CN113005054A - 一种解淀粉芽孢杆菌ss-zc-26及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种解淀粉芽孢杆菌SS‑ZC‑26，该菌为革兰氏阳性菌，其两端可产生芽孢，周生鞭毛，有荚膜，含有赖氨酸脱羧酶和鸟氨酸脱羧酶，不含半乳糖苷酶，能够利用尿素、七叶苷，能够双水解精氨酸，对硝酸盐有一定的还原能力，其在高盐肉汤中不生长，不分解硫化氢，不利用胆汁七叶苷和乳糖，在半固体琼脂中无动力，该菌Genebank收录号为MN262479，所述解淀粉芽孢杆菌SS‑ZC‑26已于2019年1月2日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2019005，建议的分类命名为Bacillus amyloliquefaciens SS‑ZC‑26，保藏地址为中国武汉大学；本发明公开的解淀粉芽孢杆菌SS‑ZC‑26，对哈氏弧菌和需钠弧菌有生防作用，利于规模化生产的同时，大大提高经济效益，值得推广。

Description

一种解淀粉芽孢杆菌SS-ZC-26及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种微生物，尤其涉及来自海洋微生物的一种解淀粉芽孢杆菌SS-ZC-26及其制备方法和应用。

背景技术

海洋中，特殊的生活环境不光为海洋微生物提供了独特的遗传资源，而且同时还提供了产生陆地微生物无法获得的特定化学结构和活性化合物的能力，海洋微生物不仅可以为人们提供各种具有新型分子结构，复杂化学结构和生理活性的海洋天然产物宝库，同时在保护海洋生态环境，地球物质循环和能量转换方面发挥着非常重要的作用。海洋微生物通常能够产生具有与陆地来源不同的独特分子结构的新化合物，在不破坏海洋物种和海洋生态的平衡的前提下，用于研究和开发新海洋生物活性物质的重要生物资源，基于海洋微生物生长周期短，易调节代谢，易于选择菌株，因此可通过大规模发酵产业化。海洋芽孢杆菌属于芽孢菌属，是革兰氏阳性菌，更是一类好氧细菌，此类细菌能够分泌产生蛋白酶等许多种酶以及抗生素，进而利用所产生的多种酶和抗生素去抑制其他的细菌的生长，从而达到降低病原物对水产养殖动植物的危害程度的目的。

近年来，海洋芽孢杆菌的研究探索越来越注重，由于它自身所具有的广泛地抑制真菌与细菌的能力，因而变成了如今非常具有微生物药物开发潜力的海洋微生物。这类细菌在生长过程中会产生抑制真菌和细菌活性的代谢产物，这些代谢产物恰好能起到生物防治的作用；本发明公开的解淀粉芽孢杆菌SS-ZC-26，对哈氏弧菌和需钠弧菌有生防作用，对海洋生物抑制弧菌病害有着重要意义，尤其是对水生生物病原菌哈氏弧菌KX1的抑菌活性和菌体密度，可用于确定最佳培养基和最佳发酵条件，利于工厂化生产同时，扩大经济效益，值得推广。

发明内容

本发明公开了一种解淀粉芽孢杆菌SS-ZC-26，该菌已于2019年1月2日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2019005，建议的分类命名为Bacillusamyloliquefaciens SS-ZC-26，保藏地址为中国武汉大学。

一种解淀粉芽孢杆菌SS-ZC-26，该菌为革兰氏阳性菌，其两端可产生芽孢，周生鞭毛，有荚膜，含有赖氨酸脱羧酶和鸟氨酸脱羧酶但不含半乳糖苷酶，能够利用尿素、七叶苷，能够双水解精氨酸，对硝酸盐有一定的还原能力，其在高盐肉汤中不生长，不分解硫化氢，不利用胆汁七叶苷和乳糖，在半固体琼脂中无动力，所述解淀粉芽孢杆菌SS-ZC-26已于2019年1月2日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2019005，建议的分类命名为Bacillus amyloliquefaciens SS-ZC-26，保藏地址为中国武汉大学。

