CN115820507A

CN115820507A - 一株低温好氧同步脱氮除磷菌及其应用

Info

Publication number: CN115820507A
Application number: CN202211635792.0A
Authority: CN
Inventors: 艾恒雨; 王蕊; 王晓栋; 韩旭; 郭存银; 余雅静; 颜婉茹
Original assignee: Harbin University of Science and Technology
Current assignee: Harbin University of Science and Technology
Priority date: 2022-12-19
Filing date: 2022-12-19
Publication date: 2023-03-21
Anticipated expiration: 2042-12-19
Also published as: CN115820507B

Abstract

一株低温好氧同步脱氮除磷菌及其应用。它属于污水生物处理技术领域。低温好氧同步脱氮除磷菌，它已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC No:25971，保藏时间为2022年10月26日，它为产酸克雷伯氏菌D1。它应用于低温污水处理与水体修复过程中的脱氮除磷。本发明产酸克雷伯氏菌D1，在有氧条件下以硝酸盐作为唯一氮源生长代谢，先后经缺磷培养基、富磷培养基培养后，可实现同步脱氮除磷，在污水温度为10℃～15℃时，对NO₃‑N和TP降解率分别为85％和78％。菌株D1可应用于城市水处理、地表水体修复等需要对污水进行脱氮除磷的环节，在低温污水处理中具有较高的应用价值。

Description

一株低温好氧同步脱氮除磷菌及其应用

技术领域

本发明属于污水生物处理技术领域，具体涉及一株低温好氧同步脱氮除磷菌及其应用。

背景技术

随着社会的不断发展，生活污水、工业废水、养殖废水和垃圾渗滤液等不同各类的污水大量排放到城市污水管网中，这些污水中含有较多的含氮、含磷有机物，污水中的这些氮磷如果不能在污水处理厂内得到有效脱除，会随污水厂尾水排放到自然界地表水体中，易引起水体富营养化，造成浮游藻类的快速、大量繁殖，释放藻毒素，产生“水华”现象，致使水体缺氧，水生物窒息死亡，使水生态系统受到破坏，造成生物多样性的减少。因此，污水脱氮除磷十分必要。

国内外污水脱氮的方法主要是好氧缺氧生物法，一般是利用氨化菌、硝化菌在好氧条件下将含氮有机物氧化成硝酸盐或亚硝酸盐，再由反硝化菌在缺氧条件下将硝酸盐还原成氮气，排出系统。采用好氧缺氧生物法脱氮的实际工程中，需分别设置专门的好氧池和缺氧池，这无疑增加了污水厂的占地，另外，由于需要回流硝化液和外加碳源，也提高了污水厂运行管理的复杂程度。

污水除磷的方法主要包括吸附法、化学沉淀和生物除磷，目前研究者采用的吸附剂包括沸石、凸凹棒石等无机矿物质，粉煤灰、钢渣等固体废物，活性碳、石墨烯等碳基材料，金属(氢)氧化物、MOF等人工合成吸附剂等，这些吸附剂的成本较高，吸附容量较小，且在污水中易被水中有机物覆盖，难以工程化应用；化学沉淀除磷的主要原理是除磷剂与水中的磷发生化学反应，生成磷酸盐沉淀，除磷效率高，但这种方法不仅会大量消耗除磷剂，还会产生大量的化学污泥，增加了污泥处理成本，也增大了环境污染风险，因此，目前污水除磷的主要方法还是集中在生物法上；与常规生物脱氮类似，常规生物除磷也需要设置专门厌氧池和好氧池、除磷菌在厌氧和好氧交替条件下生长，完成生物吸磷，并通过排放剩余生物污泥的方法除磷，该方法需要严格控制厌氧池的溶解氧，操作条件较苛刻。

