CN103045499A

CN103045499A - 产酸克雷伯氏菌mow-02-05及其筛选方法和应用

Info

Publication number: CN103045499A
Application number: CN201210427588XA
Authority: CN
Inventors: 虞磊; 俞汉青; 李文卫
Original assignee: Suzhou Institute for Advanced Study USTC
Current assignee: Suzhou Institute for Advanced Study USTC
Priority date: 2012-10-31
Filing date: 2012-10-31
Publication date: 2013-04-17

Abstract

本发明公开了一种产酸克雷伯氏菌MOW-02-05及其筛选方法和应用，该菌分离自间歇式厌氧污泥反应器，能够高效降解染料和生物产氢，利用该菌株对偶氮染料进行脱色和对有机碳源进行生物产氢。经鉴定这株菌为Klebsiella oxytoca MOW-02-05，并将其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物保藏中心，保藏编号为：CGMCC No.5237。本发明得到的菌株可解决传统厌氧反应器处理偶氮染料废水时存在的反应器酸化的问题，适合应用于印染染料废水的生物处理。

Description

产酸克雷伯氏菌MOW-02-05及其筛选方法和应用

技术领域

本发明属于染料废水净化处理技术领域，具体涉及一种产酸克雷伯氏菌MOW-02-05及其筛选方法和应用。

背景技术

偶氮染料是合成染料的最主要的品种，广泛应用在印染、纺织和造纸等行业。偶氮染料具有-N=N-发色基团，需要得到电子才能将偶氮键脱色还原，但是由于空气中氧气的存在，它们稳定的存在自然环境中很难被微生物降解。偶氮染料的排放一方面会引起水体色度的增加，抑制水体中光合作用的过程，进而影响到生物链各级生物的生长，破坏区域的水体生态系统；另一方面染料降解的中间产物（多为芳香胺类化合物）对动植物、人类和生态环境具有严重的危害。目前能够有效处理染料废水，且经济、环保、可持续的方法是微生物处理法。在微生物法处理染料废水工艺中，染料的降解效率是衡量反应器处理能力的一个重要指标，如何有效的将复杂有机碳源的化学能转化为生物能（产氢、产乙醇、产甲烷等）则是微生物处理废水和可再生能源技术的另一个重要指标。因此，筛选能同时高效降解染料和产能的细菌具有重要的现实意义。

实验室规模的间歇式厌氧污泥反应器中微生物对染料的降解专一性强，驯化程度高，有利于筛选出高效降解染料与产氢的细菌。目前报道的很多细菌都具有染料降解或发酵产氢能力，但同时具有上述作用的细菌还未见报道。本发明因此而来。

发明内容

本发明目的在于提供一种产酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)MOW-02-05，解决了现有技术中染料废水难以进行生物降解、难以进行净化处理等问题。

为了解决现有技术中的这些问题，本发明提供的技术方案是：

一种产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)MOW-02-05，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No.5237。

优选的，所述细菌菌落圆点状，淡黄色，表面光滑。

优选的，所述细菌的16S rRNA序列为SEQ No.1。

本发明的另一目的在于提供一种所述的产酸克雷伯氏菌MOW-02-05的培养筛选方法，其特征在于所述方法包括将间歇式厌氧污泥反应器中污泥样品进行稀释后按照常规培养形成菌落，然后挑单菌落分离纯化得到纯化的产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)MOW-02-05的步骤。

优选的，所述方法中还包括将所述纯化的产酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)MOW-02-05菌株按照3～5％的接种量接入液体培养基，液体培养基的pH值控制在6.8～7.2范围内，培养温度为33～38℃，培养时间为24h～48h，得到扩大培养的产酸克雷伯氏菌MOW-02-05菌株。

优选的，所述方法中所述的液体培养基以其组分的配比计包括：蛋白胨10重量份数，酵母膏5重量份数，氯化钠10重量份数，水1000重量份数，且液体培养基的pH值控制在6.8～7.2。

