CN104673738B - 一种异养硝化好氧反硝化细菌的驯化与筛选方法 - Google Patents

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Abstract

本发明是一种异养硝化好氧反硝化细菌的驯化与筛选方法，该方法通过摇瓶富集、污泥聚集、SBR反应器间歇驯化及低溶解氧A/O工艺逐步驯化、分离筛选获得异养硝化好氧反硝化细菌，建立一种高效获得目标菌株的方法。按照本发明的筛选方法可以成功筛选到异养硝化好氧反硝化细菌，并且以筛选到的细菌为活性成分制得的微生物制剂能够在同一反应器中有效脱除水体中的氨氮和总氮，同时对废水中的酚类、胺类、杂环类、氰类、多环芳烃类等有毒物质具有耐受性和降解能力，适应环境能力强，在实际工程应用中有很大的应用前景。

Description

一种异养硝化好氧反硝化细菌的驯化与筛选方法
技术领域
本发明属于环境微生物技术领域，具体涉及一种异养硝化好氧反硝化细菌的驯化与筛选方法。
背景技术
传统的废水生物脱氮技术主要是靠自养硝化菌和异养反硝化菌通过硝化和反硝化偶联使氨氮转变为氮气脱除。而自养细菌自身的增殖速度慢、在混合培养的活性污泥系统中无法与异养细菌竞争、难以获得较高的生物量，硝化效率低，导致自养微生物脱氮系统抗冲击能力弱，硝化作用不完全；反硝化菌为异养菌，运行中往往需要补加碳源，增加了运行成本。
鉴于传统的硝化细菌和反硝化细菌的不足，异养硝化细菌、好氧反硝化细菌的发现解决了传统生物脱氮处理启动时间长，硝化环节条件要求苛刻，硝化和反硝化不能同步进行等缺点，具有较好的发展前景。近来的研究表明，有些异养微生物也能进行硝化作用，如脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)、粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)、芽孢杆菌(Bacillus sp.) 和红球菌(Rhodococcus sp.) 等。与自养硝化细菌相比，异养硝化细菌具有生长速率快、要求溶解氧浓度低、能耐受更酸环境的优点。已报道的异养硝化细菌很多又同时具有好氧反硝化的功能，这为污水脱氮引入新的概念，使得同步硝化反硝化得以实现。
目前，高氨氮行业的废水一般含有很多含有毒有害物质，针对这一情况，筛选获得耐受环境毒害、去除难降解物质的高效异养硝化好氧反硝化功能菌株，以其为活性成分制得微生物制剂，应用在废水处理体系中，作为优势种群而发挥脱氮和去除COD的功能。
中国公开专利文献CN 102041291 B公开了一种反硝化细菌的筛选方法，该方法为富集后进行分离纯化，对分离得到的菌株再进行不同方法的生长能力驯化，分离纯化菌株每一株均进行生长能力驯化，加大了筛选的工作量；中国公开专利文献CN1594591A 公开了一种筛选好氧反硝化菌的方法，该方法通过厌氧脱氮污泥富集培养、平板分离纯化、初筛、复筛得到好氧反硝化细菌，该方法筛选得到的细菌总氮脱除能力不足。而对异养硝化好氧反硝化功能菌株的筛选，随机性较大，没有较可靠的筛选方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种新的筛选异养硝化好氧反硝化细菌的方法。该方法极大提高了筛选到异养硝化好氧反硝化细菌的可能性，并且筛选到的脱氮细菌对有害毒物有一定的耐受性和降解能力，适应环境能力强，能有效的缓解工业废水中氮素超标的现状，降低环境污染。
本发明所要解决的技术问题通过以下的技术方案来实现的，本发明一种异养硝化好氧反硝化细菌的驯化与筛选方法，其特点是，包括以下步骤：
（1）将样品接种至含有含氮废水的富集营养液中对脱氮菌群进行摇瓶异养富集培养，得脱氮菌群的富集培养液；
（2）在好氧曝气反应器中用含氮废水使富集培养液的脱氮菌群快速增殖；
（3）用实际含氮废水在SBR反应器进行异养脱氮菌群驯化培养；
（4）用A/O工艺及实际含氮废水在对脱氮菌群进行驯化培养；
（5）从A/O工艺驯化污泥中分离纯化脱氮细菌；
（6）纯化菌株的异养硝化好氧反硝化能力验证；
（7）将异养硝化好氧反硝化能力强的菌株进行鉴定。
本发明所述的异养硝化好氧反硝化细菌的驯化与筛选方法技术方案中，进一步优选的技术特征是：在步骤（1）中，接种的样品是土壤样品、活性污泥、污水中的一种或多种；每L富集营养液的组成为：（NH4）2SO40.5～1g/L，葡萄糖0.5～1g/L，KH2PO4或K2HPO40.5～5.0g/L，MgCl20.5～5.0 g/L，Na2CO30.5～5.0 g/L，含氮废水40～60mL，其余为蒸馏水；摇瓶异养富集培养的条件为：温度：10℃～35℃，pH：6.0～10.0，转速：150rpm～220rpm；摇瓶富集培养过程中，氮降解达到90%以上时，将富集培养液以5～10%体积转接到新鲜的富集营养液中，活菌数≥2×109以上终止培养。