单独设置厌氧、缺氧和好氧池进行分步脱氮除磷的污水处理系统中，为同时去除有机物需要对好氧池内的污水进行大量曝气，但在溶解氧充足的条件下，好氧池内硝化菌对营养物质的竞争能力不敌异养菌，生长受限，硝化菌的硝化能力也受到抑制，常会出现出水总氮不达标的情况。这个问题直到有学者发现了具有同时脱氮和除磷能力的微生物才有了解决的可能。因此突破传统的脱氮除磷模式，筛选分离出能够在好氧条件具有同步脱氮除磷功能的菌株，便可以在好氧条件下同时完成有机物、氮和磷的去除，无需外加碳源和硝化液回流，不仅减少了污水厂占地，还可简化流程，降低运行成本，这对开发污水处理新工艺、治理和修复受污染水体具有重要的现实意义

发明内容

本发明目的是提供一株低温好氧同步脱氮除磷菌，解决现有同步脱氮除磷菌对污水中氮磷处理效果不佳的问题。

一株低温好氧同步脱氮除磷菌，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC No:25971，保藏时间为2022年10月26日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，它为产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)D1。

上述一株低温好氧同步脱氮除磷菌：它应用于低温污水处理或低温水体修复过程中的脱氮除磷；所述低温为10℃～15℃。

上述一株低温好氧同步脱氮除磷菌，它应用于低温污水处理或低温水体修复的过程如下：

将产酸克雷伯氏菌D1的菌液投加到盛有COD浓度为300mg/L的城市污水的容器中，同时加入块状聚氨酯填料，在溶解氧浓度1mg/L～2mg/L条件下进行间歇式曝气培养，培养过程中每隔7～9h检测污水的COD值，若有下降则需继续加入上述城市污水，继续培养9d～10d后，取出块状聚氨酯填料，将其投加到待处理的低温污水或低温待修复水体中，按照常规污水处理工艺进行同步脱氮除磷，即完成所述处理；

进一步的，所述待处理的低温污水：COD、NH₃-N、TN、TP分别为180mg/L～300mg/L、30mg/L～43mg/L、45mg/L～78mg/L、3.8mg/L～6.2mg/L，pH值6.8～7.5，水温为10℃～15℃。

进一步的，所述低温待修复水体：进水COD、NH₃-N、TN、TP分别为40mg/L～60mg/L、5mg/L～12mg/L、15mg/L～20mg/L、0.5mg/L～1.0mg/L，pH值6.8～7.2，水温为12℃～15℃。

进一步的，所述取出块状聚氨酯填料，将其投加到待处理的低温污水或低温待修复水体中，此过程于2d～10d内完成。

所述产酸克雷伯氏菌D1的菌液与城市污水的体积比5L:100L。

所述产酸克雷伯氏菌D1的菌液OD值为0.4～0.5。

本发明中一株低温好氧同步脱氮除磷菌，它为产酸克雷伯氏菌D1，其生物学特征为革兰氏阴性G^-，呈现单细胞短杆状，细菌菌落呈圆形，大小为1.0mm～1.2mm，乳白色，表面光滑，边缘整齐，微隆起，有光泽，不透明，其最适生长条件为：pH7.2～8.0，温度15℃～25℃。

本发明中产酸克雷伯氏菌D1，其菌株的理化性质：菌株D1可实现同步脱氮除磷，在污水温度为10℃～15℃时，对NO₃-N和TP降解率分别为85％和78％；产酸克雷伯氏菌D1可应用于城市水处理、地表水体修复等需要对污水进行脱氮除磷的环节，在低温污水处理中具有较高的应用价值。

本发明中低温好氧同步脱氮除磷菌，其菌株的分子生物学鉴定结果：其16S rDNA序列长度为1418bp，Genbank登录号为OL884426.1，对其进行同源性序列比对分析，比对结果显示其与克雷伯氏菌属(Klebsiella sp.)同源性达到99％～100％。结合细菌形态特征、生长条件、生理生化鉴定结果，确定此低温好氧同步脱氮除磷菌为克雷伯氏菌属的一个新菌种，命名为产酸克雷伯氏菌D1。

