CN101386823A - 一株特效厌氧反硝化菌及其处理废水的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株特效厌氧反硝化菌，该菌株为HJD07，厌氧反硝化菌菌菌株，保藏号为CGMCC № 2163，保藏日期为2007年09月13日，所述的厌氧反硝化菌菌株从淤泥中分离得到，该厌氧反硝化菌在25℃～35℃，pH值为6.5～8.0，富集培养基中培养，分离培养基中分离。通过厌氧反硝化处理废水，成本低、除氮高效稳定、无二次污染，从而有效地处理了含氮废水，保护环境。

Description

一株特效厌氧反硝化菌及其处理废水的方法

【技术领域】

本发明涉及生物技术领域，尤其是关于一株特效厌氧反硝化菌及其处理废水的方法。

【背景技术】

氮素污染不仅可引起水体富营养化，造成水生植物和藻类过度生长，使水质迅速恶化，而且会降低水体观赏价值，危害水生生物的生存。水中硝态氮(硝酸盐和亚硝酸)含量过高会影响人类健康，诱发高铁血红蛋白血症和胃癌。

【发明内容】

本发明所要解决的技术问题是，克服现有技术的不足，提供一种成本低、稳定高效除氮、无二次污染的特效厌氧反硝化及其处理废水的方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一株特效厌氧反硝化菌，该菌株为HJD07，厌氧反硝化菌菌菌株，保藏号为CGMCC № 2163，保藏日期为2007年09月13日。

所述的厌氧反硝化菌菌株从淤泥中分离得到，该厌氧反硝化菌在25℃～35℃，pH值为6.5～8.0，富集培养基中培养，分离培养基中分离。

所述的厌氧反硝化菌菌株从河底淤泥中分离得到，该厌氧反硝化菌菌株适宜在温度为30℃，pH值为7.0～7.2，富集培养基中培养，分离培养基中分离。

所述的富集培养基成分为：葡萄糖5g、硫酸铵2g、硫酸镁0.02g、柠檬酸钠1g、磷酸二氢钾4g、磷酸氢二钾6g、蒸馏水1000mL，pH值7.0～7.2，固体培养基另加琼脂2％(W/V，即在100毫升培养基中用的琼脂是2克)。

所述的分离培养基成分为：葡萄糖5g、亚硝酸钾2g、硫酸镁0.2g、氯化钠1g、磷酸二氢钾4g、磷酸氢二钾6g、蒸馏水1000mL，pH值为7.0～7.2，固体培养基另加琼脂2％(W/V，即在100毫升培养基中用的琼脂是2克)。

所述的厌氧反硝化菌菌株从河底淤泥中分离得到，该厌氧反硝化菌菌株适宜在温度为30℃，密闭培养3天；在富集培养基成分为葡萄糖5g、硫酸铵2g、硫酸镁0.02g、柠檬酸钠1g、磷酸二氢钾4g、磷酸氢二钾6g、蒸馏水1000mL，pH值7.0～7.2，固体培养基另加琼脂2％(W/V，即在100毫升培养基中用的琼脂是2克)中培养，培养基变混浊后，同样条件下振荡培养3天；在温度为30℃时，分离培养基成分为葡萄糖5g、亚硝酸钾2g、硫酸镁0.2g、氯化钠1g、磷酸二氢钾4g、磷酸氢二钾6g、蒸馏水1000mL，pH值为7.0～7.2，固体培养基另加琼脂2％(W/V，即在100毫升培养基中用的琼脂是2克)中分离。

所述的厌氧反硝化菌菌株属于施氏假单胞菌株(Pseudomonasstutzeri)，主要特征为：菌落为乳白色、圆形、无突起、边缘规则、粘稠，菌落大小为1～2mm；菌株个体呈弯杆状，宽为0.5～0.8μm，长0.7～1.2μm，无芽孢，具端生鞭毛，丛生，能运动。