本发明的又一目的在于提供一种所述的产酸克雷伯氏菌MOW-02-05在染料废水净化处理以及生物产氢中的应用。

优选的，所述应用中以所述的产酸克雷伯氏菌MOW-02-05菌株为菌种，碳源为电子供体，偶氮染料为电子受体，同时进行脱色和产氢作用。

优选的，所述应用中所述的产酸克雷伯氏菌MOW-02-05菌株进行培养的培养基组分为：蔗糖6.84重量份数,染料0.327重量份数，K₂HPO₄ 1.0重量份数，KH₂PO₄ 0.5重量份数，(NH₄)₂SO₄ 2.0重量份数，MgSO₄·7H₂O 0.1重量份数,微量元素溶液1重量份数。

本发明的又一目的在于提供一种染料废水净化处理方法，其特征在于所述方法中以权利要求1所述的产酸克雷伯氏菌MOW-02-05菌株为菌种，碳源为电子供体，偶氮染料为电子受体，进行脱色净化处理。

使用的微生物

产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)MOW-02-05菌株分离自中国科学技术大学苏州研究院的环境科学技术实验室的间歇式厌氧污泥反应器，现在已经保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，分类命名为Klebsiella oxytoca MOW-02-05，保藏编号为CGMCC No.5237，保藏日期为2011年9月9日。

该菌株的筛选方法是使用常规的分离、纯化和筛选过程，活化培养基（1L）：蛋白胨10g，酵母膏5g，氯化钠10g，pH 7；筛选培养基（1L）：葡萄糖1.0g，甲基橙0.5g，K₂HPO₄ 1.11g，KH₂PO₄ 2.09g，NaHCO₃ 0.5g，NH₄Cl 0.28g，MgSO₄·7H₂O 0.1g，酵母膏0.1g；厌氧脱色和生物产氢培养基(1L):蔗糖6.84g,甲基橙0.327g，K₂HPO₄ 1.0g，KH₂PO₄ 0.5g，(NH₄)₂SO₄2.0g，MgSO₄·7H₂O 0.1g,微量元素溶液1ml；微量元素溶液(1L)FeSO₄·7H₂O5g，ZnSO₄·7H₂O 0.011g，MnCl₂·4H₂O 0.1g，CuSO₄·5H₂O 0.392g，Co(NO₃)₂·6H₂O 0.248g，NaB₄O₇·10H₂O 0.177g，NiCl₂·6H₂O 0.025g。

本发明提供的产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)菌株，命名为MOW-02-05，此菌经过Biolog微生物鉴定系统鉴定以及此菌16S rDNA序列分析，其属于产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)中的成员。产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)MOW-02-05的16S rDNA全基因序列已向美国国家生物技术信息中心（NCBI）的Genebank基因序列数据库递交，登录号为FJ816026。

产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)MOW-02-05的微生物学特性

1、形态学方面的特性

微生物本身形态学特性：菌体为革兰氏阴性短杆状，大小为(0.2～0.4)μm×(2.0～2.3)μm，无鞭毛，有动力，无芽孢，无荚膜。

2、培养学方面的特性

培养基用的是Luria-Bertani（LB）培养基。其在LB固体培养基上的微生物学特性：菌落呈圆形，光滑，湿润，表面凸起，中心不透明，边缘规则，大小为1-3mm，有轻微异味。该菌为兼性厌氧菌。

3、生理生化特征：

（1）杆状；

（2）革兰氏阴性；

（3）氧化/发酵（O/F）：F发酵型；

（4）氧化酶：阴性；

（5）DNA酶（37°C）：阴性；

（6）柠檬酸：阳性；

（7）乳糖：阳性；

（8）蔗糖：阳性；

（9）苯丙氨酸脱氨酶：阴性；

（10）D-葡萄糖，产酸：阳性；

（11）D-葡萄糖，产气：阳性；

（12）甘露醇：阳性；

（13）尿素：阳性；

（14）丙二酸盐：阳性；

（15）半乳糖：阳性；

（16）硝酸盐还原：阳性；

（17）木糖：阴性；

（18）蜜二糖：阳性；

（19）鼠李糖：阳性；

（20）纤维二糖：阳性；

（21）肌醇：阳性；

（22）吲哚：阴性；

（23）甲基红：阴性

（24）V-P实验：阳性；

通过生理生化检测、Biolog微生物鉴定系统鉴定以及此菌16S rDNA序列分析均表明此菌为产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)中的成员，因此可以精确地将本发明的MOW-02-05分类为产酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)，从而建立了分类鉴定微生物的一种快速（利用Biolog微生物鉴定系统，16h内即可得到鉴定结果）、可靠、准确的途径。