本发明中产酸克雷伯氏菌D1，可在有氧条件下以硝酸盐作为唯一氮源生长代谢，先后经缺磷培养基、富磷培养基培养后，可实现同步脱氮除磷，在污水温度为10℃～15℃时，对NO₃-N和TP降解率分别为85％和78％。菌株D1可应用于城市水处理、地表水体修复等需要对污水进行脱氮除磷的环节，在低温污水处理中具有较高的应用价值。

本发明中低温好氧同步脱氮除磷菌适用于低温污水处理与水体修复过程中的脱氮除磷。

附图说明

图1是本发明中产酸克雷伯氏菌D1的系统进化树；

图2是本发明中产酸克雷伯氏菌D1的脱氮率正交实验各因子水平均值图；

图3是本发明中产酸克雷伯氏菌D1的除磷率正交实验各因子水平均值图；

图4是本发明中产酸克雷伯氏菌D1对生活与工业混合污水的脱氮除磷效果图；

图5是本发明中产酸克雷伯氏菌D1对地表受污染水体的脱氮除磷效果图。

具体实施方式

具体实施方式一：本实施方式一株低温好氧同步脱氮除磷菌，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC No:25971，保藏时间为2022年10月26日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，它为产酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)D1。

上述一株低温好氧同步脱氮除磷菌，它的分离筛选过程如下：

1、从自然湿地取得新鲜污泥并稀释，待泥水混合物静置2h后，取25mL泥水混合液，并将其搅拌均匀，转移至250mL灭过菌的富集培养基中，放入20℃气浴摇床以160r/min转速培养2～3d，然后取25mL该富集培养基加入到新的富集培养基中，按相同步骤继续富集培养，共富集3次；

2、用无菌移液枪吸取1mL富集液装于含有9mL无菌水的小试管中，充分摇匀后得到浓度为10^-1的菌悬液，再采用无菌水将稀释混合液样品制成不同浓度梯度的稀释液，浓度分别为10^-3、10^-4、10^-5、10^-6和10^-7；再分别吸取各浓度梯度的稀释液1mL，接种于BTB培养基上，每个稀释度重复3次，然后将稀释涂布后的培养基平板倒置于20℃的恒温培养箱中培养2d后，从几个稀释梯度的平板中挑选出培养基变蓝菌落，于BTB固体培养基平板上进行划线分离纯化，直到得到菌落特征一致的单株菌落作为初选菌落；

3、将初选菌株接种于反硝化缺磷培养基中，在温度20℃条件下好氧恒温培养24h，再将反硝化缺磷培养基中的混合液，在4000r/min条件下离心5min，收集菌体，之后接入反硝化富磷培养基中，继续在温度20℃条件下好氧恒温培养，并每隔24h取样，测定其脱氮率、除磷率，筛选出脱氮率、除磷率均大于50％的低温好氧同步脱氮除磷菌D1，同时将其在牛肉膏蛋白胨培养基斜面中保存。

优选地，步骤(1)中富集培养基的组成为：柠檬酸钠5.0g，KNO₃2.0g，K₂HPO₄1.0g，KH₂PO₄1.0g，MgSO₄·7H₂O0.2g，NaCl30.0g，蒸馏水1L，pH值为7.0～7.2。

优选地，步骤(2)中BTB固体培养基的组成为：琼脂20.0g，柠檬酸钠5.0g，KNO₃2.0g，K₂HPO₄ 1.0g，KH₂PO₄ 1.0g，MgSO₄·7H₂O0.2g，NaCl30.0g，BTB指示剂(溴麝香草酚蓝)1mL，蒸馏水1L，调节pH值至7.0～7.2。