所述的厌氧反硝化菌菌株的生理生化特征表现为：革兰氏染色阴性，氧化酶阳性，接触酶阳性，可利用多种碳源，不需要生长因子。

一种利用所述的一株特效厌氧反硝化菌处理含氮污水的方法，包括如下步骤：

a)厌氧反硝化菌菌株的培养；

b)厌氧反硝化菌菌株的分离；

c)厌氧反硝化菌菌株与污水反应除氮；

d)回收厌氧反硝化菌菌株，循环使用。

环境因素对所述的厌氧反硝化菌菌株影响的主次顺序为：Cu²⁺>温度>碳源>C/N>pH值，在以甘油为碳源、pH值为7.5、温度为32℃、C/N比为3：1、铜离子浓度为5mg/L时，所述的厌氧反硝化菌菌株有最大反硝化能力。

本发明的有益效果是，通过厌氧反硝化处理废水，成本低、除氮高效稳定、无二次污染，从而有效地处理了含氮废水，保护环境。

【附图说明】

图1是不同温度对HJD07菌株的影响曲线图；

图2是不同pH对HJD07菌株的影响曲线图；

图3是HJD07菌株应用于深圳市布吉河水质净化厂对氮的去除效果曲线图。

【具体实施方式】

从废水中去除氮素污染是近年来的重要研究课题。目前普遍认为生物脱氮是从废水中去除氮素污染的经济有效的方法之一，生物脱氮包括硝化和反硝化两个过程：硝化作用由亚硝酸盐细菌和硝酸盐细菌将氨化合物氧化为亚硝酸盐和硝酸盐；反硝化作用也称脱氮作用，由反硝化细菌在厌氧或微厌氧条件下将硝酸盐还原成氧化亚氮或氮气。反硝化作用是生物脱氮中心环节，直接关系到脱氮效果的好坏。反硝化细菌在这一过程中起核心作用，因此，发现高效的反硝化菌种及其实施办法是提高生物脱氮效率的关键。

一直以来，异养反硝化细菌在反硝化作用的过程中占据主要地位，并且这些异养反硝化细菌大多在厌氧或兼氧状态进行反硝化作用，近年来人们虽然也发现了一些好氧反硝化菌，但对好氧反硝化菌的筛选和研究尚处起步阶段，离实践应用还有一段距离。所以目前，对异养反硝化微生物的深入研究有较大的实践意义。

厌氧反硝化细菌在转换亚硝酸盐、硝酸盐为氮气时不需要氧气，通过诱导产生硝酸还原酶和亚硝酸还原酶对硝酸盐和亚硝酸盐进行还原，需要有机碳作为碳源和电子供体，以亚硝酸盐和硝酸盐作为电子受体。目前，已知有50属以上的微生物能够进行反硝化作用。不同反硝化细菌的反硝化作用能力不同，生长条件也存在很大差异，因此筛选出反硝化作用能力强、生长条件温和的菌株，对于强化污水的生物脱氮具有潜在应用价值。

本发明特效厌氧反硝化菌，属于施氏假单胞菌株(Pseudomonasstutzeri)，命名为HJD07。于2007年09月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号为CGMCC №2163。

本发明一株特效厌氧反硝化菌，厌氧反硝化菌菌株取自深圳市布吉河底泥，经8次富集培养、7次分离纯化得到一株反硝化能力强的菌株。在YDC培养基上菌落为乳白色、圆形、无突起、边缘规则、粘稠，菌落大小为1～2mm，菌株个体呈弯杆状，宽为0.5～0.8μm，长0.7～1.2μm，无芽孢，具端生鞭毛，丛生，能运动。其生理生化特征表现为：革兰氏染色阴性，氧化酶阳性，接触酶阳性，可利用多种碳源，从图1和图2可明显看出，该菌最适生长pH值为7.0～8.0，最适生长温度为30～35℃，生长条件与一般的细菌相似。对水体中的硝态氮通过反硝化来实现生物脱氮，这种反硝化的活性与水体中溶氧的含量呈负相关。

