CN108330081A - 一株异养硝化-好氧反硝化细菌及其应用 - Google Patents

一株异养硝化-好氧反硝化细菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种高效的异养硝化‑好氧反硝化细菌及其筛选方法和用途。筛选方法的过程包括：(1)用含氨的富集培养液对土壤的菌悬液进行富集培养；(2)在固体的富集培养皿上进行涂布和分离纯化；(3)从富集的异养菌群中分离纯化异养硝化细菌；(4)再从中筛选出具有反硝化作用的菌群，进行分离纯化；(5)用含氨的污水对纯化的菌体进行脱氮能力测定。本发明筛选到的异养硝化‑好氧反硝化细菌不仅可以快速有效脱除水体中的氨氮、亚硝酸氮、硝酸氮及其混合物，还可同时去除有机废水中的COD，应用于有机含氮废水的处理，且在脱氮过程中，无亚硝酸盐和硝酸盐的积累，使用该菌株处理废水工艺简单，脱氮效果稳定。

Description

一株异养硝化-好氧反硝化细菌及其应用
技术领域
本发明涉及微生物领域。具体涉及一种既具有硝化生物学活性又具有反硝化能力的高效脱氮细菌，及其筛选方法和用途。
背景技术
氮循环是水生和陆地生态系统的重要生物地球化学循环。近年来，氮素污染所造成的危害主要有水体富营养化，不断导致水质恶化，威胁人类和水生动物的健康，氮污染的去除在污水处理中越来越重要。
废水脱氮的主要技术有药剂氧化法，离子交换法，化学沉淀法，催化湿式氧化法，膜分离技术等物理化学法和生物脱氮法。目前，因生物脱氮工艺高效率和低成本的优点而广泛用于除氮和其他污染物被广泛用于各种含氮源的污水处理。
传统生物脱氮工艺如图1所示，通常包括自养硝化和异养反硝化两个阶段，第一阶段其在有氧条件下通过氨氧化细菌将氨态氮氧化为亚硝酸盐，硝化细菌将亚硝酸铵氧化成硝酸盐；第二阶段通过在厌氧条件下反硝化细菌将亚硝酸盐和硝酸盐转化为N2气体。整个过程中参与反应的酶包括氨单加氧酶(AMO)，羟胺氧化酶(HAO)，周质硝酸还原酶(NAP)，亚硝酸盐还原酶(NIR)，一氧化氮还原酶(NOR)和一氧化二氮还原酶(NOS)等。在这整个反应过程中不仅耗时，而且有低硝化率和分离好氧和缺氧区的污水处理系统的复杂性，此外，自养硝化菌在这个系统中很容易受到高浓度有机物和氨氮的影响，从而使降解效率下降。
附图说明
图1为传统生物脱氮工艺
近年来，陆续从土壤、深海火山口、污泥、湖水等地分离出了多种同时具有异养硝化和好氧反硝化作用的微生物，这是一类具有重要应用价值的微生物资源。Shoda等从污废水中分离出的A.Faecalis No.4，被证明同时具有异养硝化和好氧反硝化的作用，可高效去除了废水中的高浓度氨氮和化学需氧量(Shoda and Ishikawa 2014)；Ge等从焦化废水池分离出的离株Diaphorobacter sp.PD-7，具有异养硝化-好氧反硝化高效降解苯酚的特点(Ge et al.2015)； He等发现假单胞杆菌Y-11具有异养硝化和好氧反硝化作用，对铵和硝酸盐或亚硝酸盐氮有较高的去除能力(He et al.2016)；Zhao等的研究表明产碱杆菌HN是在好氧条件下去除污废水中氨氮的异养硝化细菌(Zhao et al.2013)，该类菌可以利用多种基质，包括无机氮和有机氮，且其生长速率快，细胞产量高，对溶解氧要求低，环境适应能力强，在环境中的数量远大于自养菌。异养硝化-好氧反硝化菌的发现解决了传统生物脱氮处理启动时间长，稳定性差，硝化环节条件要求苛刻，硝化和反硝化不能同步进行等缺点，有望克服传统处理工艺在处理效率与经济使用两方面的矛盾，具有良好的发展前景。但就目前研究情况而言，异养硝化好氧反硝化菌种较少，且处理废水效果不佳，因此扩增异养硝化好氧反硝化菌属，提高其处理废水效能，增强其实用性，成为迫切需要。
