CN110157637B

CN110157637B - 肠杆菌z1和克雷伯氏杆菌z2复合菌剂去除高氮污染废水及应用

Info

Publication number: CN110157637B
Application number: CN201910268671.9A
Authority: CN
Inventors: 王革娇; 张玉潇; 陈正军; 徐子啸; 刘德立; 袁永泽
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2019-04-04
Filing date: 2019-04-04
Publication date: 2021-03-16
Anticipated expiration: 2039-04-04
Also published as: CN110157637A

Abstract

本发明属于农业环境微生物应用技术领域，具体涉及肠杆菌Z1和克雷伯氏杆菌Z2复合菌剂去除高氮污染废水及应用。本发明分离、筛选自农药厂污泥中的肠杆菌Z1(保藏编号为CCTCC NO:M2019147)和克雷伯氏杆菌Z2(保藏编号为CCTCC NO:M2019146)的复合菌剂，该复合菌剂具有去除高氮污水中氮素的能力，上述分离株组成的复合菌剂具有比其他菌株更彻底的脱氮能力，在工业废水和养殖废水中得到了实际应用，可作为高氮污染水体中氮环境修复的微生物菌剂。

Description

肠杆菌Z1和克雷伯氏杆菌Z2复合菌剂去除高氮污染废水及应用

技术领域

本发明属于农业环境微生物应用技术领域，具体涉及肠杆菌Z1和克雷伯氏杆菌Z2复合菌剂去除高氮污染废水及应用。这两株分离株能通过连续的硝化作用-反硝化作用同时去除废水中氨氮、硝态氮和亚硝态氮。本发明还涉及分离株在去除水体高浓度氮方面的用应用。

背景技术

随着近年来产业化的迅速发展，各种产业排放出大量含有高浓度氮素(nitrogen)的污水，例如焦炭生产废液，制革厂废液，纺织品废液和垃圾渗透液。这些污水造成了一系列严重的环境影响，高浓度的氮可以直接导致自然环境中的水体严重恶化，并对人类的健康造成了潜在的威胁。

为了解决氮积累对水体和环境造成的污染，人们设计出了多种去除水体氮的方法。物理化学法有折点氯化法、空气吹脱法、化学沉淀法、液膜法、电渗析氨氮法、催化湿式氧化法、土壤灌溉法、循环冷却水系统脱氨法。但物理化学方法存在耗时长，效率低，费用高，产生二次污染物等弊端。近年来，生物脱氮法由于低能且不产生二次污染等优势得到了越来越高的关注，目前最普遍的方法是通过好氧条件下的自养硝化作用和厌氧条件下的异养反硝化作用，但是传统的去除方法存在很多弊端，例如自养硝化作用的速率往往很低，需要扩大反应器的体积从而达到好氧和厌氧之间的转换等等。与此同时，自养性硝化细菌对高浓度的氨氮和有机物十分敏感，这就大大降低了高浓度氮素污水中这些菌群对氮素的去除效率。为了克服以上种种不足，近年来一些新型的生物氮去除机制被发展和应用，主要包括不完全的硝化作用，好氧条件下的反硝化作用，厌氧氨氧化并将各个机制结合起来进行氮素的去除。

Robertson等自1983年首次提出异养硝化-好氧反硝化理论，并分离出一株具有异养硝化-好氧反硝化能力的菌株：副球菌Paracoccus pantotrophus。目前，硝酸盐-氧气共代谢理论用于解释异养硝化-好氧反硝化理论，即菌株利用反应体系中过剩的还原力合成聚β羟基丁酸，在合成代谢过程中解决了氧气对电子的竞争抑制作用，并通过调节电子传递过程中细胞色素c和细胞色素aa3之间的传递，使电子传递给反硝化酶系，从而完成了好氧条件下的反硝化作用。异养硝化-好氧反硝化机制实现了有机质和氮素同时去除，解决了自养去氮过程中对高浓度有机质的敏感性；同时异养硝化-好氧反硝化菌具有丰富多样的代谢途径，使其在不良环境中也能积极摄取电子传递给反硝化酶系，促进氮素的去除过程。对于应用而言，去除氮素的硝化过程和反硝化过程可以在同一反应环境下完成，大大节约了反应池的占地面积。近年来，研究报道了一系列能进行好氧硝化-异养反硝化作用的菌株，例如农杆菌Agrobacterium sp.，拉乌尔菌Raoultella sp.，产碱杆菌Alcaligenesfaecalis，副球菌Paracoccus versutus。这些菌株均能在200mg/L氨氮环境中生长，但提高氨氮浓度后菌株的去除能力将有大幅降低。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的缺陷，通过分离、筛选得到两株细菌能在单独培养和复合培养条件下去除高浓度氨氮污染水体中的氮素，且复合培养的去除能力更高,通过该菌剂的推广应用，可净化工业废水和养殖废水中高含量的氮素。

