05）；当浓度高于或低于10 g/L时，发酵液中的抑菌带宽度和菌体密度均有所下降。因此，选用7.5 、10、12.5 g/L作为氮源浓度的3个水平。

本发明继续利用单因素实验筛选出最适无机盐：分别添加NaCl、CaCO₃、MgSO₄、和磷酸氢二钾，其他发酵条件不变，进行发酵，每种无机盐为1个处理，每个处理3次重复。测定发酵液的OD600值和抑菌带宽度，筛选出最佳无机盐。在筛选出的最佳无机盐的基础上，在相同条件下设置(0.006%、0.008%、0.01%、0.012%、0.014%)等不同浓度无机盐的发酵培养基进行发酵，筛选最佳无机盐浓度。

由图6可知，CaCO₃为无机盐的培养基的发酵液OD₆₀₀值和抑菌带宽度最高，分别为4.26×10⁹CFU/mL和12.14 mm，显著高于其它无机盐培养基组（P<0.05）。因此，选择CaCO3为最佳无机盐。

由图7可知，当浓度为1.2 g/L时，发酵液OD₆₀₀值和抑菌带宽度最高，分别为4.302×10⁹CFU/mL和13.88 mm，显著高于其他无机盐浓度组（P<0.05）；当浓度高于或低于1.2 g/L时，发酵液中的抑菌带宽度和菌体密度均有所下降。因此，选用1、1.2、1.4 g/L作为无机盐浓度的3个水平。

本发明据上述单因素试验确定的碳源、氮源、无机盐种类及其浓度，将碳源、氮源、无机盐设为3因素，其浓度为3个水平按正交试验L9 (3³）设计（表1）配制不同培养基进行解淀粉芽孢杆菌SS-26菌株发酵试验，软件算出的组合为一个处理组，每个组合做3次重复，测定发酵液的菌体密度OD₆₀₀值和抑菌带宽度，从而筛选出最佳培养基的配方玉米糊精，豆饼粉，碳酸钙。

表 1 响应面分析因素与水平设计

。

3、解淀粉芽孢杆菌发酵培养基的成分含量的确定：

图8正交试验结果表明，1号试验组合的发酵液OD₆₀₀值和抑菌带宽度最高，分别为4.446×10⁹CFU/mL和15.08 mm，1号实验组抑菌圈宽度显著高于其它试验组（P<0.05）。发酵液OD₆₀₀值1号实验组和2号实验组差异不显著，但显著高于其它组（P<0.05）。综合考虑选取1号试验组作为解淀粉芽孢杆菌SS-26菌株发酵培养基的配方，其配方为：糊精15 g，豆饼粉10 g，CaCO₃1.4 g，水1000 mL。

以优化的培养基为发酵培养基，分别测定不同pH值（5、6、7、8和9）、发酵时间（32、36、40、44和48 h）、装液量（30、50、70、90和110mL）、温度（25、28、30、35和37 ℃）、接种量（1、2、3、4和5%）和摇床转速（160、180、200、220和240 r/min）对解淀粉芽孢杆菌SS-26菌株菌体密度OD600值和抑菌圈直径的影响，每个处理组设置3个平行。以初始发酵条件作为基础，每一个因素的优化都在初始发酵条件的基础上进行。

4、最适发酵pH的确定：

图9所示，将培养基接种后，设定初始pH值分别为：5、6、7、8、9，不同初始pH的发酵液的抑菌作用和生长量有较显著的差异，在pH7.0条件下发酵液OD₆₀₀值和抑菌带宽度最高，分别为4.589×10⁹CFU/mL和15.64 mm，显著高于其它试验组（P<0.05），因此选择pH7.0为SS-26菌株摇瓶发酵的最佳pH值。

5、最适发酵温度的确定：

将培养基接种后，设定发酵温度分别为：25、28、30、35、37℃，调节pH为7，装液量50mL，接种量2%，摇床180rpm/min，测定菌种量和抑菌带宽度，实验重复三次。最后确定最佳温度30℃。

