CN105039225B - 一种好氧反硝化菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

一种好氧反硝化菌及其应用，它涉及一种好氧反硝化菌及其应用。本发明的一种好氧反硝化菌，该菌株为(Aeromonas sp.)AD‑3，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2015年7月14日，保藏编号为CGMCC No.11069。它用于处理含氮废水。本发明所提供的(Aeromonas sp.)AD‑3的基因具有较高的好氧反硝化性能。总氮去除率高达87.7％，这些特点在水处理领域具有重大意义。

Description

一种好氧反硝化菌及其应用
技术领域
本发明属于生物工程、环境工程技术领域，涉及一种好氧反硝化菌株及其应用，同时提供这种菌株的脱氮效能。
背景技术
当前，随着国民经济地迅速发展和城市化进程地不断深入，城市生活和工业废水的排放总量也在逐年增加。而农药、化肥和合成洗涤剂等的广泛使用，使得水体中的营养物质浓度不断升高，其中氮是引起水体富营养化的主要原因之一。常规的生化处理工艺可以有效地降低污水中的BOD和SS，但当污水中同时存在的N，P等营养物的时候，只能去除污水中氮的30-40％，大量含氮污水将直接排入环境水体。
传统的生物脱氮包括好氧硝化和缺氧反硝化两个过程，即首先在好氧条件下，亚硝酸盐将氨氮氧化为亚硝酸盐，而后硝酸菌将亚硝酸氮进一步氧化为硝酸氮。随后在缺氧条件下，反硝化菌将硝酸氮或亚硝酸氮还原成气体氮或者N2O。好氧反硝化具有以下优点：(1)在有氧条件下进行反硝化，使得同步硝化反硝化(SND)成为可能；(2)硝化反应的产物可直接成为反硝化反应的底物，避免了培养过程亚硝酸盐和硝酸盐的积累对硝化反应的抑制，加速了硝化和反硝化进程.同时，反硝化会补偿硝化反应消耗的碱度，维持了反应系统pH值稳定，降低了操作难度和运行成本；(3)大部分好氧反硝化菌适应性较强、生长速度快、产量高并且对溶解氧浓度要求较低，反硝化速度快且彻底，适合治理大面积氮污染水域。好氧反硝化技术作为一种全新的脱氮技术备受研究者关注。
到目前为止，好氧反硝化菌株主要集中在Pseudomonas菌属、Bacillus菌属和Aeromonas菌属，菌种较为单一，且研究多集中在降解基因和降解机理方面，实际应用研究有限。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种好氧反硝化菌(Aeromonas sp.)AD-3。
本发明的目的之二在于提供该菌株AD-3在水处理中的应用效能。
为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种好氧反硝化菌，该菌株为(Aeromonas sp.)AD-3，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2015年7月14日，保藏编号为CGMCC No.11069。
本发明所提供的好氧反硝化菌株的用途是用于处理含氮废水。
本发明所提供的好氧反硝化细菌(Aeromonas sp.)AD-3，经鉴定为革兰氏阴性杆菌，专性需氧菌，生长温度范围25-42℃，最适生长温度为25-30℃，特别是该菌在4℃不生长而在42℃可以生长，菌体长度为1.5-5.0μm，宽度为0.5-1μm，呈球杆状或线状，成对或短链状排列，菌体一端有单鞭毛，无芽孢。