一种解淀粉芽孢杆菌SS-ZC-26的制备方法，包括如下步骤：

(1)从感染紫菜黄斑病的海藻丝状体分离解淀粉芽孢杆菌SS-ZC-26；

(2)将步骤(1)中的菌株接种至PDA固体平板培养基中，于28℃、生化培养箱中培养至少24h，至出现单菌落；

(3)挑取步骤(2)中单菌落接种至PD液体培养基中，于30℃、摇床培养至少24h；

(4)待步骤(3)中PD液体培养基中出现浑浊，即获取解淀粉芽孢杆菌SS-ZC-26；

(5)挑取步骤(3)中培养获取的菌株，接种于PDA固体斜面培养基中并划“之”字线，于28℃生化培养箱中培养至少24h后，暂存于冰箱中备用。

进一步的，所述步骤(2)和步骤(5)中PAD固体培养基组分以及质量为马铃薯200g、葡萄糖10-20g、琼脂17-20g。

进一步的，所述步骤(3)和步骤(4)中PD液体培养基组分及其质量为马铃薯200g、葡萄糖10-20g。

一种解淀粉芽孢杆菌SS-ZC-26对水生生物病原菌抑制的应用。

进一步的，所述解淀粉芽孢杆菌SS-ZC-26对哈氏KX1和需钠弧菌XA1的抑制的应用。

与现有技术相比，本发明具有的有益效果如下：

本发明公开的解淀粉芽孢杆菌SS-ZC-26，对哈氏弧菌和需钠弧菌XA1有生防作用，对海洋生物抑制弧菌病害有着重要意义，尤其是对水生生物病原菌哈氏弧菌KX1和需钠弧菌XA1，在确定最佳培养基和最佳发酵条件后，可利于规模化生产，同时大大提高其经济效益，值得推广。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例技术描述中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。

图1为芽孢染色实验结果。

图2为鞭毛染色实验结果。

图3为菌体荚膜染色实验。

图4从左至右为氧化酶试纸与氧化酶试剂反应结果。

图5为解淀粉芽孢杆菌SS-ZC-26所提取DNA的电泳条带。

图6为解淀粉芽孢杆菌SS-ZC-26在不同初始发酵培养基下的抑菌状况。

图7为解淀粉芽孢杆菌SS-ZC-26在不同温度下的抑菌状况。

图8为解淀粉芽孢杆菌SS-ZC-26在不同pH下的抑菌状况。

图9为解淀粉芽孢杆菌SS-ZC-26在不同接种量下的抑菌状态。

图10为解淀粉芽孢杆菌SS-ZC-26在不同生长周期下的抑菌状况。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。

为了达到本发明的目的，如图1-10所示，一种解淀粉芽孢杆菌SS-ZC-26，该菌为革兰氏阳性菌，其两端可产生芽孢，周生鞭毛，有荚膜，含有赖氨酸脱羧酶和鸟氨酸脱羧酶，不含半乳糖苷酶，能够利用尿素、七叶苷，能够双水解精氨酸，对硝酸盐有一定的还原能力，其在高盐肉汤中不生长，不分解硫化氢，不利用胆汁七叶苷和乳糖，在半固体琼脂中无动力，所述解淀粉芽孢杆菌SS-ZC-26已于2019年1月2日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2019005，建议的分类命名为Bacillus amyloliquefaciens SS-ZC-26，保藏地址为中国武汉大学。

实施例：

培养基的配制：

(1)2216E液体培养基，其组分以及含量为蛋白胨5g，酵母膏1g，陈海水1000ml；

(2)PDA固体培养基，其组分以及含量为马铃薯200g，葡萄糖10-20g，琼脂17-20g；

(3)PD液体培养基，其组分以及含量为马铃薯200g，葡萄糖10-20g；

(4)牛肉膏蛋白胨固体培养基，其组以及含量为牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂20g，陈海水1000ml；