发明内容
1.针对以上问题和不足，本发明的目的在于提供一株具有异养硝化一好氧反硝化活性的细菌；另一个目的是提供该菌株从城市污水处理厂的活性污泥中筛选的培养方法和使用方法，使该菌株不仅可快速将氨氮去除，而且可在亚硝酸盐或硝酸盐为唯一氮源条件下生长，并将亚硝酸盐或硝酸盐中的氮有效去除。该菌株以柠檬酸钠为碳源，对水体中的氨氮、硝态氮、 COD进行好氧降解，且在脱氮过程中几乎不积累亚硝态氮，避免了二次污染。本发明提供该菌在水体生物脱氮中的应用，使用本发明提供的细菌可有效地脱除水体中的氨氮、亚硝酸盐氮和硝酸盐氮。
2.本发明所提供的新假单胞菌Pseudomonas sp.TJPU04菌株及其以及应用与现有技术相比较有如下有益效果：
(1)本发明所提供的新假单胞菌Pseudomonas sp.TJPU04能分别利用氨氮、亚硝酸盐、硝酸盐为唯一氮源生长，可以在好氧条件下实现氨氮、亚硝酸盐以及硝酸盐店的同步去除，且去除效率高，解决了传统废水处理中生物脱氮需要采取好氧硝化，缺氧反硝化分段处理的瓶颈问题，硝化和反硝化偶联进行，反硝化过程中产生的碱度可以很好地弥补硝化过程中产生的酸度，整个过程无需加碱调节pH，相比自养硝化，异养硝化细菌的生长速率快，细胞产率高，可以有效解决自养硝化细菌增殖缓慢、系统水力停留时间长的问题；
(2)采用本发明，可以完成碳氮生物同步去除，无需构建新的反应器，最大限度的简化了工艺流程，节省了设备和投资的成本，具有较好的经济效益和环保效益。
具体实施方式
下面结合实验例对本发明作出进一步的详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1，实施例中用到的培养基配方如下：
(1)富集培养基：(NH4)2SO4 0.5g，柠檬酸钠3.94g，K2HPO4·3H2O 6.5g，MgSO4·7H2O2.5 g，NaCl 2.5g，FeSO4·7H2O 0.05g，MnSO4·H2O 0.04g；
(2)牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3.00g/L，蛋白胨1.00g/L，NaCl 5.00g/L，pH调至7.0～7.2.若配制固体培养基则添加琼脂15.00～20.00g/L；
(3)异养硝化培养液为：(NH4)2SO4 0.24g，柠檬酸钠3.94g，K2HPO4·3H2O 6.5g，MgSO4·7H2O 2.5g，NaCl 2.5g，FeSO4.7H2O 0.05g，MnSO4·H2O 0.04g；
(4)BTB培养基：NaNO3 4.2g，L-天冬酰胺1g，0.1％百里酚蓝5m L/L，柠檬酸钠8.5g， KH2PO4·3H2O 1g，MgSO4·7H2O 1g，CaCl2 0.2g，FeCl3·6H2O 0.05g，pH 7.0-7.3；
(5)LB培养基：蛋白胨10.00g/L，酵母膏5.00g/L，NaCl 5.00g/L，pH调至7.0；
(6)好氧反硝化培养基：NaNO3 0.36g，Na2HPO4·7H2O 7.9g，K2HPO4.3H2O 1.5g，MgSO4.7H2O 0.1g，柠檬酸钠5.1g，微量元素溶液2mL/L，pH 7.0-7.5。
实施例2，异养硝化-好氧反硝化菌株的筛选，具体步骤如下：
(1)驯化富集