本发明的细菌经鉴定为Klebsiella oxytoca MOW-02-05，实验表明该菌株能在24小时能将培养基中的327mg/l的甲基橙染料全部降解。并且，该细菌对多种染料如：活性黑-5、甲基红、消散橙-3、酸红-88等均具有良好的脱色能力，同时产氢量可达到1.6mol/mol glucose。充分说明该菌株可用于各种含染料废水的生物系统，具有广泛的实际应用前景。

一株脱色、产氢细菌，命名为产酸克雷伯氏菌MOW-02-05(Klebsiellaoxytoca MOW-02-05)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.5237。所述的Klebsiella oxytoca MOW-02-05菌落圆点状，淡黄色，表面光滑，GenBank注册号为FJ816026，它的16SrRNA序列为SEQ No.1所示的序列，即：

GCAGTCGACGGTAGCACAGAGAGCTTGCTCTCGGGTGACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAAACGGTAGCTAATACCGCATAACGTCGCAAGACCAAAGAGGGGGACCTTCGGGCCTCTTGCCATCAGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTAGTAGGTGGGGTAACGGCTCACCTAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGTACTTTCAGCGGGGAGGAAGGCGATAAGGTTAATAACCTTGTCGATTGACGTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCAGGCGGTCTGTCAAGTCGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTCGAAACTGGCAGGCTGGAGTCTTGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACAAAGACTGACGCTCAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCTGTAAACGATGTCGACTTGGAGGTTGTTCCCTTGAGGAGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAGTCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACTCTTGACATCCAGGGAACTTAGCAGAGATGCTTTGGTGCCTTCGGGAACTGTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTTGTTGCCAGCGGTTCGGCCGGGAACTCAAAGGAGACTGCCAGTGATAAACTGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGAGTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCATATACAAAGAGAAGCGACCTCGCGAGAGCAAGCGGACCTCATAAAGTATGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGGATCAGAATGCCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCAAAAGAAGTAGGTAGCTTAACCTTCGGGAGGGCGCTA。

所述的菌株Klebsiella oxytoca MOW-02-05使用常规的分离、纯化的培养方法，其特征是用接种环挑取活化平板培养基上的细菌菌株接到装有菌种活化培养基的三角瓶中，在设置温度设置为35℃、转速为180rpm的摇床里震荡8小时，所得菌体离心（8,000g）20分钟，菌体用磷酸盐缓冲液洗涤，再离心，反复3次，即可获得乳白色无污染的菌株细胞。所述培养基组成成分为：蛋白胨10g，酵母膏5g，氯化钠10g，加水至1L，pH 7。

所述菌株Klebsiella oxytoca MOW-02-05的用途，能使多种偶氮染料脱色，且能利用溶液中的有机碳源（葡萄糖、蔗糖等进）产氢，厌氧脱色和生物产氢培养基组成成分为：蔗糖6.84g,染料0.327g，K₂HPO₄ 1.0g，KH₂PO₄0.5g，(NH₄)₂SO₄ 2.0g，MgSO₄·7H₂O 0.1g,微量元素溶液1ml。

微量元素溶液(1L)：FeSO₄·7H₂O 5g，ZnSO₄·7H₂O 0.011g，MnCl₂·4H₂O0.1g，CuSO₄·5H₂O 0.392g，Co(NO₃)₂·6H₂O 0.248g，NaB₄O₇·10H₂O 0.177g，NiCl₂·6H₂O 0.025g，加水至1L，pH7.0。以该菌株为菌种，葡萄糖为碳源（电子供体），偶氮染料为电子受体，同时进行脱色和产氢作用。