本发明所述的异养硝化好氧反硝化细菌的驯化与筛选方法技术方案中，进一步优选的技术特征是：在步骤（2）快速增殖中，以葡萄糖、甲醇或苯酚中的一种或多种作为碳源，以硫酸铵、氯化铵或尿素中的一种或多种作为氮源，氨氮质量浓度300～600mg/L，碳氮比20:1～10:1，培养条件为：温度：10℃～35℃；pH：6.0～10.0；DO：0.5～4.0 mg/L。
本发明所述的异养硝化好氧反硝化细菌的驯化与筛选方法技术方案中，进一步优选的技术特征是：在在步骤（2）快速增殖中，好氧曝气培养污泥浓度≥3000mg/L以上，活菌数为≥2×109时结束培养。
本发明所述的异养硝化好氧反硝化细菌的驯化与筛选方法技术方案中，进一步优选的技术特征是：在步骤（3）中SBR反应器运行周期包括进水、曝气、沉淀和排水，水力停留时间20～40h；调节氨氮初始浓度100～200mg/L，逐渐增加至200～400mg/L，维持碳氮比1:1～0.5:1，培养条件为：温度：10℃～35℃；pH：6.0～10.0；DO：0.5～4.0 mg/L。
本发明所述的异养硝化好氧反硝化细菌的驯化与筛选方法技术方案中，进一步优选的技术特征是：在步骤（3）在含氮废水中氨氮降解率90%以上，硝酸盐开始积累时终止反应。
本发明所述的异养硝化好氧反硝化细菌的驯化与筛选方法技术方案中，进一步优选的技术特征是：在步骤（4）所述A/O工艺，A池控制溶解氧为0.5～1mg/L，O池溶解氧1～2mg/L，维持污泥回流比为2:1～8:1，培养温度：10℃～35℃，pH：6.0～10.0；实际含氮废水COD为1500～2100mg/L，氨氮100～300mg/L，总氮350～450 mg/L。
本发明所述的异养硝化好氧反硝化细菌的驯化与筛选方法技术方案中，进一步优选的技术特征是：在步骤（4）在氨氮＜15mg/L，总氮≤25 mg/L ，COD ≤50mg/L时结束反应。
本发明所述的异养硝化好氧反硝化细菌的驯化与筛选方法技术方案中，进一步优选的技术特征是：在步骤（5）所用的筛选培养基为：5%含氮废水，（NH4）2SO4 0.15～1.5 g/L，KNO3 0.2～1.2 g/L，MgSO4 0.01～0.02 g/L，K2HPO4 0.1～0.3 g/L，FeSO4·7H2O 0.05～0.1g/L，1.5～2.5%琼脂，其余为水；分离纯化培养基为：牛肉膏3～5g/L，蛋白胨6～12g/L，氯化钠3～6g/L，蒸馏水1L，1.5～2.5%琼脂。
本发明所述的异养硝化好氧反硝化细菌的驯化与筛选方法技术方案中，进一步优选的技术特征是：在步骤（6）中, 异养硝化好氧反硝化能力验证采用含氨氮和含硝酸盐氮两种培养基：含氨氮培养基：（NH4）2SO4 0.15～1.5g/L ，MgSO4 0.01～0.02g/L，K2HPO4 0.1～0.3g/L，FeSO4·7H2O 0.05～0.1 g/L，CaCl2 0. 1～0.5g/L，甲醇0.1～1.0mL，蒸馏水1L；含硝酸盐氮培养基：KNO3 0.2～1.2g/L ，MgSO4 0.01～0.02g/L，K2HPO4 0.1～0.3g/L，FeSO4·7H2O 0.05～0.1 g/L，CaCl2 0. 1～0.5g/L，甲醇0.1～1.0mL，蒸馏水1L。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明先以摇瓶富集异养脱氮菌株，然后通过控制物料添加及培养条件使以异养脱氮菌株为活性成分的污泥大量形成，接着使用SBR反应器驯化，通过控制碳氮比使异养硝化细菌大量富集，最后使用A/O工艺进行驯化，通过控制溶解氧浓度，使异养硝化好氧反硝化细菌富集建立一种高效获得目标菌株的方法，节省了分离筛选的工作量。而且，以本发明方法筛选到细菌制得的微生物制剂能够在同一反应器中有效脱除水体中的氨氮和总氮，可以直接应用于含氮有机化工废水的生物处理系统中；可以作为生物强化剂投加到废水处理系统或者在各种填料上挂膜后处理废水，同时对废水中的酚类、胺类、杂环类、氰类、多环芳烃类等有毒物质具有耐受性或降解能力，适应环境能力强，在实际工程应用中有很大的应用前景。
具体实施方式
下面结合具体实例对本发明进行说明，以下实施方式仅用于说明本发明，而不用于限制本发明所要求保护的范围。
实施例1，一种异养硝化好氧反硝化细菌的驯化与筛选方法，包括以下步骤：
（1）将样品接种至含有含氮废水的富集营养液中对脱氮菌群进行摇瓶异养富集培养，得脱氮菌群的富集培养液；
（2）在好氧曝气反应器中用含氮废水使富集培养液的脱氮菌群快速增殖；
（3）用实际含氮废水在SBR反应器进行异养脱氮菌群驯化培养；
（4）用A/O工艺及实际含氮废水在对脱氮菌群进行驯化培养；
（5）从A/O工艺驯化污泥中分离纯化脱氮细菌；
（6）纯化菌株的异养硝化好氧反硝化能力验证；
（7）将异养硝化好氧反硝化能力强的菌株进行鉴定。