实施例1：厌氧反硝化菌HJD07菌株的分离、鉴定及其反硝化特性

1、菌株的分离

(1)采集样品

现场采集深圳市布吉河底淤泥样品于150ml茶色细口瓶盛装，用适量的蒸馏水稀释后放入厌氧盒保存，装运回实验室。

(2)菌株富集、分离

取样品溶液10ml至装有150ml富集培养基(已灭菌)的三角瓶中，于30℃密闭培养3天。富集培养基成分：葡萄糖5g、硫酸铵2g、硫酸镁0.02g、柠檬酸钠1g、磷酸二氢钾4g、磷酸氢二钾6g、蒸馏水1000mL，pH值为7.0～7.2，固体培养基另加琼脂2％(W/V)。培养基变混浊后，再转移8ml至新的富集培养基中，同样条件下振荡培养3天，如此再重复4次，每次的转移量分别为5ml、3ml、1ml、0.5ml。依次增加培养基中硝酸钾的含量：2mg、5mg、8mg、10mg、15mg、20mg。取1ml的菌悬液稀释至10000倍后，取稀释菌液0.5ml平板涂布，于30℃培养2～3天，即有菌落出现。选择那些形态不一样的菌落按照微生物纯种分离的常规方法平板划线分离，重复五次以上分离得到多株纯菌株。分离培养基成分为：葡萄糖5g、亚硝酸钾2g、硫酸镁0.2g，氯化钠1g，磷酸二氢钾4g、磷酸氢二钾6g，蒸馏水1000mL，pH值为7.0～7.2，固体培养基另加琼脂2％(W/V)。

2、菌株的鉴定

(1)厌氧反硝化菌HJD07的菌体及菌落形态特征

厌氧反硝化菌HJD07的菌落为乳白色、圆形、无突起、边缘规则、粘稠，菌落大小为1～2mm；菌株个体呈弯杆状，宽为0.5～0.8μm，长0.7～1.2μm，无芽孢，具端生鞭毛，丛生，能运动。

(2)厌氧反硝化菌HJD07的生理生化特征

其生理生化特征表现为：革兰氏染色阴性，氧化酶阳性，接触酶阳性，可利用多种碳源，不需要生长因子。

根据厌氧反硝化菌HJD07的上述菌学特性，将其鉴定为假单胞菌属(Pseudomonas sp.)。

3、环境因素对HJD07菌株反硝化能力影响的正交试验

将活化好的微生物发酵液按0.5％的接种量用连有三通阀的注射器接入装有相应培养基的Hungate试管中，每组三个重复。并用注射器抽出2mL管中的空气，注入去丙酮的乙炔2mL。剧烈震荡使乙炔溶解到培养液中。置于相应温度下培养60小时后，用气谱法测管中产生N₂O的浓度。

表1 反硝化条件正交实验因素水平表

*指碳源中的碳与NO₃--N的摩尔比，如未作说明，下同。

表2 反硝化条件的L16(45)正交实验设计表

表3 正交实验结果表

通过对试验结果极差分析，按照极差决定因素影响菌株反硝化能力的主次顺序，为:Cu²⁺>温度>碳源>C/N>pH值；经统计分析，所试因子对反硝化菌HJD07的最佳组合为a2b3c4d1e2；既在以甘油为碳源、pH值为7.5、32℃、C/N比为3：1、铜离子浓度为5mg/L时，有最大反硝化能力，铜离子对反硝化菌HJD07反硝化能力的影响最大。

实施例2：厌氧反硝化菌HJD07对布吉河河道污水除氮效能中试实验

为验证该菌在天然水中的反硝化效果，用布吉河水体进行了试验。试验在面积为124m²，水深为1m的小池塘中进行。将培养到对数生长期的HJD07菌菌液按5mg/L的量加入池塘水体，24h后测定底层水质的无机氮含量。试验设3个平行，同时设对照组。

表4 厌氧反硝化菌HJD07在布吉河河道污水除氮效果

结果显示，反硝化菌HJD07在污染水体中有较强的反硝化功能，其中硝态氮下降了82.48％，并对水体中铵态氮和总氮的减少有一定促进作用。实施例3：厌氧反硝化菌HJD07在深圳布吉河污水治理实践工程的应用效果