(5)2216E固体培养基，其组分以及含量为蛋白胨5g，酵母膏1g、琼脂20g、陈海水1000ml，。

一、菌株的获取：

连云港高公岛紫菜养殖基地提供的紫菜患病贝壳丝状体样品，用高温高压灭菌海水冲洗掉表面杂质，用75％酒精棉球擦拭消毒，在无菌操作台中用接种铲刮取贝壳表面有条斑紫菜丝状体附生的部分，取0.1g刮取物置100mL2216E液态培养基的灭菌三角瓶中，在28℃下200r/min富集1h，之后用灭菌海水将富集的菌液梯度稀释10、100、1000倍，接着在超净台用涂布棒将稀释的菌液分别涂布到2216E固体培养基上，每个平板分别涂布100μL，最后将平板放到28℃恒温箱倒置培养18-48h，等菌落长出来后，三区划线，纯化菌种，即获取解淀粉芽孢杆菌SS-ZC-26。

二、菌株的活化和保存：

(1)将解淀粉芽孢杆菌SS-ZC-26从冷冻冰箱取出，待其恢复到室温解冻后，于超净工作台中将其接种至PDA固体培养基的平板上，并进行三区划线，随后在28℃生化培养箱培养时间至少24h直至有单菌落出现，单菌落出现后，依照上述的方法和操作再做两次三区划线的重复，并放至生化培养箱培养至少24h：

(2)于超净工作台内从三次划线的平板上挑选七个单菌落分别接种于七支灭菌后且装有PD液体培养基的试管中，接种完成后，将七支试管做好标记后放入30℃的摇床进行培养，培养至少24h直至试管中的菌株长至浑浊，完成菌株的活化，以备后续使用。部分菌液加入30％灭菌甘油放到-20℃保存。

三、菌株的染色：

取活化后的单菌落，用于以下染色操作：

(1)芽孢染色：准备芽孢染色试剂盒，取2片干净的载玻片，分别在载玻片中央各滴加一滴无菌水，用接种环分别从上述培养好的平板上挑取单菌落涂在中央的无菌水中，并使得菌体与无菌水混匀且量不宜过多否则影响观察；自然晾干载玻片，待干燥后，用镊子夹住载玻片的一端然后将载玻片在火焰上来回过三次从而达到固定的作用；接着滴加3-4滴试剂盒中的A液(孔雀石绿水溶液)于已固定的涂片上，用镊子夹住载玻片在火焰上加热6-8S；待载玻片冷却后，倾去染液，水洗至不再褪色为止；用B液(番红溶液)复染1min，水洗至水无色，待干燥后，至油镜观察。如图1所示，涂片中芽孢呈绿色，菌体呈红色，菌体清晰可见为杆状菌，且它可以产生芽孢，芽孢位于两端。

(2)菌体鞭毛染色：准备鞭毛染色试剂盒，取2片干净的载玻片，分别在载玻片中央各滴加一滴无菌水，用接种环分别从上述培养好的平板上挑取单菌落涂在中央的无菌水中，并使得菌体与无菌水混匀且菌体量应适宜观察；自然晾干载玻片，已达到固定的目的；取出试剂盒中的一小瓶鞭毛染色液，滴加2-3滴至已固定的涂片上，在室温中染色10min，最后用轻缓的水流从载玻片一端流至另一端，直至流下的水无色为止，然后于室温干燥后镜检并用油镜观察。如图2所示，菌体和鞭毛均呈紫色。

(3)菌体荚膜染色：准备荚膜染色试剂盒，取2片干净的载玻片，分别在载玻片中央各滴加一滴无菌水，用接种环分别从上述培养好的平板上挑取单菌落涂在中央的无菌水中，可以尽量多挑取一些菌与水充分混合，并将粘稠的菌液尽量涂开，但涂布的面积不宜过大；将涂布好的涂片放置于空气中自然干燥；用试剂盒中的溶液A(结晶紫溶液)，染5-7min；再用试剂盒中的溶液B(20％硫酸铜水溶液)洗去结晶紫，脱色要适度(冲洗两遍)，用吸水纸吸干，并立即滴加1-2滴香柏油于涂片处，以防硫酸铜结晶的形成，油镜镜检。如图3所示，染色后涂片中的背景呈无色，菌体呈紫色，荚膜呈浅紫色。

