CN107354108A - 一种降解含磷的复合型菌菌剂的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种降解含磷的复合型菌菌剂的制备方法，属于降磷菌剂制备领域。该方法以普通活性污泥为基质，进行活性污泥菌种的培养，并在菌种培养过程中以培养基的方式添加以蛋白酶、脂肪酶和纤维素为主的活性生物酶，使活性生物酶与活性微生物进行结合和反应，并在活性微生物菌种和活性酶的活性培养到最优的时候，附以保鲜化学药剂对这种活性菌种进行分离固化，使其活性封存。该分离和固化过程不会破坏活性微生物和活性酶的机构和活性，在活性微生物和活性酶的菌种重新在水中溶解释放时，其活性会迅速恢复，并且会快速结合到其他活性微生物内进行生长和繁衍。已到达缩短活性污泥生物处理初期调试的时间，并快速的提供脱氮除磷的效果。

Description

一种降解含磷的复合型菌菌剂的制备方法

技术领域

本发明涉及菌剂制备领域，具体涉及一种降解含磷的复合型菌菌剂的制备方法。

背景技术

活性污泥法是以活性污泥为主体的废水生物处理的主要方法。活性污泥法及其衍生改良工艺是处理城市污水最广泛使用的方法。活性污泥法是向废水中连续通入空气，经一定时间后因好氧性微生物繁殖而形成的污泥状絮凝物。它能从污水中去除溶解性的和胶体状态的可生化有机物以及能被活性污泥吸附的悬浮固体和其他一些物质，同时也能去除一部分磷素和氮素。

活性污泥生物处理过程中，有机氮通过微生物的分解和水解转化成氨氮，即氨化作用；通过硝化反应将氨氮转化为亚硝态氮、硝态氮，再通过反硝化反应将硝态氮、亚硝态氮还原成气态氮逸出，达到脱氮目的。

活性污泥生物处理过程中的除磷时生物除磷，其原理利用好氧微生物中除磷菌在好氧条件下对污水中溶解性磷酸盐过量吸收作用，然后沉淀分离而除磷。

在活性污泥生物处理工艺中，除磷脱氮过程中存在的基质竞争和泥龄不同的矛盾使得现有的活性污泥法除磷脱氮技术仍存在较大的困扰，使脱氮除磷的效果不能达到满意的要求，甚至不能达到排放的标准。

使用活性污泥工艺建设的污水处理设施在正式投入使用时，其生化处理装置均需进行污泥接种、驯化(俗称调试)。对于规模较大的污水处理设施尽量缩短调试时间，使处理主体尽快投入正常运行，在实际操作过程中有着重要的意义。我们通过多个日处理万吨的污水处理设施的生化调试发现，在生化调试过程中，如果准备充分，正常气温下一般7-10d即可完成生化设施的培菌接种工作；10d后就可以对污水进行驯化，20d左右便可进入正常运行。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种降解含磷的复合型菌菌剂的制备方法。该菌种能快速的激活活性污泥的活性并使其快速生长，能大大提高活性污泥的生长更替速度。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种降解含磷的复合型菌菌剂的制备方法，该降解含磷的复合型菌菌剂的制备方法包括如下的步骤：

(1)取样

从实验室运行稳定的厌氧\缺氧ASBF反应器中，取富含70％以上反硝化除磷菌的活性污泥做为实验样品；

(2)培养基的制备

牛肉膏蛋白胨培养基：将蛋白胨10g，牛肉膏3g，NaCl 5g，琼脂20g，加蒸馏水1L，pH值调成7.2，，经0.1Mpa的压力，温度120℃灭菌20-30分钟，制得培养基；

缺磷的乙酸合成的培养基：CH₃COONa 2g，Na₂HPO₄·2H₂O 23mg，CaCL₂·2H₂O 11mg，NH₄CL 152.8mg，MgSO₄·7H₂O 81.12mg，K₂SO₄ 17.83mg，HEPES缓冲液7g；微量元素2mL，加蒸馏水调成1L溶液，pH值调成7.2，经0.1Mpa的压力，温度120℃灭菌20-30分钟，制得培养基；