实施例2，实施例1所述的方法的步骤（1）中：接种的样品是土壤样品、活性污泥、污水中的一种或多种；每L富集营养液的组成为：（NH4）2SO40.5～1g/L，葡萄糖0.5～1g/L，KH2PO4或K2HPO40.5～5.0 g/L，MgCl20.5～5.0 g/L，Na2CO30.5～5.0 g/L，含氮废水50mL，其余为蒸馏水；摇瓶异养富集培养的条件为：温度：10℃～35℃，pH：6.0～10.0，转速：150rpm～220rpm；摇瓶富集培养过程中，氮降解达到90%以上时，将富集培养液以5～10%体积转接到新鲜的富集营养液中，活菌数≥2×109以上终止培养。
实施例3，实施例1所述的方法的步骤（1）中：接种的样品是土壤样品、活性污泥、污水中的一种；每L富集营养液的组成为：（NH4）2SO40.5g/L，葡萄糖0.5g/L，KH2PO4或K2HPO40.5g/L，MgCl20.5 g/L，Na2CO30.5g/L，含氮废水40mL，其余为蒸馏水；摇瓶异养富集培养的条件为：温度：10℃，pH：6.0，转速：150rpm。
实施例4，实施例1所述的方法的步骤（1）中：接种的样品是土壤样品、活性污泥、污水中的一种或多种；每L富集营养液的组成为：（NH4）2SO41g/L，葡萄糖1g/L，KH2PO4或K2HPO45.0 g/L，MgCl25.0 g/L，Na2CO35.0 g/L，含氮废水60mL，其余为蒸馏水；摇瓶异养富集培养的条件为：温度：35℃，pH： 10.0，转速： 220rpm。
实施例5，实施例1所述的方法的步骤（1）中：接种的样品是土壤样品、活性污泥、污水中的一种或多种；每L富集营养液的组成为：（NH4）2SO40.8g/L，葡萄糖0.7g/L，KH2PO4或K2HPO42.0 g/L，MgCl22.5 g/L，Na2CO32.5 g/L，含氮废水50mL，其余为蒸馏水；摇瓶异养富集培养的条件为：温度：25℃，pH：8.0，转速：180rpm。摇瓶富集培养过程中，氮降解达到90%以上时，将富集培养液以5～10%体积转接到新鲜的富集营养液中，活菌数≥2×109以上终止培养。
实施例6，实施例1－5任何一项所述的方法的步骤（2）快速增殖中，以葡萄糖、甲醇或苯酚中的一种或多种作为碳源，以硫酸铵、氯化铵或尿素中的一种或多种作为氮源，氨氮质量浓度300mg/L，碳氮比20:1，培养条件为：温度：10℃；pH：6.0；DO：0.5 mg/L。
实施例7，实施例1－5任何一项所述的方法的步骤（2）快速增殖中，以葡萄糖、甲醇或苯酚中的一种或多种作为碳源，以硫酸铵、氯化铵或尿素中的一种或多种作为氮源，氨氮质量浓度600mg/L，碳氮比10:1，培养条件为：温度： 35℃；pH： 10.0；DO：4.0 mg/L。
实施例8，实施例1－5任何一项所述的方法的步骤（2）快速增殖中，以葡萄糖、甲醇或苯酚中的一种或多种作为碳源，以硫酸铵、氯化铵或尿素中的一种或多种作为氮源，氨氮质量浓度450mg/L，碳氮比15:1，培养条件为：温度：25℃；pH：8.0；DO：2.0 mg/L。
实施例9，实施例1－8任何一项所述的方法的步骤（2）快速增殖中，好氧曝气培养污泥浓度≥3000mg/L以上，活菌数为≥2×109时结束培养。
实施例10，实施例1－9任何一项所述的方法的步骤（3）中SBR反应器运行周期包括进水、曝气、沉淀和排水，水力停留时间20h；调节氨氮初始浓度100mg/L，逐渐增加至200mg/L，维持碳氮比1:1，培养条件为：温度：10℃；pH：6.0；DO：0.5mg/L。
实施例11，实施例1－9任何一项所述的方法的步骤（3）中SBR反应器运行周期包括进水、曝气、沉淀和排水，水力停留时间40h；调节氨氮初始浓度200mg/L，逐渐增加至400mg/L，维持碳氮比0.5:1，培养条件为：温度： 35℃；pH： 10.0；DO： 4.0 mg/L。
实施例12，实施例1－9任何一项所述的方法的步骤（3）中SBR反应器运行周期包括进水、曝气、沉淀和排水，水力停留时间30h；调节氨氮初始浓度150mg/L，逐渐增加至300mg/L，维持碳氮比0.75:1，培养条件为：温度：25℃；pH：8.0；DO：2.0 mg/L。
实施例13，实施例1－12任何一项所述的方法的步骤（3）在含氮废水中氨氮降解率90%以上，硝酸盐开始积累时终止反应。
实施例14，实施例1－13任何一项所述的方法的步骤（4）所述A/O工艺，A池控制溶解氧为0.5mg/L，O池溶解氧1mg/L，维持污泥回流比为2:1，培养温度：10℃，pH：6.0；实际含氮废水COD为1500mg/L，氨氮100mg/L，总氮350 mg/L。
实施例15，实施例1－13任何一项所述的方法的步骤（4）所述A/O工艺，A池控制溶解氧为1mg/L，O池溶解氧2mg/L，维持污泥回流比为8:1，培养温度： 35℃，pH： 10.0；实际含氮废水COD为2100mg/L，氨氮300mg/L，总氮450 mg/L。
实施例16，实施例1－13任何一项所述的方法的步骤（4）所述A/O工艺，A池控制溶解氧为0.8mg/L，O池溶解氧1.5mg/L，维持污泥回流比为5:1，培养温度：25℃，pH：8.0；实际含氮废水COD为1800mg/L，氨氮200mg/L，总氮400 mg/L。
