CN108342339B - 克雷伯氏菌属菌株及其在河道污水和农村含氨氮生活污水应用 - Google Patents

克雷伯氏菌属菌株及其在河道污水和农村含氨氮生活污水应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一株具有同步好氧硝化与反硝化性能的脱氮菌株Klebsiella sp.KSND‑3及其制备应用，本发明还提供了一种克雷伯氏菌属菌株及其在河道污水和农村含氨氮生活污水应用。由于其生长速率快、细胞产量高、需溶解氧浓度低，且可同步进行硝化反硝化作用，因而其脱氮工艺更简洁、经济有效。

Description

克雷伯氏菌属菌株及其在河道污水和农村含氨氮生活污水 应用
技术领域
本发明涉及一株新的菌种——克雷伯氏菌属菌株Klebsiella sp.KSND-3，及利用该菌株污水中脱氮的应用。
背景技术
人类生产活动的迅猛发展给环境带来的污染越来越严重，其中来自农业、工业和生活污水的排放导致了地表水污染严重，远远超越了环境自我承受和净化能力。其中排放的污水中大量含氮化合物，可引起水体富营养化，危及水生生物和人类健康。因此控制水体氨氮的浓度是环境污水治理的首要目标。
生物脱氮技术是目前应用广泛且经济效益较高的脱氮方法。传统的生物脱氮主要有自养硝化细菌和异养反硝化细菌协同作用完成，且前者好氧，后者为厌氧微生物。近年来研究发现，自然界中存在大量的异养硝化细菌和异养好氧反硝化细菌在，甚至一些菌株同时具备了这两种功能即异养硝化－好氧反硝化细菌也相继被报道。相对于传统的自养硝化细菌，异养硝化细菌生长速率快、溶解氧需氧量低，且可同步进行硝化反硝化作用，因而其脱氮工艺更简洁、经济有效。
然而传统生物脱氮认为脱氮细菌主要为自养型，其工艺包括好氧硝化和厌氧反硝化两部分，由于反应发生条件不同，需要由异养微生物将含氮有机物分解成氨，再在好氧条件下由自养型硝化细菌通过硝化作用将氨转化为硝酸盐，再进入厌氧池在厌氧反硝化细菌作用将硝酸盐转化为氮气。这就造成传统的脱氮工艺存在许多缺点：
①自养型细菌生长缓慢，细胞浓度低，环境耐受性差，因而反应时间长，脱氮效率低；
②整个脱氮过程反应步骤多，工艺流程长而复杂，对场地要求高，投资大，运行困难；
③硝化反应需氧量大，反应体系受环境影响大，抗冲击能力弱。
发明内容
本发明为了克服现有技术的至少一个不足，提供一株新的菌种——克雷伯氏菌属菌株Klebsiella sp.KSND-3，及利用该菌株在污水中脱氮的方法。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
克雷伯氏菌属菌株Klebsiella sp.KSND-3，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，保藏编号CCTCC NO:M 2017542，保藏日期2017年09月25日。
该新菌株特征如下：
菌落形态：30℃在LB平板培养12h，菌落呈光滑圆形，直径1～2mm，饱满隆起，菌落呈浅黄色，边缘整齐，光滑湿润有光泽。菌落随时间的延长而增大，数天后直径可达3-4mm以上。
细胞形态：生物学形状为较短粗的杆菌，大小0.5～0.8×1～2um,单独、成双或短链状排列。无芽胞，无鞭毛，有较厚的荚膜，多数有菌毛。
生理生化特征：兼性厌氧，化能异养，最适生长温度为30℃。营养要求不高，有普通琼脂培养基上形成较大的灰白色粘液菌落。在选择性培养基上能发酵乳糖，呈现有色菌落。生长在肉汁培养基上产生粘韧度不等的稍呈圆形有闪光的菌落，氧化酶阴性。大多数菌株能利用柠檬酸盐和葡萄糖作为唯一碳源。发酵葡萄糖产酸产气(产生CO2多于H2)，不运动。大多数菌株产生2，3-丁二醇作为葡萄糖发酵的主要末端产物，VP试验通常阳性；与混合酸发酵比较起来形成较少的乳酸、乙酸和甲酸，而形成较多的乙醇。利用细菌16S rDNA序列测序的方法对其进行种属鉴定，序列见核酸序列表SEQ ID NO:1。