富磷培养基：CH₃COONa 2g，K₂PO₄ 25mg，NH₄CL 305.52mg，MgSO₄·7H₂O91.26mg，CaC1₂·2H₂O 25.68mg，PIPES缓冲液8.5g，2m L微量元素，加蒸馏水调成1L溶液，pH值调成7.2，经0.1Mpa的压力，温度120℃灭菌20-30分钟，制得培养基；

硝酸盐还原产气试验培养基：牛肉膏3g，蛋白胨5g，KNO₃ 1g，加蒸馏水1L，pH值调成7.4，经0.1Mpa的压力，温度120℃高压灭菌20-30分钟制得培养基；

(3)菌株的分离、纯化

取10mL活性污泥至装有90mL无菌水三角瓶中，加入玻璃珠，将三角瓶放入空气振荡器中，7500r·min-1离心10min，弃上清，此过程重复3次，处理后的污泥经步骤(2)中所述的牛肉膏蛋白胨培养基培养15小时，然后采用涂布平板法分离、纯化；

(4)菌株筛选

A)选取分离、纯化后所得斜面菌种，首先在步骤(2)中所述的缺磷的乙酸合成培养基中进行培养：取1.5mL菌悬液于下一磷梯度的培养基中，磷梯度依次为2、5、8、10、15和20mg·L-1(以P计)并用1mol/L的氢氧化钠溶液将pH值调到7，然后各组培养物在30℃、150r/min的摇床上过夜培养；

B)菌体细胞以10000r/min离心出来，之后用无菌蒸馏水洗涤、离心，重新悬浮于步骤(2)中所述的富磷培养基中，然后在30℃摇床中进行扩大培养，整个过程均在无菌操作台上进行；

C)培养24h后，每组大约取10mL菌液，滤纸过滤取澄清的无菌液体培养基，利用钼锑抗分光光度法测定接种后PO₄ ^3--P含量的变化；

D)取摄磷率高于50％的菌株分别进行硝酸盐还原产气试验、异染颗粒染色和聚—β—羟丁酸(PHB)颗粒染色试验，既能过量摄磷又具有反硝化功能并有异染颗粒和PHB颗粒的菌株即为高效DNPAOs；

所述的硝酸盐还原产气实验步骤如下：

准备甲液(对氨基苯磺酸0.8g+5mol/L醋酸100ml)；乙液(α-奈胺0.5g+5mol/L醋酸100ml)，将细菌接种于所述的硝酸盐还原产气试验培养基中，于35℃培养1～2d；将0.1ml甲液和0.1ml乙液混合后加入培养基内，观察结果。出现红色为阳性，即硝酸盐被还原，细菌具有反硝化作用。

所述的异染颗粒染色：可以购买专门的异染颗粒染色剂进行染色，也可以用甲苯胺蓝、次甲基蓝染色，不呈蓝色而呈紫红色则证明有异染颗粒；

所述聚—β—羟丁酸(PHB)颗粒染色：采用苏丹黑B染色,PHB颗粒呈黑绿色；

(5)菌株富集培养

将复筛过程中选出的耐低温高效除磷菌重新接种于上述富磷培养基中，在30℃恒温培养箱内进行富集培养8小时，并在培养过程中的最后两小内每间隔20分钟分别加入微量小于2mg/l的蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶等活性生物酶、营养剂以及微量元素催化剂，以保证除磷菌的活性，得到所述的降解含磷的复合型菌菌剂。

本发明的降磷复合菌菌剂的降磷机理是：好氧条件下，降磷菌不断摄取并氧化分解有机物，产生的能量一部分用于磷的吸收和聚磷的合成，一部分则使ADP与H₃PO₄结合，转化为ATP而储存起来。细菌以聚磷的形式在细胞中储存磷，其量可以超过生长所需，这一过程称为降磷菌磷的摄取处理过程中，通过从系统中排除高磷污泥以达到降磷的目的；在厌氧条件下，降磷菌体内的ATP进行水解，放出H₃PO₄和能量，形成ADP。这一过程称为降磷菌磷的释放。