实施例17，实施例1－16任何一项所述的方法的步骤（4）在氨氮＜15mg/L，总氮≤25 mg/L ，COD ≤50mg/L时结束反应。
实施例18，实施例1－17任何一项所述的方法的步骤（5）所用的筛选培养基为：5%含氮废水，（NH4）2SO4 0.15 g/L，KNO3 0.2 g/L，MgSO4 0.01 g/L，K2HPO4 0.1 g/L，FeSO4·7H2O 0.05 g/L，1.5%琼脂，其余为水；分离纯化培养基为：牛肉膏3g/L，蛋白胨6g/L，氯化钠3g/L，蒸馏水1L，1.5%琼脂。
实施例19，实施例1－17任何一项所述的方法的步骤（5）所用的筛选培养基为：5%含氮废水，（NH4）2SO41.5 g/L，KNO31.2 g/L，MgSO4 0.02 g/L，K2HPO4 0.3 g/L，FeSO4·7H2O0.1 g/L， 2.5%琼脂，其余为水；分离纯化培养基为：牛肉膏5g/L，蛋白胨12g/L，氯化钠6g/L，蒸馏水1L，2.5%琼脂。
实施例20，实施例1－17任何一项所述的方法的步骤（5）所用的筛选培养基为：5%含氮废水，（NH4）2SO4 0.75 g/L，KNO3 0.6 g/L，MgSO4 0.015 g/L，K2HPO4 0.2 g/L，FeSO4·7H2O 0.08 g/L，2.0%琼脂，其余为水；分离纯化培养基为：牛肉膏4g/L，蛋白胨9g/L，氯化钠5g/L，蒸馏水1L，2.0%琼脂。
实施例21，实施例1－20任何一项所述的方法的步骤（6）中, 异养硝化好氧反硝化能力验证采用含氨氮和含硝酸盐氮两种培养基：含氨氮培养基：（NH4）2SO4 0.15g/L ，MgSO4 0.01g/L，K2HPO4 0.1g/L，FeSO4·7H2O 0.05 g/L，CaCl2 0. 1g/L，甲醇0.1mL，蒸馏水1L；含硝酸盐氮培养基：KNO3 0.2g/L ，MgSO4 0.01g/L，K2HPO4 0.1g/L，FeSO4·7H2O 0.05 g/L，CaCl2 0. 1g/L，甲醇0.1mL，蒸馏水1L。
实施例22，实施例1－20任何一项所述的方法的步骤（6）中, 异养硝化好氧反硝化能力验证采用含氨氮和含硝酸盐氮两种培养基：含氨氮培养基：（NH4）2SO4 1.5g/L ，MgSO40.02g/L，K2HPO40.3g/L，FeSO4·7H2O 0.1 g/L，CaCl20.5g/L，甲醇1.0mL，蒸馏水1L；含硝酸盐氮培养基：KNO3 1.2g/L ，MgSO4 0.02g/L，K2HPO4 0.3g/L，FeSO4·7H2O 0.1 g/L，CaCl2 0.5g/L，甲醇1.0mL，蒸馏水1L。
实施例23，实施例1－20任何一项所述的方法的步骤（6）中, 异养硝化好氧反硝化能力验证采用含氨氮和含硝酸盐氮两种培养基：含氨氮培养基：（NH4）2SO4 0.75g/L ，MgSO4 0.015g/L，K2HPO4 0.2g/L，FeSO4·7H2O 0.07g/L，CaCl2 0. 3g/L，甲醇0.6mL，蒸馏水1L；含硝酸盐氮培养基：KNO3 0.7g/L ，MgSO4 0.015g/L，K2HPO4 0.2g/L，FeSO4·7H2O 0.075 g/L，CaCl2 0. 3g/L，甲醇0.6mL，蒸馏水1L。
实施例24，一种异养硝化好氧反硝化细菌驯化筛选方法，包括以下步骤：
（1）含氮废水对脱氮菌群进行摇瓶异养富集培养：
接种土壤样品、活性污泥、污水其中的一种或多种；富集阶段富集营养液为：（NH4）2SO4 0.5～1g/L、葡萄糖0.5～1g/L、KH2PO4或K2HPO40.5～5.0 g/L、MgCl20.5～5.0 g/L，Na2CO30.5～5.0 g/L；摇瓶富集培养条件为：温度10℃～35℃；pH 6.0～10.0；转速 150rpm～220rpm。富集2～3d后测定氨氮浓度，氨氮浓度降解率达到90%以上时，将富集液以5～10%的比例转接到新鲜富集培养液中，同时涂板观测富集液中活菌生长情况，当富集液中活菌数≥2×108以上终止摇瓶富集培养。
（2）好氧曝气反应器中使富集的脱氮污泥快速增殖：
将富集液转移到好氧曝气装置，接种量5～10%，以葡萄糖、甲醇或苯酚一种或多种作为碳源，以硫酸铵、氯化铵或尿素的一种或多种作为氮源，氨氮质量浓度300～600mg/L，碳氮比20:1～10:1，培养条件为：温度：10℃～35℃；pH：6.0～10.0；DO：0.5～4.0 mg/L；每日测定污泥浓度及活菌数，当污泥浓度≥3000mg/L，活菌数≥2×109时结束培养。
（3）用实际含氮废水在SBR反应器中进行异养脱氮菌群驯化培养：
含氮化工废水调节氨氮初始浓度100～200mg/L，逐渐增加至200～400mg/L，维持碳氮比1:1～0.5:1。SBR反应器运行周期包括进水-曝气-沉淀-排水，HRT（水力停留时间）20～40h。培养条件为：温度：10℃～35℃；pH：6.0～10.0；DO：0.5～4.0 mg/L。在氨氮降解率90%以上，硝酸盐开始积累时终止培养。