本发明提供一株克雷伯氏菌属菌株Klebsiella sp.KSND-3，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC M 2017542。
本发明还提供一种上的克雷伯氏菌属菌株Klebsiella sp.KSND-3在河道污水和农村含氨氮生活污水的脱氮处理中的应用。
进一步，克雷伯氏菌属菌株Klebsiella sp.KSND-3在污水脱氮处理中，污水的碳氮比为大于或等于8。
进一步，克雷伯氏菌属菌株Klebsiella sp.KSND-3在污水脱氮处理中，污水的pH为7-8。
此外本发明还提供一种上述的克雷伯氏菌属菌株Klebsiella sp.KSND-3的筛选方法，包括以下步骤：
步骤a，富集培养：从河道淤泥中提取淤泥样品，加入生理盐水制成菌悬液，取菌悬液加入驯化培养基中，振荡培养指定时间，为第一个驯化周期；第一个驯化周期的培养物移至第二期的驯化培养基中，振荡培养指定时间，此为第二个驯化周期，继续进行多次的驯化；
步骤b，菌株初筛选：取驯化完成的菌液加入生理盐水，按梯度稀释法分别将样品稀释成不同梯度的菌悬液，进行二氧化氮和氮的显色试验，对出现红色反应的样品进行固体平板画线培养，得到纯种单菌落，初筛挑选显色明显的菌株进行下一步实验；
步骤c，复筛与性能鉴定：将初筛得到的单菌落克隆分别以氨氮、硝酸盐和亚硝酸盐作为唯一氮源培养，定时期取样测定培养液中的氨氮、硝酸盐和亚硝酸盐的浓度，通过分析总氮的去除率来判断菌株的硝化与反硝化性能，得到性能最佳的菌株命名为Klebsiellasp.KSND-3。
进一步，步骤b中平板采用BTB固体培养基，所述培养基为BTB2％的琼脂得到，其中BTB液体培养基按下述比例配制：柠檬酸三钠5g；KNO3 2g；K2HPO41g；KH2PO4 1g；MgSO4 0.2g；微量盐溶液2ml；蒸馏水1000ml；1％BTB 1ml；pH 7.0-7.2。
驯化培养基成分为1000ml水中，葡萄糖5g；NH4Cl 2g；K2HPO4 1g；KH2PO41g；MgSO40.2g，微量盐溶液1ml，pH 7.2，115℃、湿热灭菌20min；其中微量盐溶液：乙二胺四乙酸50g；ZnSO4 2.2g；CaCl2 5.5g；CuSO4·5H2O 1.57g；MnCl2·4H2O 5.06g；FeSO4·7H2O 5g；CoCl2·6H2O 1.61g；蒸馏水1000ml；pH 7.0-7.2。
本发明的有益效果主要体现在：本发明筛选了一株具有同步好氧硝化与反硝化性能的脱氮菌株Klebsiella sp.KSND-3及其制备应用，由于其生长速率快、细胞产量高、需溶解氧浓度低，且可同步进行硝化反硝化作用，因而其脱氮工艺更简洁、经济有效。
本发明的克雷伯氏菌属菌株Klebsiella sp.KSND-3，能分别利用氨氮、亚硝酸盐、硝酸盐为唯一氮源生长。以氨氮为唯一氮源的情况下，100mg/L的起始氨氮在48h内总氮去除率达到93.1％以上；300mg/L的起始氨氮在48h内总氮去除率达到60.1％，且硝态氮和亚硝态氮几乎无积累；在以亚硝酸盐为唯一氮源的情况下，总氮去除率达到99％，无氨氮和硝酸盐累积。在以硝酸盐为唯一氮源的情况下，105mg/L的起始氨氮在48h内总氮去除率达到78％以上，无亚硝态氮积累。
为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，作详细说明如下。
附图说明