相对于现有技术中的方案，本发明的优点是：

本发明的目的是提供一株分离自间歇式厌氧污泥反应器的能够高效降解染料且生物产氢的菌株，并利用该菌株对染料废水进行脱色处理同时回收氢气。该细菌是一株具有极高活力，对染料具有广谱的脱色能力，同时对葡萄糖等有机碳源具有高效的产氢能力，其培养方法简单，生长速度快，不易变异，可以用作研究细菌对染料脱色和生物产氢机制双重作用的模式菌株，具有在染料废水处理以及生物产氢的工业化应用前景。

附图说明

下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：

图1为本发明筛选所得的染料降解与产氢细菌的电镜图。

图2为本发明细菌的产氢动力学实验图。

具体实施方式

以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解，这些实施例是用于说明本发明而不限于限制本发明的范围。实施例中采用的实施条件可以根据具体厂家的条件做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。

实施例1菌体的筛选

1）待间歇式厌氧污泥反应器间歇停止时，取反应器的底泥1ml；2）加入充满氮气且装有100ml筛选培养基的血清瓶中，在设置温度为35°C、转速为120rpm的摇床中震荡至血清瓶内液体无色；3）取此时血清瓶中的菌液1ml，再重复步骤2，得到筛选5次后的菌液；4）取1ml筛选5次的菌液，用无菌水稀释5000倍后涂布到固体LB培养基平板上，在通过平板划线分离法得到单个菌株；5）用接种环挑取平板培养基上的单个菌株，接入到LB液体培养基中好氧生长8小时，离心，收集菌体；6）将收集得到的菌体，重复步骤2后，利用目视比色法，选取脱色效果最佳的一株菌株。

如前所述，所用的筛选培养基组成成分为：葡萄糖1.0g，甲基橙0.5g，K₂HPO₄ 1.11g，KH₂PO₄ 2.09g，NaHCO₃ 0.5g，NH₄Cl 0.28g，MgSO₄·7H₂O0.1g，酵母膏0.1g，加水至1L，pH7。

LB培养基平板组成成分为：蛋白胨10g，酵母膏5g，氯化钠10g，琼脂15g，加水至1L，pH 7。

实施例2菌体的培养

用接种环挑取活化平板培养基上的细菌菌株Klebsiella oxytocaMOW-02-05接到装有菌种活化培养基的三角瓶中，在设置温度为35℃、转速为180rpm的摇床里震荡8小时，所得菌体离心（8,000g）20分钟，菌体用磷酸盐缓冲液洗涤，再离心，反复3次，即可获得乳白色无污染的菌株细胞。

如前所述，培养该菌株的培养基组成成分为：蛋白胨10g，酵母膏5g，氯化钠10g，加水至1L，pH7。

实施例3菌体形态学观察

细菌的光学显微镜观察

按照实施例2的方法收集菌体，采用常规的火焰固定法固定细菌，后放入光学显微镜下进行染色实验观察。

细菌的扫描电子显微镜(SEM)观察

按照实施例2的方法收集菌体，用50mM磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤三次，然后用2.5％戊二醛固定过夜，再用PBS洗涤三次，最后用乙醇依次脱水、真空干燥制成样本，喷金后用SEM进行观察。

实施例4菌株的鉴定

按照实施例2的步骤收集菌体，根据细菌DNA提取试剂盒的方法步骤提取出菌株的总DNA，并通过琼脂糖凝胶电泳验证。取50ml的DNA样品进行聚合酶链式反应(PCR)扩增，用于扩增的PCR反应引物为通用引物：正向引物27F 5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3；反向引物1492R5-GGTTACCTTGGTTACGACTT-3；扩增条件：95°C 5min；60°C 30S；72°C1min，30个循环；72°C 9min。得到的PCR产物经琼脂糖凝胶电泳验证后进行16S rRNA基因测序，将序列输入到GenBank核酸数据库中利用BLAST软件进行序列比对，得到菌株的序列与MOW-02-05的相似性达到99％。