（4）用A/O工艺及实际含氮废水在偏低溶解氧条件下对脱氮菌群进行驯化培养：
含氮化工废水调节COD为1500～2100mg/L，氨氮100～300mg/L，总氮150～350 mg/L。A池控制溶解氧为0.5～1mg/L，O池溶解氧1～2mg/L，维持污泥回流比为2:1～8:1，培养温度：10℃～35℃，pH：6.0～10.0。在含氮化工废水中氨氮＜15mg/L，总氮≤25 mg/L ，COD ≤50mg/L 时结束反应。
（5）从A/O工艺驯化污泥中分离纯化脱氮细菌：
使用先在筛选培养基上涂布筛选，后平板划线分离纯化的方法筛选得到目标菌株。筛选培养基为：5%含氮化工废水，（NH4）2SO4 0.15～1.5 g/L，KNO3 0.2～1.2 g/L，MgSO4 0.01～0.02 g/L，K2HPO4 0.1～0.3 g/L，FeSO4·7H2O 0.05～0.1 g/L，1.5～2.5%琼脂；分离纯化培养基为：牛肉膏3～5g/L，蛋白胨6～12g/L，氯化钠3～6g/L， 1.5～2.5 %琼脂。
（6）纯化菌株的异养硝化好氧反硝化能力验证：
采用含氨氮培养基和含硝酸盐氮培养基验证菌株的好氧反硝化性能，含氨氮培养基为：（NH4）2SO4 0.15～1.5g/L ，MgSO4 0.01～0.02g/L，K2HPO4 0.1～0.3g/L，FeSO4·7H2O0.05～0.1 g/L，CaCl2 0. 1～0.5g/L；甲醇0.1～1.0ml；含硝酸盐氮培养基为：KNO3 0.2～1.2g/L ，MgSO4 0.01～0.02g/L，K2HPO4 0.1～0.3g/L，FeSO4·7H2O 0.05～0.1 g/L，CaCl2 0. 1～0.5g/L，甲醇0.1～1.0ml，蒸馏水1L。
（7）将异养硝化好氧反硝化能力强的菌株进行鉴定：
对于能在同一反应器中去除氨氮且不产生硝酸盐积累以及进行好氧反硝化去除硝酸盐氮的菌株，进行形态学、生理生化初步鉴定及专业测序公司16s rDNA测序鉴定，鉴定出3株异养硝化好氧反硝化菌株，分别为睾丸酮丛毛单胞菌LH-N5 CGMCC No. 6975、木糖氧化无色杆菌木糖氧化亚种LH-N25 CGMCC No. 6972与噬氨副球菌LH-N40 CGMCC No. 6971。睾丸酮丛毛单胞菌（Comamonas testosteroni）LH-N5 CGMCC No. 6975菌株已在申请号201310061410.2，公开号103146604A的专利文献中公开，所述的木糖氧化无色杆菌木糖氧化亚种（Achromobacter xylosoxidans subsp. xylosoxidans）LH-N25 CGMCC No. 6972已在申请号201310061316.7，公开号103122332A专利文献中公开，所述的噬氨副球菌（Paracoccus aminovorans）LH-N40 CGMCC No. 6971已在申请号201310061522.8，公开号103146605A专利文献中公开。
实施例25，异养硝化好氧反硝化细菌驯化筛选方法：
（1）含氮废水对脱氮菌群进行摇瓶异养富集培养：
取焦化厂、化肥厂、及化工园区被含氮有机物污染土壤样品，分点取样。将土壤样品以10%的接种量接种到摇瓶富集培养基中，培养温度25℃；pH 8.0；转速 170rpm。富集2～3d后测定氨氮浓度，氨氮浓度降解率达到90%以上时，将富集液以5～10%的比例转接到新鲜富集培养液中，同时涂板观测富集液中活菌生长情况，当富集液中活菌数≥2×108以上终止摇瓶富集培养。富集阶段培养基为：（NH4）2SO4 1g/L、葡萄糖1g/L、KH2PO4 0.5 g/L、MgCl20.5g/L，Na2CO31 g/L。
（2）好氧曝气反应器中使富集的脱氮污泥快速增殖：
将富集液转移到好氧曝气装置，接种量10%，以甲醇作为碳源，以氯化铵作为氮源，氨氮质量浓度300mg/L，碳氮比由20:1逐渐调整到10:1，培养条件为：温度：25℃；pH：7.0～9.0；DO：0.5～4.0 mg/L。每日测定污泥浓度及活菌数，当污泥浓度≥3000mg/L，活菌数≥2×109时结束培养。
（3）用实际含氮废水在SBR反应器中进行异养脱氮菌群驯化培养：
将好氧曝气污泥转移到SBR反应器中，使用丙烯腈废水作为驯化底物，通过稀释，使氨氮初始浓度为100mg/L，逐渐增加至300mg/L，碳氮比为1:1。SBR反应器运行周期包括进水-曝气-沉淀-排水，整个运行周期为12h，进水1～2h，曝气6～10h，沉淀1～2h，排水0.5h，HRT（水力停留时间）20.6～36h。培养条件为：温度：20℃～35℃；pH：7.0～10.0；DO：0.5～4.0 mg/L。每日检测氨氮、硝态氮、亚硝氮浓度，在氨氮降解率达到90%以上，硝酸盐不断积累时终止培养。
（4）用A/O工艺及实际含氮废水在偏低溶解氧条件下对脱氮菌群进行驯化培养：