优选地，步骤(3)中反硝化缺磷培养基组成为：KNO₃ 2g/L，柠檬酸钠5.0g/L，K₂HPO₄0.05g/L，MgSO₄·7H₂O0.2g/L，CaCl₂ 0.5g/L，微量元素2mL/L；微量元素组成为：FeCl₃·6H₂O1.5g/L，H₃BO₃ 0.15g/L，CuSO₄·5H₂O0.03g/L，KI0.03g/L，Na₂MoO₄·2H₂O0.06g/L，MnCl₂·4H₂O0.12g/L，ZnSO₄·7H₂O0.12g/L，CoCl₂·2H₂O0.12g/L。

优选地，步骤(3)中反硝化富磷培养基组成为：KNO₃ 2g/L，柠檬酸钠5.0g/L，K₂HPO₄0.05g/L，KH₂PO₄ 0.2g/L，MgSO₄·7H₂O0.2g/L，CaCl₂ 0.5g/L，微量元素2mL/L；微量元素组成为：FeCl₃·6H₂O1.5g/L，H₃BO₃ 0.15g/L，CuSO₄·5H₂O0.03g/L，KI0.03g/L，Na₂MoO₄·2H₂O0.06g/L，MnCl₂·4H₂O0.12g/L，ZnSO₄·7H₂O0.12g/L，CoCl₂·2H₂O0.12g/L。

优选地，步骤(3)中牛肉膏蛋白胨培养基组成为：牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，NaCl5.0g，琼脂15g～20g，蒸馏水1L，调节pH值至7.0～7.2。

本实施方式步骤二中初选菌落，其生物学特征为革兰氏阴性G^-，呈现单细胞短杆状，细菌菌落呈圆形，大小为1.0mm～1.2mm，乳白色，表面光滑，边缘整齐，微隆起，有光泽，不透明，初步鉴定为克雷伯氏菌属。

本实施方式步骤三中低温好氧同步脱氮除磷菌D1，提取其基因组DNA，并以其为模板扩增16S rDNA，检测条件如表1、表2和表3所示。PCR产物的纯化和测序由北京美优安诺生物科技有限公司完成，Genbank登录号为OL884426.1，将其进行同源性序列比对分析，比对结果显示其与克雷伯氏菌属(Klebsiella sp.)同源性达到99％～100％，应用MEGA6.0软件构建该菌株系统发育树(图1)，结合细菌形态特征、生长条件、生理生化鉴定结果，确定此菌为克雷伯氏菌属的一个新菌种，命名为产酸克雷伯氏菌D1。

表1引物序列

表2PCR反应体系

表3PCR反应条件

具体实施方式二：本实施方式一株低温好氧同步脱氮除磷菌的应用，它应用于低温污水处理或低温水体修复过程中的脱氮除磷；所述低温为10℃～15℃。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式二不同的是，应用于低温污水处理或低温水体修复的过程如下：

将产酸克雷伯氏菌D1的菌液投加到盛有COD浓度为300mg/L的城市污水的容器中，同时加入块状聚氨酯填料，在溶解氧浓度1mg/L～2mg/L条件下进行间歇式曝气培养，培养过程中每隔7～9h检测污水的COD值，若有下降则需继续加入上述城市污水，继续培养9d～10d后，取出块状聚氨酯填料，将其投加到待处理的低温污水或低温待修复水体中，按照常规污水处理工艺进行同步脱氮除磷，即完成所述处理。其它与具体实施方式二相同。

本实施方式中块状聚氨酯填料的尺寸为3cm×3cm×3cm。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式二不同的是，所述待处理的低温污水：COD、NH₃-N、TN、TP分别为180mg/L～300mg/L、30mg/L～43mg/L、45mg/L～78mg/L、3.8mg/L～6.2mg/L，pH值6.8～7.5，水温为10℃～15℃。其它与具体实施方式二相同。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式二不同的是，所述低温待修复水体：进水COD、NH₃-N、TN、TP分别为40mg/L～60mg/L、5mg/L～12mg/L、15mg/L～20mg/L、0.5mg/L～1.0mg/L，pH值6.8～7.2，水温为12℃～15℃。其它与具体实施方式二相同。