图10所示，当发酵温度在30 ℃时发酵液OD₆₀₀值和抑菌带宽度最高，分别为4.608×10⁹CFU/mL和15.7 mm，显著高于其它试验组（P<0.05）。因此，认为30 ℃为SS-26菌株的摇瓶发酵最适温度。

6、最适发酵装液量的确定：

将培养基接种后，设定初始装液量分别为30、50、70、90，调节初始pH为7，摇床180rpm/min，温度28℃培养，测定菌种量和抑菌带宽度，实验重复三次。最后确定发酵装液量为50 mL/250 mL。

图11所示，装液量对SS-26菌株发酵液的抑菌活性有较大影响，当装液量为50 mL/250 mL时发酵液OD₆₀₀值和抑菌带宽度最高，分别为4.446×10⁹CFU/mL和15.08 mm，显著高于其它试验组（P<0.05）。当超过50 mL时，发酵液的抑菌带宽度呈明显下降趋势。因此将50mL/250 mL的装液量作为SS-26菌株摇瓶发酵的最佳装液量。

7、最适发酵接种量的确定：

将培养基接种后，设定初始接种量分别为1%、2%、3%、4%、5%，调节初始pH为7，装液量50mL，摇床180rpm/min，温度28℃培养，测定菌种量和抑菌带宽度，实验重复三次。最后确定发酵接种量为2%。

图12所示，接种量对SS-26菌株发酵液的抑菌带宽度及生长量有较大的影响。当接种量为2%时发酵液OD₆₀₀值和抑菌带宽度最高，分别为4.446×10⁹CFU/mL和15.08 mm，显著高于其它试验组（P<0.05）。因此将2%的接种量为SS-26菌株摇瓶发酵的最佳接种量。

8、最适发酵转速的确定：

将培养基接种后，设定初始转速分别为160、180、200、220，调节初始pH为7，装液量50mL，接种量2%，温度28℃培养，测定菌种量和抑菌带宽度，实验重复三次。最后确定发酵转速为200rpm/min。

图13所示，当转速为200 r/min时其发酵液OD₆₀₀值和抑菌带宽度最高，分别为4.649×10⁹CFU/mL和15.82 mm，显著高于其它试验组（P<0.05）。因此，选择200 r/min作为SS-26菌株摇瓶发酵的最佳摇床转速。

8、最适发酵时间的确定：

将培养基接种后，设定发酵时间分别为32、36、40、44，48，调节初始pH为7，装液量50mL，接种量2%，温度28℃，转速180rpm/min培养，测定菌种量和抑菌带宽度，实验重复三次。最后确定发酵时间为44h。

图14所示，试验结果表明，试验结果表明，在 24~44 h内，发酵液的抑菌带宽度与OD₆₀₀值不断提高，在44 h达到最大，此时其发酵液OD₆₀₀值和抑菌带宽度均最高，分别为4.559×10⁹CFU/mL和15.00 mm，其发酵液OD₆₀₀值显著高于其它试验组（P<0.05）。抑菌带宽度在40h、44h和48h差异不显著，但显著高于其它组（P<0.05），综合考虑选取44 h作为SS-26菌株摇瓶发酵的最佳发酵时间。

当利用此最佳发酵条件：pH7，温度30℃，装液量50mL，接种量2%，温度30℃，转速200rpm/min，发酵周期为44个小时，菌种量达4.649×10⁹CFU/mL，抑菌带宽度达15.82mm。

本解淀粉芽孢杆菌的发酵培养基及其应用，能够为解淀粉芽孢杆菌的大量增殖和抑菌活性提供均衡的营养物质。

本发酵培养基的原料主要来自廉价的农副产品，且在进行解淀粉芽孢杆菌的发酵过程中，不仅提高了菌种数量，还提高了抑菌活性，本发酵培养基对于解淀粉芽孢杆菌的临床生产更具有实际意义。