本发明的肠杆菌Z1和克雷伯氏杆菌Z2是两株能通过异养硝化-好氧反硝化作用去除水体中的氨氮，硝态氮和亚硝态氮，且两者复合培养后能提高去除能力。因此上述两株分离株将在氮素严重污染的水体中具有巨大潜能。

具体地，本发明通过以下技术方案实现：

本发明人在湖北省荆州市分离、筛选到两株新型异养硝化-好氧反硝化菌，菌株被命名为肠杆菌Z1和克雷伯氏杆菌Z2，分别属于肠杆菌属(Enterobacter sp.)和克雷伯氏杆菌属(Klebsiella sp.)，其中所述的肠杆菌Z1，Enterobacter sp.Z1，于2019年3月15日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为CCTCC NO:M2019147；克雷伯氏杆菌Z2，Klebsiella sp.Z2于2019年3月15日中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为CCTCC NO:M2019146。

分离菌株的筛选验证方案见图1。由图1，本发明先采集中国湖北省荆州市沙市某农药厂的沉积物污泥，加一定浓度(见后面的详细描述，下同)NH⁴⁺进行富集培养，再对富集培养的土样进行稀释并涂布含有一定浓度NH⁴⁺的LB固体培养基平板，培养长出氨抗性菌，挑取不同形态的菌落划线得单克隆，再用纳氏试剂紫外分光光度法(APHA,1998.StandardMethods for the Examination of Water and Wastewater,20^th ed.American PublicHealth Association,Washington,DC.)检测能去除氨氮的菌株。在此基础上，在基础培养基中继续验证该菌株对硝态氮(紫外分光光度法)和亚硝态氮(格里斯试剂分光光度法)的去除能力。对检测出的能去除氮素的菌株做16S核糖体RNA基因(即16S rDNA)、形态学和基因组分析等相关鉴定工作，最终得到肠杆菌Z1和克雷伯氏杆菌Z2。

本发明的积极效果：

近年来，工业废水中高浓度氮的去除得到了大家的重视，目前也有发明报道了在低浓度或较高浓度氨氮(<200mg/L)存在的废水中一些菌株能有效进行脱氮作用，但在高浓度氮素环境中(例如>500mg/L)能脱氮的微生物仍未见报道。本发明筛选到的菌株能有效迅速地去除培养基中额外加入的氮素和自然水体中高浓度的氮素。且两株菌在复合培养的条件下能促进反应体系中氮素的去除，尤其能促进亚硝态氮的去除作用。在处理伴随有机质污染的养殖废水中，上述菌株能在去除氮素的同时降解有机质，从而降低水体的COD。本发明的肠杆菌Z1和克雷伯氏杆菌Z2有望在工业废水、养殖废水等极高浓度氨氮环境下生长并去除氮素，在净化水体中发挥重要作用。

目前，相关的研究报道了微生物可以通过异养硝化-好氧反硝化作用去除水体中的N。将本发明与已申请专利的具有去除水体氮素能力的菌株进行比较，其对比效果如表1所示。

表1利用微生物通过异养硝化-好氧反硝化作用去除水体中的N

附图说明

图1：本发明的总体技术路线图。

图2：本发明的肠杆菌Z1和克雷伯氏杆菌Z2的扫描电镜照片。附图标记说明：放大倍数和比例尺在图中已标明。

图3：本发明的肠杆菌Z1和克雷伯氏杆菌Z2的系统发育进化树。

图4：本发明的肠杆菌Z1和克雷伯氏杆菌Z2复合培养在不灭菌工业电镀废水和养殖废水中中培养的无机氮离子去除曲线图及养殖废水中的COD降解曲线图。

图5：在间歇式循环中，本发明的肠杆菌Z1和克雷伯氏杆菌Z2复合培养在不灭菌工业电镀废水中培养的无机氮离子去除曲线图。

图6：在间歇式循环中，本发明的肠杆菌Z1和克雷伯氏杆菌Z2复合培养在不灭菌养殖废水中中培养的无机氮离子去除曲线图。

具体实施方式

对序列表的说明：

序列表SEQ ID NO:1是本发明分离的肠杆菌Z1和克雷伯氏杆菌Z的16S rDNA序列。

实施例1：从湖北省荆州市沙市区地下沉积物中分离肠杆菌Z1和克雷伯氏杆菌Z2

(1)样品采取：2010年5月采集湖北省荆州市沙市取富含硝酸根的Cr(VI)污染的沉积物湿土。

(2)样品富集：精确称取土样100g于250mL灭菌三角瓶中，加5mL 500mM的氯化铵NH₄Cl(NH₄ ⁺)，轻轻搅匀置28℃温箱中培养一周，注意补加氨氮和无菌水，确保样品不干。