四、菌株生理化鉴定：

(1)菌株对七叶苷的利用能力：取胆汁七叶苷生化管于距离内容物上方2cm处用砂条割开，迅速于酒精灯火焰上消毒，取摇床培养的含液体培养基试管，即PD液体培养基的试管中的菌液100μL对胆汁七叶苷生化管进行接种，接种完成后，管口塞上灭过菌的棉花并置于35℃培养箱内孵育24h，生化反应管pH值为7.3±0.4。

(2)菌株于半固体琼脂中动力性：取半固体琼脂生化管于距离内容物上方2cm处用砂条割开，迅速于酒精灯火焰上消毒，然后取摇床培养的含液体培养基试管中的菌液100μL对半固体琼脂生化管进行接种，接种完成后，管口塞上灭过菌的棉花并置于35℃培养箱内孵育24h，生化反应管pH值为7.3±0.4。

(3)菌株对尿素的分解能力：取尿素生化管于距离内容物上方2cm处用砂条割开，迅速于酒精灯火焰上消毒，然后取于摇床中培养的含液体培养基试管中的菌液100μL对生化管进行接种，接种完成后，管口塞上灭过菌的棉花并置于35℃培养箱内孵育24h，生化反应管pH值为6.8±0.4。

(4)菌株对七叶苷的分解能力：取七叶苷生化管于距离内容物上方2cm处用砂条割开，迅速于酒精灯火焰上消毒，然后取摇床培养的含液体培养基试管中的菌液100μL对生化管进行接种，接种完成后，管口塞上灭过菌的棉花并置于35℃培养箱内孵育24h，生化反应管pH值7.3±0.4。

(5)菌株在高氯化钠的情况下的生长能力：取6.5％高盐肉汤生化管于距离内容物上方2cm处用砂条割开，迅速于酒精灯火焰上消毒，然后取摇床培养的含液体培养基试管中的菌液100μL对生化管进行接种，接种完成后，管口塞上灭过菌的棉花并置于35℃培养箱内孵育24h，生化反应管pH值为7.3±0.4。

(6)菌株硫化氢能力：取硫化氢生化管于距离内容物上方2cm处用砂条割开，迅速于酒精灯火焰上消毒，然后取摇床培养的含液体培养基试管中的菌液100μL对生化管进行接种，接种完成后，管口塞上灭过菌的棉花并置于35℃培养箱内孵育24h，生化反应管pH值为7.3±0.4。

(7)菌株对乳糖的发酵能力：取乳糖生化管于距离内容物上方2cm处用砂条割开，迅速于酒精灯火焰上消毒，然后取于摇床中培养的含液体培养基试管中的菌液100μL对生化管进行接种，接种完成后，管口塞上灭过菌的棉花并置于35℃培养箱内孵育24h，生化反应管PH值为7.3±0.4。

(8)菌株半乳糖苷酶检查：取ONPG生化管于距离内容物上方2cm处用砂条割开，迅速于酒精灯火焰上消毒，然后取于摇床中培养的含液体培养基试管中的菌液100μL对生化管进行接种，接种完成后，管口塞上灭过菌的棉花并置于35℃培养箱内孵育24h，生化反应管pH值为7.3±0.4。

(9)菌株代谢类型：取O-F生化管于距离内容物上方2cm处用砂条割开，迅速于酒精灯火焰上消毒，同时穿刺接种两支试管，其中一支接种后滴加液体石蜡，两支均接种完成后，管口塞上灭过菌的棉花并置于35℃培养箱内孵育24h，生化反应管pH值为7.3±0.4。

