CN108949611A - 一株戴尔福特dnf-02及其在废水脱氮中的应用 - Google Patents

一株戴尔福特dnf-02及其在废水脱氮中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于微生物脱氮技术领域，具体公开了一株戴尔福特菌DNF‑02及其在废水脱氮中的应用，所述菌株于2018年4月19日保藏于广东省微生物菌株保藏中心（GDMCC），保藏编号为GDMCC No：60362。该菌株是一株异养硝化‑好氧反硝化菌，使硝化和反硝化同时进行成为可能，在污水处理方面具有极大的应用价值。

Description

一株戴尔福特DNF-02及其在废水脱氮中的应用
技术领域
本发明涉及微生物脱氮技术领域，具体地，涉及一株戴尔福特DNF-02菌株及其在废水脱氮中的应用。
背景技术
随着经济的快速发展，水体中氮素污染呈现逐渐加重趋势。生物脱氮技术因其简单高效且成本低廉日益受到人们关注。在脱氮菌中异养硝化-好氧反硝化菌由于可在同一个空间内进行硝化和反硝化，成为一个研究热点。异养硝化菌在有氧环境下降解有机底物的同时可将氨氮降解，这打破了传统反硝化作用只能在厌氧条件下进行的观点，好氧反硝化使得同步脱氮体系的构建成为可能。近年来，国内外对异养硝化-好氧反硝化菌的研究取得了一定成果，能够异养硝化-好氧反硝化的菌属有人苍白杆菌属(Ochrobactrum anthropi)、粪产菌属(Alcaligenes faecalis)、假单胞菌属(Pseudomonas)、泛养硫球菌属(Thiosphaera pantotropha)、芽孢杆菌属(Bacillus)、不动杆菌属(Acinetobacter)、雷氏普罗威登斯菌(Providencia rettgeri)和嗜吡啶红球菌属(Rhodococcus pyridinivorans)等。与自养硝化菌和厌氧反硝化菌相比，异养硝化-好氧反硝化菌具有世代周期短、生长迅速、可耐受低溶解氧和高有机负荷、对环境的适应能力强的特点，使其在污水处理方面很有前景。
发明内容
本发明为了丰富异养硝化-好氧反硝化菌株资源库，提供一株戴尔福特DNF-02，该菌株是一株异养硝化-好氧反硝化菌，使硝化和反硝化反应能在有氧环境下同时进行成为可能，在含氮污水处理方面具有极大的应用前景。
本发明的另一个目的是提供一株戴尔福特DNF-02在废水脱氮中的应用。
为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：
一株戴尔福特(Delftia)DNF-02菌株，所述菌株于2018年4月19日保藏于广东省微生物菌株保藏中心（GDMCC），保藏编号为GDMCC No：60362，分类命名为Delftiasp，保藏地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
本发明的Delftia菌株是一株异养硝化-好氧反硝化菌，该菌株以柠檬酸钠为碳源，对水体中的氨氮、硝态氮、COD进行好氧降解，且在脱氮的过程中几乎不积累亚硝态氮，避免了二次污染，本发明要求保护戴尔福特DNF-02菌株在废水脱氮中的应用。本发明更进一步保护戴尔福特DNF-02菌株在同步去除废水中氨氮和COD的应用。
一种废水脱氮的方法，包括如下步骤：将戴尔福特DNF-02菌株按照5～10%的接种量接种到废水中，在25～35℃、100～180r/min的条件下处理废水24～72h；所述戴尔福特菌DNF-02菌株于2018年4月19日保藏于广东省微生物菌株保藏中心（GDMCC），保藏编号为GDMCC No：60104，分类命名为Delftiasp.DNF-02，保藏地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
优选地，将戴尔福特DNF-02菌株按照2%的接种量接种到废水中。
优选地，在30℃、150r/min的条件下处理废水48h。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供的戴尔福特DNF-02菌株可有效去除生活污水中的含氮物质，24h内对氨氮、硝态氮的去除率分别为92.8%、88.0%。该生物脱氮方法属于新型生物脱氮技术领域，不仅能在同一体系中同时去除氨氮、硝态氮，而且去除氨氮过程中没有硝态氮的生成，在实际应用中具有很好的应用前景。
附图说明
图1为异养硝化和好氧反硝化菌培养生长七天的形态特征。
图2为DNF-02菌株的电镜扫描照片。