(3)菌株分离：精确称取NH₄ ⁺富集土样10g于装有90mL无菌生理盐水的三角瓶中，置28℃摇床中振荡一小时，取出静置两小时，再依次取1mL到9mL无菌生理盐水中逐步稀释至10^-3、10^-4、10^-5，分别取0.1mL涂布含5mM NH₄ ⁺的BM固体培养基平板，每个稀释度涂布3个平板，置28℃温箱中培养一周，长出的菌株为氨抗性菌，将平板置4℃冰箱中保存待用。BM液体培养基配方如下(以1L体积计)：柠檬酸钠4.9g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，NaH₂PO₄·H₂O 0.5g，CaCl₂·2H₂O 0.1g，K₂HPO₄ 0.5g。将培养基各成分按比例称量溶解后在115℃高压蒸汽下灭菌30min。BM固体培养基成分与BM液体培养基的成分相同，只是BM固体培养基中需要额外添加1.7％的琼脂。

(4)划线分离：将步骤(3)中得到的氨抗性菌挑取不同形态的菌落划线得到单克隆。划线用R2A培养基平板，待菌长出后用甘油管保藏至-80℃冰箱。R2A培养基配方如下(1L)：酵母粉0.5g，可溶性淀粉0.5g，蛋白胨0.5g，磷酸氢二钾0.3g，酪蛋白氨基酸0.5g，丙酮酸钠0.3g，葡萄糖0.5g，MgSO₄·7H₂O 0.05g。在121℃高压蒸汽下灭菌20min。

(5)筛选具有氨氮去除能力的菌株：将步骤(4)中得到的单克隆转接到BM液体培养基中，补加终浓度为5mM的NH₄ ⁺，置28℃摇床中振荡培养，每4小时取2mL菌液检测OD600，分别在OD600长至0.5和1.0左右时检测反应体系中各种形态氮的去除情况。

具体步骤如下：

氨氮的测定：取1.5mL纳氏试剂(称取16g氢氧化钠，溶于50mL水中并充分冷却至室温。另外称取7g碘化钾和10g碘化汞溶于水，将后者边搅拌边徐徐注入氢氧化钠溶液中，用水稀释至100mL，贮于聚乙烯瓶中，密封保存)，再补加30μL上述培养的BM上清液，静置10min后在425nm处读数，根据标曲换算此时反应体系中剩余的氨氮含量，若氨氮比起始减少，则证明菌株具有去除氨氮的能力。

硝态氮的测定：取1.5mL上述培养的BM上清液，加入150μL盐酸调至微酸性条件后加入氨基磺酸(消除亚硝态氮的干扰)，分别在220nm和275nm处测定吸光度，两者差值可以线性计算硝态氮的含量。

亚硝态氮的测定：取500μL上述培养的BM上清液，加入500μL对氨基苯磺酸钠，再补加500μLα-萘乙二胺。将反应液混匀后在540nm处检测吸光度，吸光度可以定量计算出亚硝酸根的含量。

总氮的测定：取10mL上述培养的BM上清液，加入5mL碱性过硫酸钾，将混合液在高压蒸汽灭菌锅中121℃放置10min，取出反应液后分别在220nm和275nm处测定吸光度，两者差值可以计算总氮的含量。

(6)具有去除水体N能力的分离菌株的分类鉴定：一是利用16S rDNA鉴定，即采用原核生物16S rDNA通用引物27F(5'AGAGTTTGATCMTGGCTCAG3')和1492R(5'GGYTACCTTGTTACGACTT3')进行PCR扩增(具体PCR方法参考本申请人授权专利，专利号ZL2005101205847，授权公告日2008年7月31日，专利名称“一种土壤总DNA小量快速提取方法”文献并测序，再与NCBI GenBank(www.ncbi.nlm.nih.gov)核苷酸数据库进行比对，核苷酸同源性为99％，通过构建系统发育进化树(见图3)鉴定将分离株分别命名为肠杆菌Z1，Enterobacter sp.Z1以及克雷伯氏杆菌Z2，Klebsiella sp.Z2；二是利用透射电镜进行形态学鉴定(图2)和革兰氏染色分析和生长特性鉴定。