(10)细菌的精氨酸双水解能力：取精氨酸双水解生化管于距离内容物上方2cm处用砂条割开，迅速于酒精灯火焰上消毒，然后取于摇床中培养的含液体培养基试管中的菌液100μL对生化管进行接种，接种完成后，用液体石蜡封口，管口塞上灭过菌的棉花并置于35℃培养箱内孵育24h，生化反应管pH值为6.0±0.4。

(11)菌株对赖氨酸的脱羧能力：取赖氨酸脱羧酶生化管于距离内容物上方2cm处用砂条割开处用砂条割开，迅速于酒精灯火焰上消毒，然后取摇床培养的含液体培养基试管中的菌液100μL对生化管进行接种，接种完成后，用液体石蜡封口，管口塞上灭过菌的棉花并置于35℃培养箱内孵育24h，生化反应管pH值为6.0±0.4。

(12)菌株对对鸟氨酸的脱羧能力：取鸟氨酸脱羧酶生化管于距离内容物上方2cm处用砂条割开，迅速于酒精灯火焰上消毒，然后取摇床培养的含液体培养基试管中的菌液100μL对生化管进行接种，接种完成后，用液体石蜡封口，管口塞上灭过菌的棉花并置于35℃培养箱内孵育24h，生化反应管pH值为6.0±0.4。

(13)菌株对硝酸盐的还原能力：取硝酸盐(还原)生化管于距离内容物上方2cm处用砂条割开，迅速于酒精灯火焰上消毒，然后取于摇床中培养的含液体培养基试管中的菌液100μL对生化管进行接种，接种完成，管口塞上灭过菌的棉花并置于35℃培养箱内孵育24h后，加入硝酸盐还原试剂甲乙液各一滴，生化反应管pH值为7.3±0.4。

上述实验结果参见下表1：

表1生化管反应的观察结果

注：“+”为阳性，“-”为阴性，结果表明：解淀粉芽孢杆菌SS-ZC-26不利用胆汁七叶苷，在半固体琼脂中无动力，可以使尿素分解，可以使七叶苷分解，在高盐肉汤中不生长，不分解硫化氢，不能利用乳糖，不含有半乳糖苷酶，其代谢类型是发酵型，可使精氨酸双水解，对赖氨酸、鸟氨酸脱羧作用，即含有赖氨酸脱羧酶和鸟氨酸脱羧酶，对硝酸盐有还原能力。

(14)菌株氧化酶测定：

(I)取试剂盒中内装有10mg的试剂一支，加入1ml纯化水溶解成溶液，在超净工作台中，将已经在摇床中培养至浑浊的菌液取出一支，倾倒至灭过菌的培养皿中，再取盒内白色滤纸条一片，一端沾取菌液少许，加上述试剂溶液一滴，十秒后观察结果。

(II)在超净工作台中，将已经在摇床中培养至浑浊的菌液取出一支，倾倒至灭过菌的培养皿中，取一片氧化酶试纸，一端沾取菌液少许，十秒后观察结果。

如图4所示，解淀粉芽孢杆菌SS-ZC-26既不能使氧化酶试剂变红，也不能使氧化酶试纸变红，即此菌不含氧化酶。

五、菌株DNA提取及检测：

(1)按照DNA提取试剂盒说明提取解淀粉芽孢杆菌SS-ZC-26的DNA，最终提取出的DNA放入4℃冰箱保存即可。

(2)配制0.5*TEB缓冲液，取30ml的0.5*TBE缓冲液加入到锥形瓶中，再向锥形瓶中加入0.24g的琼脂糖，接着放入微波炉内加热至全部溶解并三次沸腾后取出，室温放置数分钟，再加入3μl的gold View染液混匀；准备干净电泳槽和制胶梳，将配置好的胶倒入放好隔板的胶槽，插好梳子，等待凝胶冷却并凝固；第一个孔加入3-5μl Hind III Marker，然后5μl样品与1μl 6×Loading Buffer混匀后依次在其它孔内点样；在120V的稳定电压下跑电泳1h，结果如图5所示：泳道1是0.5μLMarker跑出的条带，泳道2是解淀粉芽孢杆菌SS-ZC-26。