图3为本发明菌株16S rDNA的系统发育树。
图4为异养硝化-好氧反硝化菌的异养硝化生长和脱氮效率。
图5为异养硝化-好氧反硝化菌的好氧反硝化生长和脱氮效率。
图6为异养硝化-好氧反硝化菌的亚硝态氮利用特性。
图7为异养硝化-好氧反硝化菌强化反应器脱氮的实验。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例中用到的培养基配方如下：
LB培养基：牛肉膏3g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，水1000 mL，pH 7.4～7.6。
异养硝化培养基：(NH4)2SO4 1g/L，柠檬酸三钠 5.20g/L，Na2HPO4 0.5 g/L，KH2PO40.5 g/L，MgSO4•7H2O 0.2 g/L，NaCl 30 g/L，微量元素2 mL，pH 7.0～7.5。
好氧反硝化培养基：KNO3 3 g/L，柠檬酸三钠5.52 g/L，Na2HPO4 2.0 g/L，KH2PO41.0 g/L，MgSO4•7H2O 0.1 g/L，微量元素2.00 mL，pH 7.0～7.3。
微量元素溶液：EDTA 50 g/L，ZnSO4 2.2 g/L;，CaCl2 5.5g/L，MnCl2•4H2O 5.06g/L，FeSO4•7H2O 5.0g/L，(NH4)6Mo7O2•4H2O 1.1g/L，CuSO4•5H2O 1.57g/L，CoCl2•6H2O 1.61g/L，pH值 6.0。
亚硝态氮培养基：KNO2 1.22 g/L，柠檬酸钠 6.50 g/L，维氏盐溶液5.0%，pH值7.2～7.6。
实施例1
异养硝化-好氧反硝化菌株的筛选，具体步骤如下：
1. 驯化和富集：实验污泥来自广州大坦沙污水处理厂好氧段活性污泥，取充分混合的活性污泥10g分别置于装有200mL硝化培养液和反硝化培养液的500 mL锥形瓶中，放置于摇床中，设置温度为30℃，转速为150r/min，驯化以20d为一周期。每周期结束后将瓶中培养液静置片刻，倒掉上清液，再重新加入新鲜培养液各250 mL进行驯化。期间检测氨氮和硝态氮的去除情况。
2. 分离纯化：用无菌水将1mL的驯化液梯度稀释至10-1、10-3、10-5 10-7，然后分别涂布在异养硝化和好氧反硝化培养基平板上，置于生化培养箱中30℃培养3 d，从中挑选形态各异的单菌落，用平板划线法分别在异养硝化和好氧反硝化固体培养基上划线，然后在同一条件下培养3d。然后再挑选单菌落进行重复划线，直到获得纯菌株。
3. 菌株筛选：将纯化后的菌株接种至灭菌后的LB培养基中，置于摇床中在30℃、120 r/min的条件下培养24h，在4000 r/min条件下离心2min，收集菌体，用无菌水重悬菌体并定容至1g/L。然后按10%的接种量分别接种于装有适量异养硝化和好氧反硝化培养液的锥形瓶中，置于30℃、120 r/min摇床培养，实验设3个平行，同时设置未接菌的对照组，分别于12 h、24 h、36 h、48 h、60 h和72 h测定培养液中NH4 +-N和NO3 --N的含量。从中分别选出具有硝化和反硝化功能的菌株。
4. 同时硝化反硝化能力的测定：将分别具有异养硝化和好氧反硝化功能的菌株接种至灭菌后的LB培养基中，在30℃、120 r/min条件下摇床培养24h后，于4000 r/min离心2 min收集菌体，用无菌水重悬菌体并定容至1g/L，按10%的接种量分别接种至装有适量好氧反硝化和异养硝化培养液的锥形瓶中，置于30℃、120 r/min下摇床培养，实验设3个平行，每隔12h取上清液测NO3 --N和NH4 +-N的含量。
经过上述筛选分离后得到一株异养硝化-好氧反硝化菌株DNF-02，该菌株经生理生化测试为革兰氏阴性，不产芽孢，氧化酶试验阳性、接触酶试验阳性。SEM扫描发现，DNF-02菌体为细杆状，大小为0.7um×1.3um（见图2）。DNF-02菌株的16S rDNA序列如SEQ ID NO：1所示。将该序列输入Genbank，经Blast比对分析，结果表明该菌与DelftiaTrurnhatensisMyss86的16S rDNA序列相似性较高，为99%（见图3）。
经上述16S rDNA测序及生理生化实验确定DNF-02菌株为戴尔福特(Delftia)DNF-02菌株，所述菌株于2018年4月19日保藏于广东省微生物菌株保藏中心（GDMCC），保藏编号为GDMCC No：60362，分类命名为Delftiasp.DNF-02，保藏地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