具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式三不同的是，所述取出块状聚氨酯填料，将其投加到待处理的低温污水或低温待修复水体中，此过程于2d～10d内完成。其它与具体实施方式三相同。

具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式三不同的是，所述产酸克雷伯氏菌D1的菌液与城市污水的体积比5L:100L。其它与具体实施方式三相同。

具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式三不同的是，所述产酸克雷伯氏菌D1的菌液OD值为0.4～0.5。其它与具体实施方式三相同。

通过以下试验验证本发明的有益效果：

试验1：生长因子对产酸克雷伯氏菌D1同步脱氮除磷效果影响的测定：

选取温度、pH、碳氮比(C/N)为影响因子，设置三因素三水平正交实验。考察其对产酸克雷伯氏菌D1脱氮除磷效能的影响。温度影响因子设置10、15、25℃三个水平，pH值影响因子设置6、7、8三个水平，碳氮比(C/N)影响因子设置6:1、7:1、8:1三个水平，实验条件如表4所示。

表4正交实验表

按照相应的实验条件分别调整反硝化缺磷培养基和反硝化富磷培养基中药品用量以及pH值。

取产酸克雷伯氏菌D1一接种环的量分别接种于20mL各实验条件下的反硝化缺磷培养基中，曝气恒温培养24h后，取出5mL混合液，4000r/min离心5min后收集菌体，分别接入20mL各实验条件下的反硝化富磷培养基中，曝气恒温培养24h、48h，测定各反硝化富磷培养基中磷和硝酸盐氮的浓度变化。结果如图2、图3所示，D1的最佳脱氮除磷条件为：温度为25℃，pH值为7，碳氮比为6:1。

试验2：产酸克雷伯氏菌D1同步脱氮除磷性能的测定：

(1)将培养得到的同步脱氮除磷菌D1在活化培养基中进行扩繁。分别取活化后的菌种D1菌液1mL，接种于两支分别装有20mL反硝化缺磷培养基的试管a和试管b中，置于鼓风恒温培养箱中，同时将一支仅装有20mL反硝化缺磷培养基不接种菌液的试管c置于该培养箱中，作为非生物作用脱氮的参照，20℃～25℃培养36h后，对试管a中的培养液经4000r/min离心，测定上清液的氮含量；

3组平行实验的结果显示，在原始NO₃-N浓度为277mg/L、TP浓度为8.9mg/L、pH值7～7.条件下，产酸克雷伯氏菌D1的硝酸盐氮去除率为85.7％～90.5％；

所述活化培养基：采用LB液体培养基，其组成为：牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，NaCl5.0g，蒸馏水1L，调节pH值至7.0～7.2。产酸克雷伯氏菌D1能以硝酸盐为唯一氮源生长；

(2)从上述培养36h后的试管b中取1mL菌液接种于装有20mL反硝化富磷培养基的试管d中，置于恒温培养箱中，同时将一支仅装有20mL反硝化富磷培养基不接种菌液的试管e置于该培养箱中，作为非生物作用除磷的参照，继续25℃恒温培养48h，对试管e中的培养液经4000r/min离心，测定上清液的氮和磷含量。

3组平行实验的平均结果显示，在原始NO₃-N浓度为277mg/L、TP浓度54.5mg/L、pH值7～7.2条件下，产酸克雷伯氏菌D1对NO^3--N和TP的降解率分别为88.6％和79.8％。