从城市污水处理厂的第一曝气池中采集活性污泥：取5g活性污泥并入装有50mL富集培养基的100mL三角瓶中，在30℃，150rpm摇床培养，锥形瓶中放入2～4颗玻璃珠，以便于打散泥样。隔段时间取上清液用显微镜观察，若存在活的微生物，则按5％的接种量，取上清液接种于新鲜培养基中进行5代培养，每代2天，共培养10天；
(2)分离纯化
取1mL富集培养5代后的菌液，用无菌水按体积比梯度稀释后涂布于牛肉膏蛋白胨平板上，于30℃培养箱中培养，待平板长出单菌落后，挑取不同形态的单菌进一步多次划线纯化，以获得纯种菌株；
(3)菌株的检测及筛选
用接种环挑取纯化后的菌株接种到100mL无菌异养硝化培养基中，30℃振荡培养，每 2天取2mL培养液至于干净的小试管中，滴加2滴格林斯试剂，以确定菌株是否具有硝化活性，同时以灭过菌的不接种菌株的空白异养硝化培养基作对照。若检测发现试管中有红色或褐色，说明有亚硝态氮，即菌株有硝化作用，2min～3min后在未显色的试管中加入少量锌粉，静置，观察颜色变化，若出现红色则说明有硝态氮的积累，即菌株也有硝化作用，初步确认筛选出的菌株为异养硝化菌株；将异养硝化菌活化后用无菌水制成菌悬液，涂布于BTB固体培养基上，30℃恒温培养24h，能使BTB培养基由黄绿色变为蓝色的菌株，即有好氧反硝化活性的菌株；
(4)菌株的复筛及保藏
用异养硝化培养基及好氧反硝化培养基对异养硝化-好氧反硝化初筛菌进行复筛。将初筛得到的菌株接入LB培养基中活化培养至对数期后，将适量对数期的菌液4000rpm离心10 min，去除上清液用无菌水重悬，洗涤离心，重复操作2～3次。接种5％菌悬液(OD600＝0.667) 至100mL异养硝化液体培养基中和好氧反硝化培养基中，30℃，150rpm摇床培养24h，挑取氨氮和硝态氮降解最多的样品进一步稀释并多次分离纯化，得到异养硝化-好氧反硝化复筛菌，采用异养硝化培养基对该菌株进行菌种保藏。
(5)菌株的鉴定
挑取菌株的单菌落到LB液体培养基中培养至对数期，取700μL培养液提取基因组DNA，经PCR扩增后，利用胶回收试剂盒回收纯化PCR产物，之后进行克隆、转化，筛选阳性克隆子菌落，经扩大培养后进行测序，测序结果位测得长度为1435bp的16srDNA序列，通过将该序列在NCBI Genebank数据库中进行比对并构建系统发育树发现，该菌株为新假单胞菌Pseudomonas sp，命名为Pseudomonas sp.TJPU04。鉴定结果如说明书附图2所示，图中Query 为待鉴定菌株。
实施例3，菌株同时硝化反硝化能力的测定
将分别具有异养硝化和好氧反硝化功能的菌株接种至灭菌后的LB培养基中，在30℃、 120rpm条件下摇床培养24h后，于4000rpm离心2min收集菌体，用无菌水重悬菌体并定容至1g/L，按10％的接种量分别接种至装有适量好氧反硝化和异养硝化培养液的锥形瓶中，置于30℃、120rpmn下摇床培养，实验设3个平行，每隔12h取上清液测NO3-N和NH4 +-N的含量，从而测定同时硝化和反硝化的能力。鉴定结果如说明书附图3、图4所示，图3由格林斯鉴定硝化作用，当菌液由无色变为红色时，证明该菌株具有异养硝化作用，图4由BTB 鉴定反硝化作用，当菌株接种在培养皿上，逐渐从黄色变成蓝绿色时，证明该菌株具有好氧反硝化作用。
实施例4，菌株脱氮效能测定的具体步骤如下：
将新假单胞菌Pseudomonas sp.TJPU04按照常规方法活化，富集培养。富集培养完成后移取10mL悬浊液至含有100mL异养硝化培养基的250mL锥形瓶中，在30℃，120rpm条件下培养72h，每隔2h取培养液，8000rpm离心10min，取上清液，测定对应的氨氮、硝态氮、亚硝态氮、pH、OD600的含量。测定结果如说明书附图5a、5b所示，图中可看出菌株先快速生长，再缓慢生长后趋于稳定，同时pH变化幅度较大，间接说明有反应进行，此过程中氨氮快速降解，脱氮率高达99.8％，同时硝酸氮逐渐生成，此过程中没有检测到亚硝酸氮的含量。