本发明的(Aeromonas sp.)AD-3的生理生化：菌株(Aeromonas sp.AD-3)的生理生化鉴定参照《伯杰细菌鉴定手册》第八版操作，鉴定结果为Aeromonas sp.AD-3为非发酵革兰氏阴性菌，专性需氧菌，生长温度范围25-42℃，最适生长温度为25-30℃，特别是该菌在4℃不生长而在42℃可以生长。菌体长度为1.5-5.0μm，宽度为0.5-1μm，呈球杆状或线状，成对或短链状排列，菌体一端有单鞭毛，无芽孢。该菌株不需要有机生长因素。营养多样化：单个菌株的生长可利用76-82种或更多的不同有机化合物。对菌株进行革兰氏染色，氧化酶，接触酶，葡萄糖氧化发酵，产吲哚，V.P.测定，M.R.测定，明胶液化，淀粉水解，柠檬酸盐利用，硝酸盐还原等主要生理生化指标试验，结果如表1所示。
表1(Aeromonas sp.)AD-3的生理生化指标
本发明包含以下有益效果：
本发明所提供的(Aeromonas sp.)AD-3的基因具有较高的好氧反硝化性能。可用于污水生物脱氮工艺总氮去除率高达87.7％，这些特点在水处理领域具有重大意义。
附图说明
图1是菌株(Aeromonas sp.)AD-3的生长曲线图；
图2是菌株AD-3对总氮的去除效能图。
具体实施方式
具体实施方式一：本实施方式的一种好氧反硝化菌，该菌株为(Aeromonas sp.)AD-3，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2015年7月14日，保藏编号为CGMCC No.11069。
本实施方式的(Aeromonas sp.)AD-3是通过以下方式获得的：
a.取SBR反应器运行稳定运行半个月的缺氧段末的活性污泥作为分离用泥；
b.采用稀释混合平板法进行分离：对己分离出来的菌株在好氧条件下置于反硝化培养基中进行脱氮试验，同时辅助进行硝酸盐还原产气试验及异染颗粒染色(亚甲基蓝染色法)检验。对于硝酸还原性为阳性并产气，且在好氧条件下能降低TN浓度的细菌即为好氧反硝化菌种属。
具体分离步骤为：从SBR反应器缺氧段末取10mL活性污泥至装有90mL无菌水的三角瓶中，加入无菌玻璃珠；将三角瓶放入摇床中充分振荡，使细菌呈单细胞状态分散于水中。然后，从三角瓶内的污泥菌悬液中取lmL悬液接入装有9mL无菌水的试管内，得到10-1梯度的菌悬液，继续此步骤，依次得到10-2、10-3、10-4……10-7梯度的菌悬液，各取lmL水样放入培养皿种，待培养基快凝却时倒入培养皿中，混匀，待培养基凝固后倒置培养皿于30℃恒温培养箱中培养2～3天后，分别选取不同形态、菌落清晰的典型菌落，标记并挑取单个菌落在平板培养基上进行三区划线分离，重复3～4次至菌落特征一致的单菌落，最后挑取单一菌落，转接到准备好的试管斜面上以备用；上述所有操作均在无菌条件下进行。
所述的反硝化培养基成分(g/L)为：丁二酸钠4.7；磷酸氢二钠7.9；磷酸二氢钾1.5；氯化铵0.3；硫酸镁0.1；硝酸钾1.5；微量元素1ml。微量元素成分(g/L):EDTA 50；硫酸亚铁5.0；硫酸锌2.2；钼酸铵1.1；氯化钙5.5；硫酸铜1.57；氯化锰5.06；氯化钴1.61.pH＝7.2～7.5；温度30℃左右。
c.对筛选得到的菌株进行分子鉴定，按以下步骤进行：
提取菌株的DNA，经PCR扩增后，然后利用胶回收试剂盒(回收纯化PCR产物，之后进行克隆、转化，筛选阳性克隆子菌落，经扩大培养后进行测序，测序结果位测得长度为1460bp的序列，如序列表Seq ID No：1所示，其序列提交至GenBank，以确定菌株的种属关系，最终确定为气单孢菌属(Aeromonas sp.)。通过结合菌体形态特征、生长条件、生理生化鉴定结果其为好氧反硝化菌(Aeromonas sp.)AD-3。
所述的PCR扩增过程的具体步骤为：
1)PCR体系建立(25μL)：
2)PCR程序设定：
预变性95℃ 3min，
95℃预变性5min，94℃变性lmin，58℃复性30s，72℃延伸3min，共30个循环，最后72℃延伸10min；