试验3：产酸克雷伯氏菌D1在城市污水处理中的应用：

将产酸克雷伯氏菌D1的菌液投加到盛有COD浓度约为300mg/L的城市污水的容器中(菌液与城市污水的体积比5L:100L；菌液浓度为OD值为0.5，同时加入尺寸约为3cm×3cm×3cm的块状聚氨酯填料，在溶解氧浓度1mg/L～2mg/L条件下进行间歇式曝气培养，培养过程中每隔8h检测污水的COD值，若有下降则需继续加入上述城市污水，继续培养9d～10d后，取出聚氨酯填料，将其投加到四川省阿坝州某污水处理站的脱氮除磷池中进行连续性试验，在原水为生活与工业混合城市污水，COD、NH₃-N、TN、TP分别为180mg/L～300mg/L、30mg/L～43mg/L、45mg/L～78mg/L、3.8mg/L～6.2mg/L，pH值6.8～7.5，水温为10℃～15℃，水力停留时间36h条件下，连续运行20天，得到了如图4所示的氮磷去除结果，由图4可见，产酸克雷伯氏菌D1对总氮和总磷的最大去除率分别达到了85％和78％，可见该菌株在低温下对城市污水具有优良的氮磷去除能力。

试验4：产酸克雷伯氏菌D1在地表水体修复中的应用：

将试验3中负载产酸克雷伯氏菌D1并完成挂膜的聚氨酯填料置于人工湿地(主要植物为芦苇、香蒲和水葱)中试装置内，以人工配制污水为原水进行连续试验，并与不投加填料的人工湿地装置进行对比，在进水COD、NH₃-N、TN、TP分别为40mg/L～60mg/L、5mg/L～12mg/L、15mg/L～20mg/L、0.5mg/L～1.0mg/L，pH值6.8～7.2，水温为12℃～15℃，水力停留时间48h条件下，得到了如图5所示的结果，由图5可见，与对比试验相比，产酸克雷伯氏菌D1可以将脱氮除磷效率分别提高约32％和28％，表现了优良的氮磷污染修复性能。

Claims

1.一株低温好氧同步脱氮除磷菌，其特征在于它已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC No:25971，保藏时间为2022年10月26日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，它为产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)D1。

2.如权1所述一株低温好氧同步脱氮除磷菌的应用，其特征在于它应用于低温污水处理或低温水体修复过程中的脱氮除磷；所述低温为10℃～15℃。

3.根据权利要求2所述的一株低温好氧同步脱氮除磷菌的应用，其特征在于应用于低温污水处理或低温水体修复的过程如下：

将产酸克雷伯氏菌D1的菌液投加到盛有COD浓度为300mg/L的城市污水的容器中，同时加入块状聚氨酯填料，在溶解氧浓度1mg/L～2mg/L条件下进行间歇式曝气培养，培养过程中每隔7～9h检测污水的COD值，若有下降则需继续加入上述城市污水，继续培养9d～10d后，取出块状聚氨酯填料，将其投加到待处理的低温污水或待低温修复水体中，按照常规污水处理工艺进行同步脱氮除磷，即完成所述处理。

4.根据权利要求2所述的一株低温好氧同步脱氮除磷菌的应用，其特征在于所述待处理的低温污水：COD、NH₃-N、TN、TP分别为180mg/L～300mg/L、30mg/L～43mg/L、45mg/L～78mg/L、3.8mg/L～6.2mg/L，pH值6.8～7.5，水温为10℃～15℃。

5.根据权利要求2所述的一株低温好氧同步脱氮除磷菌的应用，其特征在于所述低温待修复水体：进水COD、NH₃-N、TN、TP分别为40mg/L～60mg/L、5mg/L～12mg/L、15mg/L～20mg/L、0.5mg/L～1.0mg/L，pH值6.8～7.2，水温为12℃～15℃。

6.根据权利要求3所述的一株低温好氧同步脱氮除磷菌的应用，其特征在于所述取出块状聚氨酯填料，将其投加到待处理的低温污水或低温待修复水体中，此过程于2d～10d内完成。

7.根据权利要求3所述的一株低温好氧同步脱氮除磷菌的应用，其特征在于所述产酸克雷伯氏菌D1的菌液与城市污水的体积比5L:100L。

8.根据权利要求3所述的一株低温好氧同步脱氮除磷菌的应用，其特征在于所述产酸克雷伯氏菌D1的菌液OD值为0.4～0.5。