布吉河水质进化厂采用工艺：强化淹没生物膜-活性污泥(SBF-AS)复合生物处理工艺(EHYBFAS工艺，专利号：200620017991.5)。厌氧反硝化菌HJD07株按照实施例2的方法实验室培养后，取5％的接种量至5000L灭菌培养罐发酵培养，培养至菌体浓度为108～109CFU/L。系统启动时投加一定量的菌液投加至SBF-AS反应池的厌氧段以加速系统的启动，系统运行期间当反应池内反硝化菌HJD07浓度低于104CFU/L时，补充投加适量的HJD07菌液。结果表明除氮系统的启动时间大为缩短，12d后系统稳定运行，NO_X-N指标要求达到《城镇污水处理厂污染物排放标准》(GB18918-2002)一级A标准，NO_X-N的去除率稳定在90.7％以上(表5、图3)。

表5 HJD07菌株应用于深圳市布吉河水质净化厂对硝态氮的去除效果

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一株特效厌氧反硝化菌，其特征在于：该菌株为HJD07，厌氧反硝化菌菌菌株，保藏号为CGMCC № 2163，保藏日期为2007年09月13日。

2.根据权利要求1所述的一株特效厌氧反硝化菌，其特征在于：所述的厌氧反硝化菌菌株从淤泥中分离得到，该厌氧反硝化菌在25℃～35℃，pH值为6.5～8.0，富集培养基中培养，分离培养基中分离。

3.根据权利要求2所述的一株特效厌氧反硝化菌，其特征在于：所述的厌氧反硝化菌菌株从河底淤泥中分离得到，该厌氧反硝化菌菌株适宜在温度为30℃，pH值为7.0～7.2，富集培养基中培养，分离培养基中分离。

4.根据权利要求2～3中任意一项所述的一株特效厌氧反硝化菌，其特征在于：所述的富集培养基成分为：葡萄糖5g、硫酸铵2g、硫酸镁0.02g、柠檬酸钠1g、磷酸二氢钾4g、磷酸氢二钾6g、蒸馏水1000mL，pH值为7.0～7.2，固体培养基另加琼脂2％。

5.根据权利要求2～3中任意一项所述的一株特效厌氧反硝化菌，其特征在于：所述的分离培养基成分为：葡萄糖5g、亚硝酸钾2g、硫酸镁0.2g、氯化钠1g、磷酸二氢钾4g、磷酸氢二钾6g、蒸馏水1000mL，pH值为7.0～7.2，固体培养基另加琼脂2％。

6.根据权利要求2～5中任意一项所述的一株特效厌氧反硝化菌，其特征在于：所述的厌氧反硝化菌菌株从河底淤泥中分离得到，该厌氧反硝化菌菌株适宜在温度为30℃，密闭培养3天；在所述的富集培养基中培养，培养基变混浊后，同样条件下振荡培养3天；在温度为30℃时，在所述的分离培养基中分离。

7.根据权利要求1所述的一株特效厌氧反硝化菌，其特征在于：所述的厌氧反硝化菌菌株属于施氏假单胞菌属(Pseudomonas stutzeri)，主要特征为：菌落为乳白色、圆形、无突起、边缘规则、粘稠，菌落大小为1～2mm；菌株个体呈弯杆状，宽为0.5～0.8μm，长0.7～1.2μm，无芽孢，具端生鞭毛，丛生，能运动。

8.根据权利要求7所述的一株特效厌氧反硝化菌，其特征在于：所述的厌氧反硝化菌菌株的生理生化特征表现为：革兰氏染色阴性，氧化酶阳性，接触酶阳性，可利用多种碳源，不需要生长因子。

9.一种利用权利要求1所述的一株特效厌氧反硝化菌处理含氮污水的方法，其特征在于：包括如下步骤：

a)厌氧反硝化菌菌株的培养；

b)厌氧反硝化菌菌株的分离；

c)厌氧反硝化菌菌株与污水反应除氮素；

d)回收厌氧反硝化菌菌株，循环使用。

10.根据权利要求1～9任意一项所述的一株特效厌氧反硝化菌，其特征在于：环境因素对所述的厌氧反硝化菌菌株影响的主次顺序为：Cu²⁺>温度>碳源>C/N>pH值，在以甘油为碳源、pH值为7.5、温度为32℃、C/N比为3：1、铜离子浓度为5mg/L时，所述的厌氧反硝化菌菌株有最大反硝化能力。

Images