实施例2
实施例1所述戴尔福特菌DNF-02菌株的生长和脱氮特性：
1.将DNF-02菌株扩大培养后，用无菌水重悬菌体（定容至1g/L），然后按10% 的接种量接种于含100mL上述异养硝化培养基的250mL三角瓶中，充分摇匀，30℃、120r/min摇床培养72h，分别定期取样测定上清液中NH4 +-N、NH2OH、NO3 --N、NO2 --N、COD、TN和OD600值，NO3 --N、NO2 --N、NH2OH、TN、COD和OD600值和NO2 --N、NO3 --N、NH2OH、TN、COD和OD600值。
结果见图4，根据图4的结果显示，菌株以氨氮为唯一氮源时，DNF-02菌株在经过12h的生长后进入对数期，NH4 +-N浓度下降明显，NH4 +-N去除率在24 h达到最大值，整个培养过程中有少量NO2 --N的积累，并在48 h时几乎全部去除。
2. 将DNF-02菌株扩大培养后，用无菌水重悬菌体（定容至1g/L），然后按2%的接种量接种于含100mL上述好氧反硝化培养基的250mL三角瓶中，充分摇匀，30℃、120r/min摇床培养72h，分别定期取样测定上清液中NO3 --N、NO2 --N、NH2OH、TN、COD和OD600值。
结果见图5，根据图5结果显示，菌株以硝态氮为唯一氮源时，培养至24 h时硝态氮降解88%。菌株在12 h进入对数生长期，硝态氮浓度迅速下降，在24 h硝态氮去除率达到最大值。在整个反硝化过程中，硝态氮的去除较快，且产生的亚硝态氮转化为羟胺的速率也较快，期间亚硝态的积累较小。
3. 将DNF-02菌株扩大培养后，用无菌水重悬菌体（定容至1g/L），然后按10%的接种量接种于含100mL的亚硝态氮培养基的250mL三角瓶中，充分摇匀，30℃、120r/min摇床培养72h，分别定期取样测定上清液中NO2 --N、NO3 --N、NH2OH、TN、COD和OD600值。
结果见图6，根据图6结果显示，菌株以亚硝态氮为唯一氮源时，经过适应期后，亚硝态氮在12 h内开始显著下降，菌株在24 h去除率为84.85%、。菌株DNF-02不仅能够降解亚硝态氮，还可以利用亚硝态氮作为氮源进行生长。伴随着亚硝态氮的降解，细菌生长密度OD600在48 h 达到峰值。
实施例3 实施例1所述的DNF-02菌株强化脱氮的应用
实验进水水质指标见下表1。
表1
水质指标 NH4 +-N NO3 --N NO2 --N COD pH
范围 80～100mg/L 50～60mg/L 50～60mg/L 800～1000mg/L 7.2～7.5
实验运行条件：将1 L新鲜活性污泥接种于反应器中，试验过程中按照SBR反应器运行条件进行进水-反应-停滞-出水，每周期设定24 h，其中进水时间为10 min，且进水时同时曝气，反应时间为23 h 10 min，沉淀时间为30 min，出水时间为10 min，期间控制进水流量为1 L/d，空气从底部经曝气头扩散进入反应体系中，用空气流量计调节进气量为4.0 L/min，加热棒控制体系温度为30℃左右，以只含氨氮的水质作为进水水质，每周期定期检测进出水的NH4 +-N、TN和COD指标。待反应器系统稳定时加入目标菌DNF-02，并以24 h为周期进行进出水运行反应，进水采用含硝态氮的水质，每周期检测进出水的NH4 +-N、NO3 --N、NO2 --N、TN和COD指标。
根据图7图结果显示，前15 d内，反应器的硝化效率没有太大波动，而在15～25 d内反应器对氨氮和COD的去除率呈现上升趋势。35～40 d内，反应器的出水浓度趋于平稳，氨氮、总氮、COD的平均去除率分别为93.9%、88.9%、84.1%。本研究将菌株DNF-02添加到具有高浓度氮和有机物基质中，确保了接种细菌在处理过程中能够大量存活。通过长期观察反应器出水水质，添加菌株DNF-02对污泥系统的脱氮能力有较大提升，表明菌株DNF-02在高氨废水处理中具有较大的应用潜能。
序列表
<110> 暨南大学
<120> 一株戴尔福特DNF-02及其在废水脱氮中的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1230
<212> DNA
<213> 戴尔福特(Delftia)
<400> 1
cagtcgagcg gatgaaggga gcttgctccc tgatttagcg gcggacgggt gagtaatgcc 60