将菌株再次接种于100mL好氧反硝化培养基的250mL锥形瓶中，在30℃，120rpm条件下培养72h，每隔2h取培养液，8000rpm离心10min，取上清液，测定对应的氨氮、硝态氮、亚硝态氮、COD、OD600及TN的含量。测定结果如说明书附图5c、5d所示，图中可看出菌株生长情况和pH变化趋势基本一致，均为先缓慢增加，再快速指数增加，最后趋于稳定；此过程中硝酸氮快速降解，去除率高达96％，同时有少量亚硝酸氮的生成，总氮去除率高达96％，菌株的高效脱氮率在水处理应用中有较高的潜在应用价值。
附图说明
图2为通过NCBI blast功能对菌株进行的系统分类结果。
图3为通过格林斯试剂鉴定菌株硝化作用结果图。当菌液由无色变为红色时，证明 该菌株具有异养硝化作用。
图4为由BTB鉴定菌株的反硝化作用结果图。当菌株接种在培养皿上，逐渐从黄色 变成蓝绿色时，证明该菌株具有好氧反硝化作用。
图5为菌株脱氮效果图。

Claims (9)

1.一株异养硝化-好氧反硝化细菌，该细菌为新假单胞菌Pseudomonas sp。
2.根据权利要求1所述的细菌，其富集方法的特征在于，富集培养基在30℃，150rpm摇床培养，培养5代，每代2天。
3.根据权利要求1所述的细菌，其分离方法的特征在于，菌液涂布于牛肉膏蛋白胨平板上，于30℃中培养。
4.根据权利要求1所述的细菌，其筛选方法的特征在于，将菌株接种到异养硝化培养基中，30℃振荡培养，用格林斯试剂检测，以确定菌株是否具有硝化活性；再将菌株涂布于BTB固体培养基上，30℃恒温培养24h。
5.根据权利要求1所述的细菌，其复筛方法的特征在于，将菌株接入LB培养基、异养硝化液体培养基中和好氧反硝化培养基中，30℃，150rpm摇床培养24h。
6.根据权利要求2所述的菌株富集方法，其特征在于，所述的富集培养液以硫酸铵为氮源，柠檬酸钠为碳源；所述的富集培养液为(NH4)2SO40.5g，柠檬酸钠3.94g，K2HPO4·3H2O6.5g，MgSO4·7H2O 2.5g，NaCl 2.5g，FeSO4·7H2O 0.05g，MnSO4·H2O 0.04g。
7.根据权利要求4所述的菌株培养方法，其特征在于，所述的异养硝化培养液以硫酸铵为氮源，柠檬酸钠为碳源；所述的异养硝化培养液为(NH4)2SO40.24g，柠檬酸钠3.94g，K2HPO4·3H2O 6.5g，MgSO4·7H2O 2.5g，NaCl 2.5g，FeSO4·7H2O 0.05g，MnSO4·H2O 0.04g。
8.根据权利要求4所述的菌株筛选方法，其特征在于，所述的BTB培养基以NaNO3为氮源；所述的BTB培养基为NaNO34.2g，L-天冬酰胺1g，0.1％百里酚蓝5mL/L，柠檬酸钠8.5g，KH2PO4·3H2O 1g，MgSO4·7H2O 1g，CaCl20.2g，FeCl3·6H2O 0.05g，pH 7.0-7.3。
9.根据权利要求5所述的菌株复筛方法，其特征在于，所述的好氧反硝化培养液以NaNO3为氮源；所述的好氧反硝化培养基为NaNO30.36g，Na2HPO4·7H2O 7.9g，K2HPO4·3H2O 1.5g，MgSO4·7H2O 0.1g，柠檬酸钠5.1g，微量元素溶液2mL/L，pH 7.0-7.5。
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