本发明的降磷复合菌菌剂主要由β—2亚群紫色细菌、不动杆菌、红环菌属和绿单胞菌属组成，再辅以蛋白酶、脂肪酶和纤维素为主的活性生物酶，其中不动杆菌为主导细菌，降磷作用突出。其质量百分比依次为:除磷活性菌种57.0％-45.8％，活性生物酶(蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶等)28.2％-15.5％，聚二甲基二烯丙基氯化铵0.01％-1.5％，催化剂(钾、铁、钙)0.01％-1.5％其余是活性污泥基质。

本发明的有益效果是：本发明以普通活性污泥为基质，附以合适的碳源，主要是大粪及淀粉；磷源和氮源，主要以普钙Ca(H₂PO₄)₂为主和尿素CO(NH2)₂为主。根据生化所需的理论计算量按m(BOD5)：m(N)：m(P)＝100：5：1折算，进行活性污泥菌种的培养，并在菌种培养过程中添加以蛋白酶、脂肪酶和纤维素为主的活性生物酶，使活性生物酶与活性微生物进行结合和反应，并在活性微生物菌种和活性酶的活性培养到最优的时候，附以保鲜化学药剂对这种活性菌种进行分离固化，使其活性封存。该分离和固化过程不会破坏活性微生物和活性酶的机构和活性，在活性微生物和活性酶的菌种重新在水中溶解释放时，其活性会迅速恢复，并且会快速结合到其他活性微生物内进行生长和繁衍。已到达缩短活性污泥生物处理初期调试的时间，并快速的提供脱氮降磷的效果。

该发明已多次经过实验室试验，使用该复合型菌种时，同比普通正常活性污泥法初期调试时间，可以缩短70％；同时在运行过程中添加该水处理复合型菌种，可以降磷的效果可以提升50％；

具体实施方式

以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

实施例1

降解含磷的复合型菌菌剂的制备方法包括如下的步骤：

(1)取样

从实验室运行稳定的厌氧\缺氧ASBF反应器中，取富含70％以上的反硝化除磷菌的活性污泥分别做为实验样品

(2)培养基的制备

牛肉膏蛋白胨培养基：将蛋白胨10g，牛肉膏3g，NaCl 5g，琼脂20g，加蒸馏水1L，pH值调成7.2，，经0.1Mpa的压力，温度120℃灭菌20-30分钟，制得培养基；

缺磷的乙酸合成的培养基：CH₃COONa 2g，Na₂HPO₄·2H₂O 23mg，CaCL₂·2H₂O 11mg，NH₄CL 152.8mg，MgSO₄·7H₂O 81.12mg，K₂SO₄ 17.83mg，HEPES缓冲液7g；微量元素2mL，加蒸馏水调成1L溶液，pH值调成7.2，经0.1Mpa的压力，温度120℃灭菌20-30分钟，制得培养基；

富磷培养基：CH₃COONa 2g，K₂PO₄ 25mg，NH₄CL 305.52mg，MgSO₄·7H₂O91.26mg，CaC1₂·2H₂O 25.68mg，PIPES缓冲液8.5g，2m L微量元素，加蒸馏水调成1L溶液，pH值调成7.2，经0.1Mpa的压力，温度120℃灭菌20-30分钟，制得培养基；

硝酸盐还原产气试验培养基：牛肉膏3g，蛋白胨5g，KNO₃ 1g，加蒸馏水1L，pH值调成7.4，经0.1Mpa的压力，温度120℃高压灭菌20-30分钟制得培养基；

(3)菌株的分离、纯化

取10mL活性污泥至装有90mL无菌水三角瓶中，加入玻璃珠，将三角瓶放入空气振荡器中，7500r·min-1离心10min，弃上清，此过程重复3次，处理后的污泥经步骤(2)中所述的牛肉膏蛋白胨培养基培养15小时，然后采用涂布平板法分离、纯化；