将SBR反应器中的污泥转入A/O工艺，使用焦化废水为底物进行驯化培养。焦化废水调节COD为1500～2100mg/L，氨氮100～300mg/L，总氮150～350 mg/L。A池控制溶解氧为0.5～1mg/L，O池溶解氧1～2mg/L，维持污泥回流比为2:1～8:1，培养温度：10℃～30℃，pH：6.0～10.0。在含氮化工废水中氨氮＜15mg/L，总氮≤25 mg/L ，COD ≤50mg/L 时结束反应。
（5）从A/O工艺驯化污泥中分离纯化脱氮细菌：
取A/O工艺驯化后的污泥，通过梯度稀释制得一系列污泥菌悬液，使用涂布法接种于筛选培养基平板中，将平板置于30℃恒温培养箱中培养，待菌落长出后选取生长好，有代表性的单菌落，使用接种环在分离培养基中划线反复分离纯化，筛选得到目标菌株。筛选培养基为：5%含氮化工废水，（NH4）2SO4 0.3g/L，KNO3 0.5g/L，MgSO4 0.01g/L，K2HPO4 0.1g/L，FeSO4·7H2O 0.05g/L， 2 %琼脂；分离纯化培养基为：牛肉膏3g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠3g/L，2%琼脂。
（6）纯化菌株的异养硝化好氧反硝化能力验证及菌株鉴定：
取分离纯化后的单菌株，接种于LB液体培养基（牛肉膏3g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠3g/L，蒸馏水1L）中，培养48h后离心收集菌体，将菌体按照湿重10%的量接种于含氨氮培养基和含硝酸盐氮培养基中，验证菌株的异养硝化好氧反硝化性能，对于能在同一反应器中去除氨氮且不产生硝酸盐积累以及能够进行好氧反硝化去除硝酸盐氮的菌株，进行形态学、生理生化初步鉴定，然后送专业测序公司进行16s rDNA测序鉴定。含氨氮培养基为：（NH4）2SO4 0.5g/L ，MgSO4 0.02g/L，K2HPO40.2g/L，FeSO4·7H2O 0.05g/L，CaCl2 0.2g/L；甲醇0.5ml；含硝酸盐氮培养基为：KNO3 0.5g/L ，MgSO4 0.01g/L，K2HPO4 0.2g/L，FeSO4·7H2O0.05 g/L，CaCl2 0.2g/L，甲醇0.5ml，蒸馏水1L。
实施例26，以污水处理厂好氧池内活性污泥为样品进行筛选
（1）含氮废水对脱氮菌群进行摇瓶异养富集培养：
取污水处理厂好氧池内活性污泥样品，以5%的接种量接种到摇瓶富集培养基中，培养温度25℃；pH 8.0；转速 170rpm。富集2～3d后测定氨氮浓度，氨氮浓度降解率达到90%以上时，将富集液以5～10%的比例转接到新鲜富集培养液中，同时涂板观测富集液中活菌生长情况，当富集液中活菌数≥2×108以上终止摇瓶富集培养。富集阶段培养基为：（NH4）2SO4 1g/L、葡萄糖1g/L、KH2PO4 0.5 g/L、MgCl20.5g/L，Na2CO31 g/L。
（2）好氧曝气反应器中使富集的脱氮污泥快速增殖：
将富集液转移到好氧曝气装置，接种量10%，以甲醇作为碳源，以氯化铵作为氮源，氨氮质量浓度300mg/L，碳氮比由20:1逐渐调整到10:1，培养条件为：温度：25℃；pH：7.0～9.0；DO：0.5～4.0 mg/L。每日测定污泥浓度及活菌数，当污泥浓度≥3000mg/L，活菌数≥2×109时结束培养。
（3）用实际含氮废水在SBR反应器中进行异养脱氮菌群驯化培养：
将好氧曝气污泥转移到SBR反应器中，使用丙烯腈废水作为驯化底物，通过稀释，使氨氮初始浓度为100mg/L，逐渐增加至300mg/L，碳氮比为1:1。SBR反应器运行周期包括进水-曝气-沉淀-排水，整个运行周期为12h，进水1～2h，曝气6～10h，沉淀1～2h，排水0.5h，HRT（水力停留时间）20.6～36h。培养条件为：温度：20℃～35℃；pH：7.0～10.0；DO：0.5～4.0 mg/L。每日检测氨氮、硝态氮、亚硝氮浓度，在氨氮降解率达到90%以上，硝酸盐不断积累时终止培养。
（4）用A/O工艺及实际含氮废水在偏低溶解氧条件下对脱氮菌群进行驯化培养：
将SBR反应器中的污泥转入A/O工艺，使用焦化废水为底物进行驯化培养。焦化废水调节COD为1500～2100mg/L，氨氮100～300mg/L，总氮150～350 mg/L。A池控制溶解氧为0.5～1mg/L，O池溶解氧1～2mg/L，维持污泥回流比为2:1～8:1，培养温度：10℃～30℃，pH：6.0～10.0。在含氮化工废水中氨氮＜15mg/L，总氮≤25 mg/L ，COD ≤50mg/L 时结束反应。
（5）从A/O工艺驯化污泥中分离纯化脱氮细菌：
取A/O工艺驯化后的污泥，通过梯度稀释制得一系列污泥菌悬液，使用涂布法接种于筛选培养基平板中，将平板置于30℃恒温培养箱中培养，待菌落长出后选取生长好，有代表性的单菌落，使用接种环在分离培养基中划线反复分离纯化，筛选得到目标菌株。筛选培养基为：5%含氮化工废水，（NH4）2SO4 0.3g/L，KNO3 0.5g/L，MgSO4 0.01g/L，K2HPO4 0.1g/L，FeSO4·7H2O 0.05g/L， 2 %琼脂；分离纯化培养基为：牛肉膏3g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠3g/L，2%琼脂。