一种解淀粉芽孢杆菌的发酵培养基的应用，用于测定海洋解淀粉芽孢杆菌SS-26对哈氏弧菌（Vibrio harveyi）菌株的拮抗作用，包括病原菌菌液的制备和抑菌活性的测定。

上述步骤具体如下：

、病原菌菌液的制备

取一环活化24 h的KX1菌株接入装有5 mL无菌水的试管中, 稀释 10²倍后制成浓度为1.0×10⁶个/mL的病原菌菌液。

、抑菌活性的测定

采用牛津杯法测定抑菌圈直径，首先在2216E固体培养基平板上涂布各组发酵液，接着用镊子将无菌牛津杯竖于平板中，并加入200μL病原菌菌液，将平板正置于适宜28 ℃恒温培养箱中培养,用游标卡尺计量抑菌圈直径，从而筛选出抑菌活性最高的发酵培养基。

本试验以对解淀粉芽孢杆菌(B. amyloliquefaciens) SS-26菌株的抑菌带宽度和菌体密度OD₆₀₀值为检测指标进行单因素试验和正交试验设计，优化了解淀粉芽孢杆菌(B. amyloliquefaciens) SS-26菌株的摇瓶发酵培养基配方及其发酵条件。优化后的解淀粉芽孢杆菌(B. amyloliquefaciens) SS-26菌株培养基组成和浓度为：糊精15 g/L，豆饼粉10 g/L，CaCO₃1.4 L/g，水1000 mL。经过优化后的发酵条件为：装液量为50 mL/250 mL，接种量为2%，pH为7.0，发酵时间44 h，温度为30℃，转速为200r/min。据优化后的条件进行培养的菌株，其抑菌带宽度和菌体密度OD₆₀₀值较优化前（发酵初始条件）都有了明显提高，抑菌圈直径达到了15.82mm（P<0.05），OD₆₀₀值达到了4.649×10⁹CFU/mL（P<0.05）。

解淀粉芽孢杆菌在代谢过程中能够产生大量抗菌物质，可以特异性抑制动物体内有害菌的生长，改善动物肠道环境，调节肠道健康，研究发现，解淀粉芽孢杆菌(B. amyloliquefaciens) KHQH-1对根霉、米曲霉、黄曲霉、青霉、绿色木霉、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌有一定的抑制作用。本实验中解淀粉芽孢杆菌(B. amyloliquefaciens) SS-26菌株发酵液对哈氏弧菌（V. Hastelli）KX1具有较好的抑制作用。本实验研究结果表明，玉米糊精作为碳源对源于海洋的解淀粉芽孢杆菌SS-26菌株的抑菌活性和菌体生长有利，与王继雯等对芽孢杆菌C2的研究结果一致，且玉米糊精易得，成本低，适合工业上大批量发酵；SS-26菌株在以豆饼粉为氮源的培养基上抑菌活性和菌体密度较高，与刘宽博等对枯草芽孢杆菌C3的研究结果一致；本研究亦发现添加钙离子可促进解淀粉芽孢杆菌SS-26菌株的抑菌活性和菌体生长，与李文哲等研究发现添加钙离子可提高枯草芽孢杆菌D1的芽孢产率一致。