分离株的形态学特征如下：

肠杆菌Z1和克雷伯氏杆菌Z2均为兼性厌氧菌，革兰氏阴性，菌体呈杆状，最适生长温度为28℃，最适生长pH为8-9，肠杆菌Z1长0.9-2.0μm，宽0.4-0.6μm；克雷伯氏杆菌Z2长1.1-2.3μm，宽0.5-0.8μm。

肠杆菌Z1(Enterobacter sp.)和克雷伯氏杆菌Z2(Klebsiella sp.)的保藏方法如下：

上述分离的菌株可以在常规LB、R2A和BM液体培养基或固体培养基上良好生长，菌株最适宜培养温度为28℃下，可在4℃下作短期保藏。若长期保藏，可使用常规的甘油冷冻管或冷冻干燥管保藏法保藏菌株(具体方法参考：赵斌，何绍江编著，微生物学实验，第一版，科学出版社，北京，2002：202－205)。

实施例2：肠杆菌Z1和克雷伯氏杆菌Z2在BM培养基中对额外加入氮素的去除曲线

挑取肠杆菌Z1和克雷伯氏杆菌Z2菌株的单克隆接种到100mL的BM液体培养基，于28℃摇床中振荡培养至OD₆₀₀为0.5左右，将其作为种子液，以1％的接种量(复合培养条件下这两个菌株分别以0.5％的接种量接种)接种于新鲜的100mL BM液体培养基(起始OD ₆₀₀值<0.01))并分别向培养基中添加5mM的NH₄ ⁺，NO₂ ^-，NO₃ ^-。将其置于28℃摇床中振荡培养。每隔6小时取样一次。12000rpm离心2min后测定上清液中各种形态氮的含量变化。测定步骤见实施例1。

由表2可以看出，上述两菌株均能在以各种无机氮离子作为唯一氮源的BM培养基中生长且能有效去除反应体系中的各种无机氮离子。在加入硝态氮的反应体系中，氮素主要以反硝化作用去除，反应体系中始终没有氨氮的产生。在加入氨氮的反应体系中，氮素通过异养硝化-好氧反硝化作用去除，氨氮在6h被迅速去除99％以上；反应体系中有硝态氮部分积累和去除的过程，体系中没有明显亚硝态氮的积累。在加入亚硝态氮的反应体系中，复合培养条件下亚硝态氮被去除率为75％，反应过程中没有氨氮和硝态氮的积累。

表2培养基和废水培养条件下单菌和复合菌剂对氮素的去除

实施例3：肠杆菌Z1和克雷伯氏杆菌Z2在自然高浓度N污染水体中对各种无机氮离子的去除曲线以及降低养殖废水中的化学需氧量COD的效果

本发明采用两种高浓度N污染水体，水体性质见表3

表3本发明采用的两种废水的基本性质

具体步骤如下：准备250mL三角瓶，装入100mL自然水体(不需要灭菌)，每瓶补加培养菌体，分成三个试验组：接种肠杆菌Z1(种子液OD₆₀₀为0.5左右，1％的接种量)，接种克雷伯氏杆菌Z2(种子液OD₆₀₀为0.5左右，1％的接种量)，接种肠杆菌Z1和克雷伯氏杆菌Z2(种子液OD₆₀₀为0.5左右，0.5％的接种量)。置28℃摇床中振荡培养。每隔2小时取一次样测水体中各种无机氮离子的去除情况。此外，按照上面所述设置同样的实验组，额外加入对照实验组如下：准备250mL三角瓶，装入100mL水样，不接入本发明筛选的菌株，置28℃摇床中振荡培养。每隔2小时取一次样测定各体系的化学需氧量COD含量。COD的含量采取重铬酸钾分光比色法进行测定。具体方法如下：在专用消解管中加入0.1g Hg₂SO₄固体，再分别加入3mL样品，0.75mL1.0 mol/L重铬酸钾标准溶液，2.75mL硫酸-硫酸银溶液(75:1)。将反应液混匀后148℃加热2h进行消解。冷却后在620nm处测定吸光度，并根据标曲计算COD值。