(3)将上述(1)中所提取的DNA稀释至10倍作为模板，以UP1为正向引物，而UP2为反向引物，按照下表2的扩增体系进行菌株gyrB序列的PCR扩增，其中：

UP1：5’-CCGGATGTAATGG-3’；UP2：5’-CATTCCCACCTTACTG-3’；

表2菌株gyrB序列扩增体系

(4)将gyrB序列PCR扩增的产物送至南京金斯瑞生物科技有限公司进行测序，随后利用所得序列在NCBI的BLAST查询并确定，该菌株为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)。

六、菌株抑菌作用测定：

(1)指示菌：需钠弧菌XA1、哈氏弧菌KX1；

(2)拮抗菌：解淀粉芽孢杆菌SS-ZC-26；

(3)使用牛津杯测定解淀粉芽孢杆菌SS-ZC-26抑菌作用：需钠弧菌XA1、哈氏弧菌KX1、分别接种到2216E液体培养基中培养至浑浊；用2216E液体培养基稀释100倍混匀，将解淀粉芽孢杆菌SS-ZC-26别接种于2216E液体培养基，放入28℃恒温震荡培养箱中以150r/min培养至浑浊；在超净工作台中，用移液枪吸取100μl稀释100倍的指示菌菌液，加入2216E固体培养基涂布均匀，用镊子夹取牛津杯垂直于培养基表面放置，用镊子轻轻按压牛津杯，防止菌液流出，切勿用力过大压破培养基，每个培养皿放置三个牛津杯做平行样；用200μl移液枪分别吸取185μl藻际细菌菌液到牛津杯中，勿让菌液从杯中溢出，影响抑菌圈测量。将完成牛津杯法的培养皿30℃恒温培养24h后观察。解淀粉芽孢杆菌SS-ZC-26对需钠弧菌XA1、哈氏弧菌KX1病原菌抑菌作用明显，具体抑菌结果如表3所示：

表3解淀粉芽孢杆菌SS-ZC-26对需钠弧菌XA1、哈氏弧菌KX1病原菌抑菌作用

七、菌株发酵：

(1)制备以下培养基，其组分及其含量如下：

2216E固体培养基：5g蛋白胨、1g酵母膏、15g琼脂、陈海水1000ml，pH7.5；

LB固体培养基：10g蛋白胨、10g氯化钠、5g酵母膏、15g琼脂、陈海水1000ml，pH7.0；

BPY固体培养基：5g牛肉膏、10g蛋白胨、5g酵母膏、5g葡萄糖、、15g琼脂、陈海水1000ml，pH7.0；

NYD固体培养基：5g酵母膏、10g葡萄糖、8g牛肉膏、15g琼脂、陈海水1000ml，pH7.5；

2216E液体培养基：蛋白胨5g、酵母膏1g、陈海水1000ml，pH7.5；

LB液体培养基：10g蛋白胨、10g氯化钠、5g酵母膏、陈海水1000ml，pH7.0；

BPY液体培养基：5g牛肉膏、10g蛋白胨、5g酵母膏、5g葡萄糖、陈海水1000ml，pH7.0；

NYD液体培养基：5g酵母膏、10g葡萄糖、8g牛肉膏、陈海水1000ml，pH7.5。

(2)以哈氏弧菌KX1作为指示菌，以解淀粉芽孢杆菌SS-ZC-26作为拮抗菌，进行如下发酵条件的优化：

(I)活化菌株：将保存于冰箱中的解淀粉芽孢杆菌SS-ZC-26进行活化，然后接种于2216E固体培养基平板上，划线并置于30℃冰箱中保存过夜，于第二天将单菌落转移至50mLNYD液体培养基中，于30℃、200r/min震荡培养24h，作为种子液存放冰箱。

(II)制备病原菌悬液：随后，将水生植物和属病原体在2216E的固体培养基中培养，移液枪从100μl至2216E固体培养基的表面吸移病原菌液体；用灭菌的涂层棒充分涂抹，然后在30℃下孵育，在菌落生长良好后，挑取单个菌落并在2216E平板上划线，通过加入10mL无菌水使孢子重复洗脱，使其脱落，并将孢子悬浮液用无菌水稀释至105cfu mL^-1。