taggaatctg cctggtagtg ggggataacg ttccgaaagg aacgctaata ccgcgtacgt 120
cctcaccagt ggcgaaggcg accacctgga ctgatactga cacggggagc aaacaggatt 180
agataccctg gtagtccacg ccgtaaacga tgtcaactag ccgttggaat ccttgagatt 240
ttagtggcgc agctaacgca ttaagttgac cgcctgggga gtacggccgc aaggttaaaa 300
ctcaaatgaa ttgaacggga gaaagcaggg gaccttcggg ccttgcgcta tcagatgagc 360
ctaggtcgga ttagctagtt ggtgaggtaa tggctcacca aggcgagcag ccgcggtaat 420
acgaagggtg caagcgttaa tcggaattac tgggcgtaaa gcgcgcgtag gtggttcgtt 480
aagttggatg tgaaagcccc gggctcaacc tgggaactgc atccaaaact ggcgagctag 540
agtacggtag agggtggtgg aatttcctgt gtagcggtga aatgcgtaga tataggaagg 600
aacgggggcc cgcacaagcg gtggagcatg tggtttaatt cgaagcaacg cgaagaacct 660
tacctggcct tgacatgctg agaactttcc agagatggat tggtgccttc gggagctcag 720
acacaggtgc tgcatggctg tcgtcagctc gtgtcgtgag atgttgggtt aagtcccgtc 780
gatccgtaac tggtctgaga ggatgatcag tcacactgga actgagacac ggtccagact 840
cctacgggag gcagcagtgg ggaatattgg acaatgcacc ggctaacttc gtgccaaacg 900
agcgcaaccc ttgtccttag ttaccagcac ctcgggtggg cactctaagg agactgccgg 960
tgacaaaccg gaggaaggtg gggatgacgt caagtcatca tggcccttac ggccagggct 1020
acacacgtgc tacaatggtc ggtacaaagg gttgccaagc cgcgaggtgg agctaatccc 1080
ataaaaccga tcgtagtccg gatcgcagtc tgcaactcga ctgcgtgaag tcggaatcgc 1140
tagtaatcgt gaatcagaat gtcacggtga atacgttccc gggccttgta cacaccgccc 1200
gtcacaccat gggagtgggt aaatttgtga 1230

Claims (6)

1.一株戴尔福特菌(Delftia)DNF-02菌株，其特征在于，所述菌株于2018年4月19日保藏于广东省微生物菌株保藏中心（GDMCC），保藏编号为GDMCC No：60632。
2.权利要求1所述的戴尔福特DNF-02菌株在废水脱氮中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述戴尔福特DNF-02能同步去除废水中氨氮和COD。
4.一种废水脱氮的方法，其特征在于，包括如下步骤：将权利要求1所述的戴尔福特DNF-02菌株按照1～5%的接种量接种到含氨氮废水中，在25～35℃、100～150r/min的条件下处理废水24～72h。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，将权利要求1所述的戴尔福特DNF-02按照2%的接种量接种到含氨氮的废水中。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在30℃、120r/min的条件下处理废水48h。
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