从图9中可以看出，pH对SS-26菌株的抑菌带宽度与OD₆₀₀值有显著影响，在pH为5~7时SS-26菌株的抑菌带宽度与OD₆₀₀值均随pH增大而提高，pH为7时抑菌带宽度与OD₆₀₀值均最高，当pH大于7时，抑菌带宽度与OD₆₀₀值均明显下降，说明中性条件适合SS-26菌株生长。吴海霞等人研究了解淀粉芽孢杆菌(B. amyloliquefaciens) GM-1-1摇瓶发酵条件的优化，发现在pH为5~7时GM-1-1菌株细菌总数和芽孢产率均随pH增大而增加，pH为7时细菌总数和芽孢产率均最高，与本试验结果一致。从图14中可以看出，发酵时间对SS-26菌株的抑菌带宽度与OD₆₀₀值有显著影响，在44 h时达到最大，此时SS-26菌株发酵液OD₆₀₀值和抑菌带宽度均最高，显著高于其他试验组（P<0.05），较优化前的解淀粉芽孢杆菌SS-26菌株发酵条件相比，时间增加了4个小时。从图10中可以看出，发酵温度对SS-26菌株的抑菌带宽度与OD₆₀₀值有显著影响，在温度为25 ℃~30 ℃时，SS-26菌株的抑菌带宽度与OD₆₀₀值均随温度的升高而提高，在30 ℃时达到最大，发酵温度超过30 ℃后S-26菌株的抑菌带宽度与OD₆₀₀值均下降，表明温度过高不适于该菌株生长繁殖或代谢产物的积累。秦楠等人研究了解淀粉芽孢杆菌(B. amyloliquefaciens) HRH317菌株抗菌肽发酵条件及其抑菌活性的优化，发现不同培养温度对抗菌肽的活性的影响较为显著（P<0.05），温度到达 37 ℃时，抑菌圈直径达到最大值(17.8±0.6) mm，温度继续升高抑菌活性呈明显下降趋势，表明 37 ℃为HRH317菌株最适温度，与本试验结果30 ℃为SS-26菌株最适温度不一致，反映出不同的解淀粉芽孢杆菌菌株的最适生长温度有差异的特点。从图13中可以看出，随着转速的增加，SS-26菌株的抑菌带宽度与OD₆₀₀值呈上升趋势，并在 200 r/min时取得最大值，表明200 r/min为SS-26菌株发酵最适转速。从图12可以看出，接种量对SS-26菌株发酵液的抑菌带宽度及生长量有较大的影响，过大的接种量会大大消耗发酵液中的营养成分，并代谢产生过多的次级代谢产物而影响菌体的生长，本实验中接种量为2%时，SS-26菌株发酵液OD₆₀₀值和抑菌带宽度达到最高，表明2%为SS-26菌株发酵最适接种量。

本研究按照优化的培养基和发酵条件解淀粉芽孢杆菌发酵(B. amyloliquefaciens) SS-26菌株后，其抑菌活性和菌体密度OD₆₀₀值较优化前都有了明显提高，抑菌圈直径达到了15.82mm（P<0.05），OD₆₀₀值达到了4.649×10⁹CFU/mL（P<0.05），表明该菌株在优化后的发酵条件下具有良好的应用前景。优化后的培养基成本降低，来源广泛，为克氏原螯虾幼虾发酵饲料的开发奠定了坚实的基础，可进行下一步克氏原螯虾幼虾饲料的发酵实验。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims

1.一种解淀粉芽孢杆菌的发酵培养基，其特征在于：发酵培养基的组分由玉米糊精5-25g/L，豆饼粉7.5-17.5g/L，碳酸钙0.6-1.4g/L。

2. 根据权利要求1所述的一种解淀粉芽孢杆菌的发酵培养基，其特征在于：发酵培养基的组分由玉米糊精15g/L，豆饼粉10g/L，碳酸钙1.4 g/L混合而成。

3.根据权利要求1或2所述的一种解淀粉芽孢杆菌的发酵培养基，其特征在于：菌在发酵培养基中发酵条件：最适发酵温度为30℃，最适发酵pH值为7，最适发酵装液量是50mL/250 mL，最适接种量为2%，最适发酵转速为200rpm/min，最适发酵时间为44h。

4.根据权利要求3所述的一种解淀粉芽孢杆菌的发酵培养基，其特征在于：通过发酵培养基使得发酵液中的菌种量达4.649×10⁹CFU/mL，抑菌带宽度达15.82mm。

5.一种解淀粉芽孢杆菌的发酵培养基的应用，其特征在于：用于制备解淀粉芽孢杆菌。

6. 一种解淀粉芽孢杆菌的发酵培养基的应用，其特征在于：用于测定海洋解淀粉芽孢杆菌SS-26对哈氏弧菌（V. Hastelli）KX1菌株的拮抗作用，包括病原菌菌液的制备和抑菌活性的测定。