(4)菌株筛选

A)选取分离、纯化后所得斜面菌种，首先在步骤(2)中所述的缺磷的乙酸合成培养基中进行培养：取1.5mL菌悬液于下一磷梯度的培养基中，磷梯度依次为2、5、8、10、15和20mg·L-1(以P计)并用1mol/L的氢氧化钠溶液将pH值调到7，然后各组培养物在30℃、150r/min的摇床上过夜培养；

B)菌体细胞以10000r/min离心出来，之后用无菌蒸馏水洗涤、离心，重新悬浮于步骤(2)中所述的富磷培养基中，然后在30℃摇床中进行扩大培养，整个过程均在无菌操作台上进行；

C)培养24h后，每组大约取10mL菌液，滤纸过滤取澄清的无菌液体培养基，利用钼锑抗分光光度法测定接种后PO₄ ^3--P含量的变化；

D)取摄磷率高于50％的菌株分别进行硝酸盐还原产气试验、异染颗粒染色和聚—β—羟丁酸(PHB)颗粒染色试验，既能过量摄磷又具有反硝化功能并有异染颗粒和PHB颗粒的菌株即为高效DNPAOs；

所述的硝酸盐还原产气实验步骤如下：

准备甲液(对氨基苯磺酸0.8g+5mol/L醋酸100ml)；乙液(α-奈胺0.5g+5mol/L醋酸100ml)，将细菌接种于所述的硝酸盐还原产气试验培养基中，于35℃培养1～2d；将0.1ml甲液和0.1ml乙液混合后加入培养基内，观察结果。出现红色为阳性，即硝酸盐被还原，细菌具有反硝化作用；

所述的异染颗粒染色：可以购买专门的异染颗粒染色剂进行染色，也可以用甲苯胺蓝、次甲基蓝染色，不呈蓝色而呈紫红色则证明有异染颗粒；

所述聚—β—羟丁酸(PHB)颗粒染色：采用苏丹黑B染色,PHB颗粒呈黑绿色；

(5)菌株富集培养

将复筛过程中选出的耐低温高效除磷菌重新接种于上述富磷培养基中，在30℃恒温培养箱内进行富集培养8小时，并在培养过程中的最后两小内每间隔20分钟分别加入微量小于2mg/l的蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶等活性生物酶、营养剂以及微量元素催化剂，以保证除磷菌的活性，得到所述的降解含磷的复合型菌菌剂，该菌剂的聚磷率达到50％以上。

试验例1：

该发明已经在河北省邯郸市馆陶县粮画小镇安装的两套活性污泥过滤床污水处理项目中得以使用和验证，在该项目的调试初期，我们使用了水处理复合型菌种。普通的污水处理20％含固率的污泥，在添加该菌种后，只通过6天的短暂调试，生化池中的污泥活性、污泥浓度都达到了标准要求，并且出水的效果达到了工艺设计的出水要求,国家一级A的排放标准

在高含磷的进水水质时(TP>15mg/l)，我们使用了该复合型菌种，通过均衡的排泥调节，大大提高了降磷的效果，使磷的排放达到了国家一级A的排放标准(TP<0.5mg/l)。并且COD、氮等主要污染的排放都达到了国家一级A的排放要求，各参数详见表1

表1：馆陶县50吨每天活性污泥过滤床污水处理项目初始调试记录

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.一种降解含磷的复合型菌菌剂的制备方法，其特征在于，该降解含磷的复合型菌菌剂的制备方法包括如下的步骤：

(1)取样

从实验室运行稳定的厌氧\缺氧ASBF反应器中，取富含70％以上反硝化除磷菌的活性污泥做为实验样品；

(2)培养基的制备

牛肉膏蛋白胨培养基：将蛋白胨10g，牛肉膏3g，NaCl 5g，琼脂20g，加蒸馏水1L，pH值调成7.2，，经0.1Mpa的压力，温度120℃灭菌20-30分钟，制得培养基；