3)引物序列：
引物1 5’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’
引物2 5’-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3’。
所述的生理生化鉴定如下：菌株(Aeromonas sp.AD-3)的生理生化鉴定参照《伯杰细菌鉴定手册》第八版操作，鉴定结果为Aeromonas sp.AD-3为非发酵革兰氏阴性菌，专性需氧菌，生长温度范围25-42℃，最适生长温度为25-30℃，特别是该菌在4℃不生长而在42℃可以生长。菌体长度为1.5-5.0μm，宽度为0.5-1μm，呈球杆状或线状，成对或短链状排列，菌体一端有单鞭毛，无芽孢。该菌株不需要有机生长因素。营养多样化：单个菌株的生长可利用76-82种或更多的不同有机化合物。对菌株进行革兰氏染色，氧化酶，接触酶，葡萄糖氧化发酵，产吲哚，V.P.测定，M.R.测定，明胶液化，淀粉水解，柠檬酸盐利用，硝酸盐还原等主要生理生化指标试验，结果如表1所示。
表1(Aeromonas sp.)AD-3的生理生化指标
所述的菌体形态特征、生长条件如下：经鉴定为革兰氏阴性杆菌，专性需氧菌，生长温度范围25-42℃，最适生长温度为25-30℃，特别是该菌在4℃不生长而在42℃可以生长，菌体长度为1.5-5.0μm，宽度为0.5-1μm，呈球杆状或线状，成对或短链状排列，菌体一端有单鞭毛，无芽孢。
对本实施方式分离出的好氧反硝化菌(Aeromonas sp.)AD-3株在好氧条件下在反硝化培养基中进行脱氮试验。同时辅助进行硝酸盐还原产气试验及异染颗粒染色(亚甲基蓝染色法)检验。对于硝酸还原性为阳性并产气，并在好氧条件下能降低TN浓度的细菌即为好氧反硝化菌种属。
具体试验如下：将菌株(Aeromonas sp.AD-3)按照具体实施方法进行活化，富集培养。富集培养完成后，移取10mL悬浊液至含有100mL不含琼脂的好氧反硝化培养基(培养基成分(g/L)：丁二酸钠4.7；磷酸氢二钠7.9；磷酸二氢钾1.5；氯化铵0.3；硫酸镁0.1；硝酸钾1.5；微量元素1ml。微量元素成分(g/L):EDTA 50；硫酸亚铁5.0；硫酸锌2.2；钼酸铵1.1；氯化钙5.5；硫酸铜1.57；氯化锰5.06；氯化钴1.61.pH＝7.2～7.5；温度30℃左右)的250mL锥形瓶中，在30℃，160rpm/min条件下培养24h。培养完成后再离心(8000rpm，10min)，取上清液测定氨氮、硝态氮、亚硝氮及TN的含量，结果如表2。
表2 含量测定结果
硝酸盐还原产气试验：取将菌株(Aeromonas sp.AD-3)在固体琼脂斜面上进行培养后的菌种，接种在带杜氏小管的硝酸盐还原培养基(牛肉膏，3g/L；蛋白陈，5g/L；KNO3，1g/L；pH，7.4；121℃高压蒸汽灭菌20min)中，每个菌株作2个平行试验，同时另外留2管不接种做对照。30℃恒温培养，分别在1天、3天、5天后检测结果：检查杜氏小管内是否产气，如有气泡表明有氮气产生；在比色瓷盘中加入少量培养液，滴入1-2滴格里斯试剂A液(对氨基苯磺酸，0.5g；10％左右稀醋酸，15Oml)和B液(a-苯胺，0.1g；10％左右稀醋酸，15Oml；H2O，2Oml)。在对照管中同样加入A液和B液各1-2滴。若溶液变为红色，橙色，或棕色等，表示有亚硝酸盐存在，为硝酸盐还原阳性；如无红色出现则可加入1-2滴二苯胺试剂(0.5g二苯胺溶于100ml浓H2SO4，并加20ml蒸馏水稀释，存于棕色瓶中)，如不呈蓝色反应，则仍为阳性反应。若呈蓝色反应，则为阴性反应。