(III)筛选初始发酵培养基：将(I)中种子溶液按照接种量为2％接种到2216E、LB、NYD和BPY液体培养基中，在30℃下以200r/min摇动200h后测定不同液体培养基的细胞密度，并利用牛津杯发测定抗菌活性，其结果如图6所示：培养基1-4分别对应NYD培养基、2216E培养基、LB培养基、BPY培养基，其中，解淀粉芽孢杆菌SS-ZC-26在NYD培养基中发酵时，发酵液具有最高的细菌密度，OD600值为1.756，哈氏弧菌KX1病原体的抑制区直径最大，为18mm；在BPY培养基中发酵期间发酵液的细菌细胞密度OD600为1.547，哈氏弧菌KX1病原体的抑制区直径仅为12mm；2216E培养基中对哈氏KX1病原菌的抑菌圈直径为16mm，但其发酵时的发酵液菌体密度仅为1.667；因此，选择NYD培养基1号作为菌株SS-26发酵的基础培养基。

(IV)培养基的优化：对解淀粉芽孢杆菌SS-ZC-26正交试验，具体为3种水平下葡萄糖、牛肉提取物和酵母提取物三因子对解淀粉芽孢杆菌SS-ZC-26菌株发酵能力的影响，使用三因子三水平正交表，将(I)中种子溶液按照2％接种量接种于相应培养基中，其中装液量按照250mL三角瓶中装50mL培养液，于30℃、200r/min振荡培养48h，确定细菌悬浮液OD600值的吸光度和无菌发酵液的抗菌活性，正交试验因素水平参见下表4：

表4菌株解淀粉芽孢杆菌SS-ZC-26培养基优化正交试验因素水平

通过上述正交试验，其分析结果下表5-6：

表5菌株解淀粉芽孢杆菌SS-ZC-26培养基优化正交试验结果

表6菌株解淀粉芽孢杆菌SS-ZC-26培养基优化的极差分析表

通过表5-6可知，正交试验方法用于优化细菌生长所需的碳和氮以及无机盐，三种营养素对细菌数量的影响顺序为A＞B＞C，并且营养素对抑菌物质活性的影响顺序为B＞A＞C，因此最佳培养基的优化组合是A2，B1，C2。

(V)发酵条件的优化：

(一)发酵温度：

按照2％接种量将(I)中种子溶液接种到(IV)中的优化的培养基中，按照250mL烧瓶中装有50mL液体培养基的装液量，设置四组，分别置于20℃、25℃、30℃和35℃培养2天，测定悬浮液的吸光度OD600值和抗菌活性。结果如图7所示，温度1-4分别对应20℃、25℃、30℃和35℃，该菌株可在4个温度下生长，30℃为解淀粉芽孢杆菌SS-ZC-26的最佳培养温度。

(二)发酵初始pH值：

按照2％接种量将(I)中种子溶液接种到(IV)中优化的培养基中，按照250mL烧瓶中装有50mL液体培养基的装液量，共设置五组，分别置于pH为6.0、6.5、7.0、7.5和8.0下测量初始pH，接着以30℃，200r/min培养48h，测定细菌悬浮液的吸光度OD600值和抗菌活性。结果如图8所示，pH1-5分别对应pH6.0、pH6.5、pH7.0、pH7.5和pH8.0，解淀粉芽孢杆菌SS-ZC-26生长和发酵液的抗菌活性随着初始pH值的增加先上升后下降，当pH为7.5时，解淀粉芽孢杆菌SS-ZC-26的生长和抗菌活性达到最大值，pH为6.0-7.0，菌株的生长和抗菌物质的活性低，因此，选择发酵培养基的初始pH为7.5。