由图4可以看出，分离株复合培养在工业电镀废水(图4中的A图-D图)和养殖废水(图4中的E图-H图)中均能有效去除氮素。在工业电镀废水中，复合培养条件下分离株对氨氮和总氮的去除率能达到96.98％--99.9％(见图4中的A图)，反应体系中硝态氮有部分积累后被完全去除(图4中的B图)，亚硝态氮始终没有明显的积累(图4中的C图)。在养殖废水中，复合培养条件下分离株对氨氮和总氮的去除率能达到98.77％(见图4中的E图)和98.94％(图4中的G图)，反应体系中水体自身的硝态氮先被去除，证明硝化作用和反硝化作用是同步进行的。当水体自身硝态氮被去除后由于氨氮的大量去除，硝态氮有部分积累，反应后期积累的硝态氮也被去除(图4中的F图)。养殖废水本身含有极高的COD值，在分离株去除氮素的过程中，伴随着COD的降解(图4中的H图)。

接下来，本发明筛选的分离株对水体中氮素的循环去除能力进行检测。设计了间歇式循环试验方法。具体步骤如下：设置如上所述同样的试验组，每隔1h取一次样。由于单周期去除曲线中0-5h分离株有最强的去除速率，因此选择5h后将分离株的菌液离心收集菌体(5000rpm，10min)，用生理盐水(0.85％NaCl)洗涤菌体两次，重悬进新的100mL废水中，放置在28℃振荡培养。重复上次操作进行五个循环，取样检测反应体系中各种无机氮离子的含量和去除情况。由图5和图6可知，分离株在五个循环内均对水体中氮素有明显的去除作用。在工业电镀废水中(图5)，分离株在每个循环中均能在5h内将氨氮去除95％以上(见图5中的A图)，且前三个周期去除率不断提高。反应体系中亚硝态氮没有明显的积累(图5中的B图)，硝态氮存在着先部分积累后完全去除的趋势(图5中的C图)。复合培养条件下对反应体系中的氮素去除有明显的促进作用。在养殖废水中(图6)，分离株在每个循环中均能在5h内将氨氮去除90％以上(图6中的A图)，且第三个循环下氨氮的去除率最高，达到99％。反应体系的第一个循环下，分离株先将水体本身存在的硝态氮去除，随着氨氮的大量去除又有部分硝态氮的积累，后期几乎被完全去除，这与单周期条件下分离株在养殖废水中对硝态氮的去除情况一致。在随后的四个周期中，硝态氮不在前期有明显的积累，推测是此时分离菌株活性达到最高，反硝化途径的酶活性完全被激活的原因(图6中的B图)。复合培养条件下对反应体系中的氮素去除有明显的促进作用(图6中的C图)。

综上所述，本发明分离的肠杆菌Z1和克雷伯氏杆菌Z2即使在起始浓度很低的条件下，其依然能在高浓度N存在的自然水体中去除各种形态氮离子，说明分离株肠杆菌Z1和克雷伯氏杆菌Z2在低营养或高营养、单一存在或与其它微生物共存的情况下均对通过异养硝化-好氧反硝化作用去除水体中的氮素，且两株菌株复合培养的条件下对氮素的去除作用有明显的促进，并在一定程度上能降低污染区的COD，显示本发明具有较好的应用前景。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 肠杆菌Z1和克雷伯氏杆菌Z2复合菌剂去除高氮污染废水及应用

<141> 2018-04-03

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1445

<212> DNA

<213> 肠杆菌属(Enterobacter sp.)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(1445)

<400> 1

gggcatgcgg cagctacaca tgcaagtcga acggtaacag gaagcagctt gctgctttgc 60

tgacgagtgg cggacgggtg agtaatgtct gggaaactgc ctgatggagg gggataacta 120

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<211> 1405

<212> DNA

<213> 克雷伯氏杆菌(Klebsiella sp.)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(1405)

<400> 2

agcgccctcc cgaaggttaa gctacctact tcttttgcaa cccactccca tggtgtgacg 60

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tccatcaggc agtttcccag acattactca cccgtccgcc gctcgtcacc cgagagcaag 1380

ctctctgtgc taccgctcga cttgc 1405

Claims

1.一种分离的脱氮的肠杆菌（Enterobacter sp.）Z1，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO: M2019147。

2.一种分离的脱氮的克雷伯氏杆菌（Klebsiella sp.）Z2，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO: M2019146。

3.如权利要求1所述的肠杆菌（Enterobacter sp.）Z1和/或权利要求2所述的克雷伯氏杆菌（Klebsiella sp.）Z2在制备除氮菌剂中的应用。