对己分离出来的菌株在好氧条件下在反硝化培养基中进行脱氮试验。同时辅助进行硝酸盐还原产气试验及异染颗粒染色(亚甲基蓝染色法)检验。对于硝酸还原性为阳性并产气，并在好氧条件下能降低TN浓度的细菌即为好氧反硝化菌种属。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：该菌株是活性污泥中分离得到。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式一种好氧反硝化菌的应用，它用于在含氮废水处理中的脱氮效能。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式三不同的是：它是按照以下步骤进行的：挑取权利要求1的(Aeromonas sp.)AD-3菌落，富集24小时后，以每1L水样接种100mL菌液的比例接种至含氮培养基中，培养时间24小时，即完成。其它与具体实施按方式三相同。
对本发明的(Aeromonas sp.)AD-3菌株进行如下功能验证：
1)本发明的(Aeromonas sp.)AD-3能以多种有机物为碳源，可用于污水生物脱氮。对(Aeromonas sp.)AD-3生物脱氮能力进行检测：
(Aeromonas sp.)AD-3生长曲线测定。按照测定细菌生长曲线的标准方法对菌株(Aeromonas sp.)AD-3的生长曲线进行测定，每隔2h取培养液，采用光电比浊法，在660nm波长处测定菌液的OD660(Optical Density)，然后经0.22pm微孔滤膜过滤，检测滤液TN，pH值等指标。获得(Aeromonas sp.)AD-3生长曲线如图1所示。从图1中可以看出，这菌株(Aeromonas sp.)AD-3的生长曲线比较典型，潜伏期较短，为2h左右，这可能是因为菌株(Aeromonas sp.)AD-3的活性较强，且接种前后的培养条件相似，接入后在较短时间内即可适应新的环境。菌株的对数生长期约为4-10h，12h以后开始进入稳定期和衰亡期。
2)(Aeromonas sp.)AD-3脱氮效能测定
将菌株(Aeromonas sp.)AD-3按照实施方法进行活化，富集培养。富集培养完成后移取10ml悬浊液至含有100ml不含琼脂的好氧反硝化培养基的250ml锥形瓶中，再30℃，160rpm/min条件下培养24h。每隔2h取培养液，再离心(8000rpm，10min)，取上清液测定氨氮、硝态氮、亚硝氮及TN的含量。结果如图2所示，从图2可以看出，菌株AD-3有良好的好氧反硝化效果。一般来说传统反硝化理论认为，由于溶解氧会与硝酸盐氮竞争电子受体，溶解氧(DO)的存在会对反硝化过程起到抑制作用，从而抑制反硝化的进行。但是，好氧反硝化理论的提出转变了传统观念，其理论认为由于菌体中存在周质硝酸盐还原酶，因此菌株可利用硝态氮和氧气同时作为电子受体进行协同呼吸。综上，菌株AD-3为高效的好氧反硝化菌。
本发明内容不仅限于上述各实施方式的内容，其中一个或几个具体实施方式的组合同样也可以实现发明的目的。

Claims (3)

1.一种好氧反硝化菌，其特征在于该菌株为Aeromonas sp. AD-3，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2015年7月14日，保藏编号为CGMCC No.11069。
2.根据权利要求1所述的一种好氧反硝化菌，其特征在于该菌株是从活性污泥中分离得到。
3.一种好氧反硝化菌的应用，其特征在于它用于处理含氮废水；具体处理含氮废水是按照以下步骤进行的：挑取权利要求1的Aeromonas sp. AD-3菌落，富集24小时后，以每1L水样接种100mL菌液的比例接种至含氮培养基中，培养时间24小时，即完成。
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