(三)接种量：

将(I)中种子溶液分别按照接种量为1％、2％、3％、4％和5％接种于(IV)中优化的培养基中，按照250mL烧瓶中装有50mL液体培养基的装液量，共设置五组，以30℃下震荡48h，测定细菌悬浮液的吸光度OD600值和抗菌活性。结果如图9所示，接种量1-5分别对应1％、2％、3％、4％和5％，该菌的细菌密度和发酵液的抗菌活性较高，没有显着差异，当接种量大于2％时，随着接种量增加，发酵液的细菌细胞密度和抑菌活性降低，其由于过量的接种物导致培养基中营养物的过量消耗，因此选择2％作为最适接种量。

(四)培养周期：

按照2％接种量将(I)中种子溶液接种到(IV)中优化的培养基中，按照250mL烧瓶中装有50mL液体培养基的装液量，于30℃、200r/min培养12h，每隔一段时间取样活细胞数和细菌的抗菌活性。结果如图10所示，在36-48h过程中，活菌数稳定增长，当48h以后，活菌数量下降，48h以后发酵液的抑菌活性很强，且彼此间不存在显著性差异，综合考虑活菌数和抗菌物质的产量，因此确定最佳发酵周期为48h。

因此，解淀粉芽孢杆菌SS-ZC-26最佳培养基组成如下：葡萄糖1％，牛肉膏0.8％，酵母膏0.3％，其最佳发酵条件为：初始pH值为7.5，发酵周期为36h，培养温度为30℃，接种量为2％，其他发酵条件为装液量为每250mL三角瓶装50mL培养液，培养转数为200r/min。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (6)

1.一种解淀粉芽孢杆菌SS-ZC-26，其特征在于：该菌为革兰氏阳性菌，其两端可产生芽孢，周生鞭毛，有荚膜，含有赖氨酸脱羧酶和鸟氨酸脱羧酶，不含半乳糖苷酶，能够利用尿素、七叶苷，能够双水解精氨酸，对硝酸盐有一定的还原能力，其在高盐肉汤中不生长，不分解硫化氢，不利用胆汁七叶苷和乳糖，在半固体琼脂中无动力，该菌Genebank收录号为MN262479，所述解淀粉芽孢杆菌SS-ZC-26已于2019年1月2日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2019005，建议的分类命名为Bacillus amyloliquefaciens SS-ZC-26，保藏地址为中国武汉大学。

2.如权利要求1所述的一种解淀粉芽孢杆菌SS-ZC-26的制备方法，其特征在于：该菌制备及保藏包括如下步骤：

（1）从感染紫菜黄斑病的海藻丝状体分离解淀粉芽孢杆菌SS-ZC-26；

（2）将步骤（1）中的菌株接种至PDA固体平板培养基中，于28℃、生化培养箱中培养至少24h，至出现单菌落；

（3）挑取步骤（2）中单菌落接种至PD液体培养基中，于30℃、摇床培养至少24h；

（4）待步骤（3）中PD液体培养基中出现浑浊，即获取解淀粉芽孢杆菌SS-ZC-26；

（5）挑取步骤（3）中培养获取的菌株，接种于PDA固体斜面培养基中并划“之”字线，于28℃生化培养箱中培养至少24h后，暂存于冰箱中备用。

3.根据权利要求2所述的一种解淀粉芽孢杆菌SS-ZC-26的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）和步骤（5）中PAD固体培养基组分以及质量为马铃薯200g、葡萄糖10-20g、琼脂17-20g。

4.根据权利要求2所述的一种解淀粉芽孢杆菌SS-ZC-26的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）和步骤（4）中PD液体培养基组分及其质量为马铃薯200g、葡萄糖10-20g。

5.如权利要求1所述的一种解淀粉芽孢杆菌SS-ZC-26的应用，其特征在于：所述解淀粉芽孢杆菌SS-ZC-26对水生生物病原菌抑制的应用。

6.根据权利要求5所述的一种解淀粉芽孢杆菌SS-ZC-26的应用，其特征在于：所述解淀粉芽孢杆菌SS-ZC-26对哈氏KX1和需钠弧菌XA1病原菌的抑制的应用。

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