实施例5菌株对偶氮染料的脱色和生物产氢效果

1、在250ml的厌氧脱色和生物产氢培养基中接种实施例2得到的纯菌株，调整溶液中细菌浓度为0.3g细胞干重/l；以不加菌株的培养基作为对照组。将装置放入35℃恒温摇床中，以180rpm转速震荡脱色、产氢。

如前所述，厌氧脱色和生物产氢培养基组成成分为：蔗糖6.84g,染料0.1mol，K₂HPO₄ 1.0g，KH₂PO₄ 0.5g，(NH₄)₂SO₄ 2.0g，MgSO₄·7H₂O 0.1g,微量元素溶液1ml；微量元素溶液(1L)：FeSO₄·7H₂O 5g，ZnSO₄·7H₂O 0.011g，MnCl₂·4H₂O0.1g，CuSO₄·5H₂O 0.392g，Co(NO₃)₂·6H₂O 0.248g，NaB₄O₇·10H₂O 0.177g，NiCl₂·6H₂O0.025g，加水至1L，pH7.0。

2、每隔10分钟取气体样一次，用注射器排出血清瓶的气体体积，并用气体取样针抽取1ml排出的气体，供气相色谱GC-TCD测定氢气量；色谱条件为：

分子筛为单体，高纯氩气作为载气，流速30ml/min，进样口、柱温、检测器温度分别为100℃、50℃和100℃。每隔30分钟取液体样一次，样品经过离心，取上清液利用紫外-可见分光光度计测定培养基在染料的最大吸收峰处的吸收值。脱色率（％）=（A-B）/A×100％，其中：A为脱色前培养基的OD值，B为脱色后的培养基OD值。在该培养条件下，菌株Klebsiella oxytoca MOW-02-05对327mg/L甲基橙染料脱色率24小时内达99％以上，产氢量可达1.6mol/mol glucose。

上述实例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人是能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)MOW-02-05，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCCNo.5237。

2.根据权利要求1所述的产酸克雷伯氏菌MOW-02-05，其特征在于所述细菌菌落圆点状，淡黄色，表面光滑。

3.根据权利要求1所述的产酸克雷伯氏菌MOW-02-05，其特征在于所述细菌的16S rRNA序列为SEQ No.1。

4.一种权利要求1所述的产酸克雷伯氏菌MOW-02-05的培养筛选方法，其特征在于所述方法包括将间歇式厌氧污泥反应器中污泥样品进行稀释后按照常规培养形成菌落，然后挑单菌落分离纯化得到纯化的产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)MOW-02-05的步骤。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述方法中还包括将所述纯化的产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)MOW-02-05菌株按照3～5%的接种量接入液体培养基，液体培养基的pH值控制在6.8～7.2范围内，培养温度为33～38℃，培养时间为24h～48h，得到扩大培养的产酸克雷伯氏菌MOW-02-05菌株。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述方法中所述的液体培养基以其组分的配比计包括：蛋白胨10重量份数，酵母膏5重量份数，氯化钠10重量份数，水1000重量份数，且液体培养基的pH值控制在6.8～7.2。

7.一种权利要求1所述的产酸克雷伯氏菌MOW-02-05在染料废水净化处理以及生物产氢中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于所述应用中以权利要求1所述的产酸克雷伯氏菌MOW-02-05菌株为菌种，碳源为电子供体，偶氮染料为电子受体，同时进行脱色和产氢作用。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于所述应用中权利要求1所述的产酸克雷伯氏菌MOW-02-05菌株进行培养的培养基组分为：蔗糖6.84重量份数,染料0.327重量份数，K₂HPO₄ 1.0重量份数，KH₂PO₄ 0.5重量份数，(NH₄)₂SO₄ 2.0重量份数，MgSO₄·7H₂O 0.1重量份数,微量元素溶液1重量份数。

10.一种染料废水净化处理方法，其特征在于所述方法中以权利要求1所述的产酸克雷伯氏菌MOW-02-05菌株为菌种，碳源为电子供体，偶氮染料为电子受体，进行脱色净化处理。