（6）纯化菌株的异养硝化好氧反硝化能力验证及菌株鉴定：
取分离纯化后的单菌株，接种于LB液体培养基（牛肉膏3g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠3g/L，蒸馏水1L）中，培养48h后离心收集菌体，将菌体按照湿重10%的量接种于含氨氮培养基和含硝酸盐氮培养基中，验证菌株的异养硝化好氧反硝化性能，对于能在同一反应器中去除氨氮且不产生硝酸盐积累以及能够进行好氧反硝化去除硝酸盐氮的菌株，进行形态学、生理生化初步鉴定，然后送专业测序公司进行16s rDNA测序鉴定。含氨氮培养基为：（NH4）2SO4 0.5g/L ，MgSO4 0.02g/L，K2HPO40.2g/L，FeSO4·7H2O 0.05g/L，CaCl2 0.2g/L；甲醇0.5ml；含硝酸盐氮培养基为：KNO3 0.5g/L ，MgSO4 0.01g/L，K2HPO4 0.2g/L，FeSO4·7H2O0.05 g/L，CaCl2 0.2g/L，甲醇0.5ml，蒸馏水1L。
实施例27，实际含氮污水样进行筛选：
（1）取实际含氮污水样（焦化废水、含氮农药废水、脂肪腈类废水等），以10%的接种量接种到摇瓶富集培养基中，培养温度25℃；pH 8.0；转速 170rpm。富集2～3d后测定氨氮浓度，氨氮浓度降解率达到90%以上时，将富集液以5～10%的比例转接到新鲜富集培养液中，同时涂板观测富集液中活菌生长情况，当富集液中活菌数≥2×108以上终止摇瓶富集培养。富集阶段培养基为：（NH4）2SO4 1g/L、葡萄糖1g/L、KH2PO4 0.5 g/L、MgCl20.5g/L，Na2CO31 g/L。
（2）好氧曝气反应器中使富集的脱氮污泥快速增殖：
将富集液转移到好氧曝气装置，接种量10%，以甲醇作为碳源，以氯化铵作为氮源，氨氮质量浓度300mg/L，碳氮比由20:1逐渐调整到10:1，培养条件为：温度：25℃；pH：7.0～9.0；DO：0.5～4.0 mg/L。每日测定污泥浓度及活菌数，当污泥浓度≥3000mg/L，活菌数≥2×109时结束培养。
（3）用实际含氮废水在SBR反应器中进行异养脱氮菌群驯化培养：
将好氧曝气污泥转移到SBR反应器中，使用丙烯腈废水作为驯化底物，通过稀释，使氨氮初始浓度为100mg/L，逐渐增加至300mg/L，碳氮比为1:1。SBR反应器运行周期包括进水-曝气-沉淀-排水，整个运行周期为12h，进水1～2h，曝气6～10h，沉淀1～2h，排水0.5h，HRT（水力停留时间）20.6～36h。培养条件为：温度：20℃～35℃；pH：7.0～10.0；DO：0.5～4.0 mg/L。每日检测氨氮、硝态氮、亚硝氮浓度，在氨氮降解率达到90%以上，硝酸盐不断积累时终止培养。
（4）用A/O工艺及实际含氮废水在偏低溶解氧条件下对脱氮菌群进行驯化培养：
将SBR反应器中的污泥转入A/O工艺，使用焦化废水为底物进行驯化培养。焦化废水调节COD为1500～2100mg/L，氨氮100～300mg/L，总氮150～350 mg/L。A池控制溶解氧为0.5～1mg/L，O池溶解氧1～2mg/L，维持污泥回流比为2:1～8:1，培养温度：10℃～30℃，pH：6.0～10.0。在含氮化工废水中氨氮＜15mg/L，总氮≤25 mg/L ，COD ≤50mg/L 时结束反应。
（5）从A/O工艺驯化污泥中分离纯化脱氮细菌：
取A/O工艺驯化后的污泥，通过梯度稀释制得一系列污泥菌悬液，使用涂布法接种于筛选培养基平板中，将平板置于30℃恒温培养箱中培养，待菌落长出后选取生长好，有代表性的单菌落，使用接种环在分离培养基中划线反复分离纯化，筛选得到目标菌株。筛选培养基为：5%含氮化工废水，（NH4）2SO4 0.3g/L，KNO3 0.5g/L，MgSO4 0.01g/L，K2HPO4 0.1g/L，FeSO4·7H2O 0.05g/L， 2 %琼脂；分离纯化培养基为：牛肉膏3g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠3g/L，2%琼脂。
（6）纯化菌株的异养硝化好氧反硝化能力验证及菌株鉴定：
取分离纯化后的单菌株，接种于LB液体培养基（牛肉膏3g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠3g/L，蒸馏水1L）中，培养48h后离心收集菌体，将菌体按照湿重10%的量接种于含氨氮培养基和含硝酸盐氮培养基中，验证菌株的异养硝化好氧反硝化性能，对于能在同一反应器中去除氨氮且不产生硝酸盐积累以及能够进行好氧反硝化去除硝酸盐氮的菌株，进行形态学、生理生化初步鉴定，然后送专业测序公司进行16s rDNA测序鉴定。含氨氮培养基为：（NH4）2SO4 0.5g/L ，MgSO4 0.02g/L，K2HPO40.2g/L，FeSO4·7H2O 0.05g/L，CaCl2 0.2g/L；甲醇0.5ml；含硝酸盐氮培养基为：KNO3 0.5g/L ，MgSO4 0.01g/L，K2HPO4 0.2g/L，FeSO4·7H2O0.05 g/L，CaCl2 0.2g/L，甲醇0.5ml，蒸馏水1L。