图1为实施例1中Klebsiella sp.KSND-3以亚硝酸盐为唯一氮源培养时总氮的去除图；
图2是实施例1中Klebsiella sp.KSND-3以氨氮为唯一氮源培养时总氮的去除图；
图3是实施例1中Klebsiella sp.KSND-3以硝酸盐为唯一氮源培养时总氮的去除图；
图4是实施例3中不同起始浓度下氨氧化细菌的氨氧化速率；
图5是实施例4中不同碳氮比下氨氧化细菌的氨氧化速率。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1
异养硝化-好氧反硝化菌株的分离、筛选和性能鉴定
1、富集培养：取10g余杭星桥河道淤泥样品于盛有100ml无菌生理盐水的锥形瓶中，振荡直至样品完全打散并与无菌生理盐水充分混匀，制备菌悬液。吸取10ml的菌悬液移至100ml的驯化培养基中，30℃、200r/min振荡培养2天，此为第一个驯化周期。取10ml上一次的培养物移至第二期的驯化培养基中，30℃、200r/min振荡培养2天，此为第二个驯化周期，以此类推，进行多次的驯化。
2、菌株初筛选：取上述驯化完成并培养了24h的菌液10ml，加入到含有90ml无菌生理盐水的锥形瓶中，按梯度稀释法分别将样品稀释成10-1～10-8的8种不同梯度的菌悬液，取1ml富集菌液进行NO2-N-显色试验，对出现红色反应的样品进行固体平板画线培养，得到纯种单菌落，划线平板为BTB筛选平板。初筛共挑选出6株显色明显的菌株进行下一步实验。
3、复筛与性能鉴定：以上6株单菌落克隆分别以5％的接种量将菌种接于装液量为100mL的250mL三角摇瓶中，37℃、180r/min摇床振荡培养，分别以氨氮(NH4 +-N)、硝酸盐(NO3 --N)和亚硝酸盐(NO2 --N)作为唯一氮源培养。定时期取样测定培养液中的氨氮(NH4 +-N)、硝酸盐(NO3 --N)和亚硝酸盐(NO2 --N)的浓度，通过分析总氮(TN)的去除率来判断菌株的硝化与反硝化性能。得到性能最佳的菌株命名为Klebsiella sp.KSND-3。
其中BTB液体培养基按下述比例配制：柠檬酸三钠5g；KNO3 2g；K2HPO4 1g；KH2PO41g；MgSO4 0.2g；微量盐溶液2ml；蒸馏水1000ml；1％BTB 1ml；pH7.0-7.2，所述BTB固体培养基在BTB液体培养基的基础上加入2％(w/v)的琼脂。
筛选培养基按下述比例配制：1000ml水中，葡萄糖5g；NH4Cl 2g；K2HPO41g；KH2PO41g；MgSO4 0.2g，微量盐溶液1ml，pH 7.2，115℃、湿热灭菌20min。
微量盐溶液：乙二胺四乙酸(EDTA)50g；ZnSO4 2.2g；CaCl2 5.5g；CuSO4·5H2O1.57g；MnCl2·4H2O 5.06g；FeSO4·7H2O 5g；CoCl2·6H2O 1.61g；蒸馏水1000ml；pH 7.0-7.2
其中Klebsiella sp.KSND-3以氨氮(NH4+-N)、硝酸盐(NO3--N)和亚硝酸盐(NO2--N)作为唯一氮源培养，总氮的去除率图见图1-图3。
结果表明，其中Klebsiella sp.KSND-3菌株具备很好的脱氮性能，且具备同步硝化反硝化功能，以氨氮为唯一氮源的情况下，100mg/L的起始氨氮在48h内总氮去除率达到93.1％以上；300mg/L的起始氨氮在48h内总氮去除率达到60.1％，且硝态氮和亚硝态氮几乎无积累；在以亚硝酸盐为唯一氮源的情况下，总氮去除率达到99％，无氨氮和硝酸盐累积。在以硝酸盐为唯一氮源的情况下，105mg/L的起始氨氮在48h内总氮去除率达到78％以上，无亚硝态氮积累。
实施例2
实施例二脱氮菌株分子生物学鉴定