缺磷的乙酸合成的培养基：CH₃COONa 2g，Na₂HPO₄·2H₂O 23mg，CaCL₂·2H₂O 11mg，NH₄CL152.8mg，MgSO₄·7H₂O 81.12mg，K₂SO₄ 17.83mg，HEPES缓冲液7g；微量元素2mL，加蒸馏水调成1L溶液，pH值调成7.2，经0.1Mpa的压力，温度120℃灭菌20-30分钟，制得培养基；

富磷培养基：CH₃COONa 2g，K₂PO₄ 25mg，NH₄CL 305.52mg，MgSO₄·7H₂O 91.26mg，CaC1₂·2H₂O 25.68mg，PIPES缓冲液8.5g，2m L微量元素，加蒸馏水调成1L溶液，pH值调成7.2，经0.1Mpa的压力，温度120℃灭菌20-30分钟，制得培养基；

硝酸盐还原产气试验培养基：牛肉膏3g，蛋白胨5g，KNO₃ 1g，加蒸馏水1L，pH值调成7.4，经0.1Mpa的压力，温度120℃高压灭菌20-30分钟制得培养基；

(3)菌株的分离、纯化

取10mL活性污泥至装有90mL无菌水三角瓶中，加入玻璃珠，将三角瓶放入空气振荡器中，7500r·min-1离心10min，弃上清，此过程重复3次，处理后的污泥经步骤(2)中所述的牛肉膏蛋白胨培养基培养15小时，然后采用涂布平板法分离、纯化；

(4)菌株筛选

A)选取分离、纯化后所得斜面菌种，首先在步骤(2)中所述的缺磷的乙酸合成培养基中进行培养：取1.5mL菌悬液于下一磷梯度的培养基中，磷梯度依次为2、5、8、10、15和20mg·L-1(以P计)并用1mol/L的氢氧化钠溶液将pH值调到7，然后各组培养物在30℃、150r/min的摇床上过夜培养；

B)菌体细胞以10000r/min离心出来，之后用无菌蒸馏水洗涤、离心，重新悬浮于步骤(2)中所述的富磷培养基中，然后在30℃摇床中进行扩大培养，整个过程均在无菌操作台上进行；

C)培养24h后，每组大约取10mL菌液，滤纸过滤取澄清的无菌液体培养基，利用钼锑抗分光光度法测定接种后PO₄ ^3--P含量的变化；

D)取摄磷率高于50％的菌株分别进行硝酸盐还原产气试验、异染颗粒染色和聚—β—羟丁酸(PHB)颗粒染色试验，既能过量摄磷又具有反硝化功能并有异染颗粒和PHB颗粒的菌株即为高效DNPAOs；

所述的硝酸盐还原产气实验步骤如下：

准备甲液(对氨基苯磺酸0.8g+5mol/L醋酸100ml)；乙液(α-奈胺0.5g+5mol/L醋酸100ml)，将细菌接种于所述的硝酸盐还原产气试验培养基中，于35℃培养1～2d；将0.1ml甲液和0.1ml乙液混合后加入培养基内，观察结果。出现红色为阳性，即硝酸盐被还原，细菌具有反硝化作用；

所述的异染颗粒染色：可以购买专门的异染颗粒染色剂进行染色，也可以用甲苯胺蓝、次甲基蓝染色，不呈蓝色而呈紫红色则证明有异染颗粒；

所述聚—β—羟丁酸(PHB)颗粒染色：采用苏丹黑B染色,PHB颗粒呈黑绿色；

(5)菌株富集培养

将复筛过程中选出的耐低温高效除磷菌重新接种于上述富磷培养基中，在30℃恒温培养箱内进行富集培养8小时，并在培养过程中的最后两小内每间隔20分钟分别加入微量小于2mg/l的蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶等活性生物酶、营养剂以及微量元素催化剂，以保证除磷菌的活性，得到所述的降解含磷的复合型菌菌剂。