Claims (10)

1.一种异养硝化好氧反硝化细菌的驯化与筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将样品接种至含有含氮废水的富集营养液中对脱氮菌群进行摇瓶异养富集培养，得脱氮菌群的富集培养液；
（2）在好氧曝气反应器中用含氮废水使富集培养液的脱氮菌群快速增殖；
（3）用实际含氮废水在SBR反应器进行异养脱氮菌群驯化培养；
（4）用A/O工艺及实际含氮废水再对脱氮菌群进行驯化培养；
（5）从A/O工艺驯化污泥中分离纯化脱氮细菌；
（6）纯化菌株的异养硝化好氧反硝化能力验证；
（7）将异养硝化好氧反硝化能力强的菌株进行鉴定。
2.根据权利要求1 所述的方法，其特征在于，步骤（1）中：接种的样品是土壤样品、活性污泥、污水中的一种或多种；每升富集营养液的组成为：（NH4）2SO40.5～1g/L，葡萄糖0.5～1g/L，KH2PO4或K2HPO40.5～5.0 g/L，MgCl20.5～5.0 g/L，Na2CO30.5～5.0 g/L，含氮废水40～60mL，其余为蒸馏水；摇瓶异养富集培养的条件为：温度：10℃～35℃，pH：6.0～10.0，转速：150rpm～220rpm；摇瓶富集培养过程中，氮降解达到90%以上时，将富集培养液以5～10%体积转接到新鲜的富集营养液中，活菌数≥2×109终止培养。
3.根据权利要求1 所述的方法，其特征在于：步骤（2）快速增殖中，以葡萄糖、甲醇或苯酚中的一种或多种作为碳源，以硫酸铵、氯化铵或尿素中的一种或多种作为氮源，氨氮质量浓度300～600mg/L，碳氮比20:1～10:1，培养条件为：温度：10℃～35℃；pH：6.0～10.0；DO：0.5～4.0 mg/L。
4.根据权利要求1或3所述的方法，其特征在于：步骤（2）快速增殖中，好氧曝气培养污泥浓度≥3000mg/L，活菌数为≥2×109时结束培养。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（3）中SBR反应器运行周期包括进水、曝气、沉淀和排水，水力停留时间20～40h；调节氨氮初始浓度100～200mg/L，逐渐增加至200～400mg/L，维持碳氮比1:1～0.5:1，培养条件为：温度：10℃～35℃；pH：6.0～10.0；DO：0.5～4.0 mg/L。
6.根据权利要求1或5所述的方法，其特征在于：步骤（3）在含氮废水中氨氮降解率90%以上，硝酸盐开始积累时终止反应。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（4）所述A/O工艺，A池控制溶解氧为0.5～1mg/L，O池溶解氧1～2mg/L，维持污泥回流比为2:1～8:1，培养温度：10℃～35℃，pH：6.0～10.0；实际含氮废水COD为1500～2100mg/L，氨氮100～300mg/L，总氮350～450 mg/L。
8.根据权利要求1或7所述的方法，其特征在于：步骤（4）在氨氮＜15mg/L，总氮≤25mg/L ，COD ≤50mg/L时结束反应。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（5）所用的筛选培养基为：5%含氮废水，（NH4）2SO4 0.15～1.5 g/L，KNO3 0.2～1.2 g/L，MgSO4 0.01～0.02 g/L，K2HPO4 0.1～0.3 g/L，FeSO4·7H2O 0.05～0.1 g/L，1.5～2.5%琼脂，其余为水；分离纯化培养基为：牛肉膏3～5g/L，蛋白胨6～12g/L，氯化钠3～6g/L，蒸馏水1L，1.5～2.5%琼脂。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（6）中, 异养硝化好氧反硝化能力验证采用含氨氮和含硝酸盐氮两种培养基：含氨氮培养基：（NH4）2SO4 0.15～1.5g/L ，MgSO4 0.01～0.02g/L，K2HPO4 0.1～0.3g/L，FeSO4·7H2O 0.05～0.1 g/L，CaCl2 0. 1～0.5g/L，甲醇0.1～1.0mL，蒸馏水1L；含硝酸盐氮培养基：KNO3 0.2～1.2g/L ，MgSO4 0.01～0.02g/L，K2HPO4 0.1～0.3g/L，FeSO4·7H2O 0.05～0.1 g/L，CaCl2 0. 1～0.5g/L，甲醇0.1～1.0mL，蒸馏水1L。
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