采用杭州宝赛生物公司的微生物基因组提取试剂盒提取SD3的基因组DNA，并以此为模板扩增16S rDNA片段。鉴定引物为27f:AGAGTTTGATCCTGGCTCAG和1492R:GGTTACCTTGTTACGACTT。PCR反应体系(50uL)：模板DNA 1uL，2xPCR superpfu mix 25uL，27f和1492R引物各1uL，加无菌去离子水至反应体系为50uL。PCR程序：94℃5min，【94℃30s，55℃30s，72℃1min 30s】x30循环，72℃5min，4℃5min。PCR纯化后的回收产物送基因测序公司进行测序。获得SD3菌株的16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。经NCBI数据库同源性序列比对分析，结果表明，SD3菌株与Klebsiella sp的亲缘关系最接近，具有100％的同源度，系统发育进化分析也表明该菌株属于Klebsiella sp菌属。
实施例3
Klebsiella sp.KSND-3分批培养考察不同起始浓度下氨氧化细菌的氨氧化速率。实验在250ml锥形瓶初始PH＝7.8,30℃，150r/min进行，加入培养液、菌液，整个反应体积为100ml。NH4-N浓度依次设定为0mg/l、10mg/l、20mg/l、50mg/l、100mg/l、200mg/l、500mg/l，1000mg/l。为了防止氨氧化产生的酸度对细菌活性的影响，培养液含50mmol/L磷酸盐缓冲液。通过测定氨氮去除率来判断菌株的氨氧化能力，结果如图2所示，氨氮初始浓度在100mg/L以下，24h内氨氮的去除效率高达90％以上；即使氨氮初始浓度高达200mg/L，24h内氨氮的去除效率仍然可保存70％以上，中间无亚硝态氮积累，菌株对于高氨氮(200-600mg/L)的去除能力达到30％，因此该菌株对氨氮初始浓度200mg/L以下具有很好的脱氮效果,在较高初始氨氮浓度下去除能力达到30％左右。
实施例4
碳氮比对Klebsiella sp.KSND-3脱氮性能的影响
除氨氮功能菌分批培养考察不同碳氮比下氨氧化细菌的氨氧化速率。实验在250ml锥形瓶初始PH＝7.8,30℃，150r/min，氨氮初始浓度在100mg/L进行，加入培养液、菌液，整个反应体积为100ml，结果如图3所示，碳氮比在8以上时，24h内氨氮的去除效率高达80-95％。
虽然本发明已由较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟知此技艺者，在不脱离本发明的精神和范围内，可作些许的更动与润饰，因此本发明的保护范围当视权利要求书所要求保护的范围为准。
Figure IDA0001640773060000011
Figure IDA0001640773060000021

Claims (4)

1.克雷伯氏菌属菌株Klebsiella sp. KSND-3，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC M 2017542。
2.一种如权利要求1 所述的克雷伯氏菌属菌株 Klebsiella sp. KSND-3 在河道污水和农村含氨氮生活污水的脱氮处理中的应用。
3.如权利要求2 所述的应用，其特征在于，克雷伯氏菌属菌株Klebsiella sp.KSND-3在污水脱氮处理中，污水的碳氮比为大于或等于8。
4.如权利要求2 所述的应用，其特征在于，克雷伯氏菌属菌株Klebsiella sp.KSND-3在污水脱氮处理中，污水的pH 值为7-8。
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