CN107513508B - 一种肠杆菌及其在净化水体方面的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种肠杆菌及其在净化水体方面的应用。所述肠杆菌编号为YWH‑5，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2017年1月16日，保藏编号为CGMCC No.13631。利用本发明所述肠杆菌YWH‑5，粘附于硅基多孔填料表面生长，并投放于人工湿地后，可在低温下，高效的吸附降解黑臭水体有机物，净化水质，工艺流程无需额外提供电能，运营成本低，处理有效且稳定。

Description

一种肠杆菌及其在净化水体方面的应用
技术领域
本发明涉及水体净化微生物，具体地说，涉及一种肠杆菌及其在净化水体方面的应用。
背景技术
随着经济的快速发展和城市化的加快，我国许多城市河流水质污染和生态退化问题十分突出，甚至出现了季节性和常年性水体黑臭现象。现有黑臭水体治理方式主要采用植物净化和曝气治理为主，净化负荷低，治理过程需要额外电能投入，运营成本高。近年来，不需额外电能投入即可实现较好净化处理的人工湿地技术被较多的运用于黑臭水体治理，取得了较好的处理效果。然而，我国偏北方部分地区，冬季水温较低，在低温下，人工湿地的净化效能较差，因而急需开发新技术实现冬季条件下强化人工湿地的水体净化能力。
发明内容
为了解决现有人工湿地技术冬季水体净化能力弱的问题，本发明的目的是提供一种肠杆菌及其在低温下与人工湿地联合净化水体方面的应用。
为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：
第一方面，本发明提供了一种肠杆菌，经鉴定为肠杆菌属(Enterobacter sp.)，编号YWH-5，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，保藏日期为2017年1月16日，保藏编号为CGMCC No.13631。
该菌株具有低温下有效吸附、降解黑臭水体中有机物的功能。
本发明进一步提供了所述肠杆菌YWH-5在净化水体中的应用。
优选地，在净化水体时系统温度为5-40℃，优选为10℃。
第二方面，本发明提供了一种用于净化水体的微生物菌剂，其含有所述肠杆菌YWH-5。进一步地，所述菌剂中肠杆菌YWH-5的数量不小于108CFU/mL。
第三方面，本发明提供了一种净化水体的方法，所述方法包括如下步骤：
S1、将待净化水体通入搭建好的人工湿地；
S2、在人工湿地表面敷设硅基填料；
S3、将所述肠杆菌YWH-5富集培养后，接种至硅基填料层；
S4、人工湿地以温度5-40℃(优选10℃)运行，水力停留2-4小时；在这个过程中，肠杆菌会在填料层内繁殖生长，并完成水体有机物降解过程；
S4、人工湿地出水，得到净化水体。
进一步地，所述硅基填料为市售硅基多孔填料，厚度≥10cm。
作为优选，步骤S3中，肠杆菌YWH-5的添加量相对于填料体积约2×1011-4×1011CFU/M3。
进一步地，步骤S3中，所述富集培养的方法为将所述肠杆菌YWH-5接种入富集培养基中，在5-40℃(优选10℃)的培养温度下，100rpm摇床培养至菌液浓度达到≥108CFU/mL。
作为优选，所述富集培养基的配方为：0.5g/L乳酸钠，0.5g/L葡萄糖，0.1g/L氯化钙，0.05g/L磷酸氢二钾，0.5g/L硫酸氨，1000mL蒸馏水，pH＝7.0。配置时将各成分混合均匀，调pH＝7.0，121℃下灭菌25分钟。
所述富集培养基还可用于分离培养如上所述肠杆菌，作为分离培养基时，在配置时将配方中成分混合均匀后加入30g/L结冷胶，调pH＝7.0，121℃下灭菌25分钟后倒平板。
作为优选，本发明所述方法对COD>40mg/L、总氮>15mg/L、总磷>1mg/L的易缺氧黑臭的水体具有较佳的净化效果。
进一步地，在利用本发明所述肠杆菌YWH-5处理高浓度难降解有机污水时，可以向所处理污水中复配生物营养制剂，以满足本发明的菌种的生长需要。
更进一步地，所述肠杆菌YWH-5通过生长于载菌填料上并与人工湿地相结合，上述工艺流程无需额外提供电能，对黑臭水体有机物降解效率高，运营成本低，处理有效且稳定。
本发明所述的肠杆菌YWH-5具有对城市黑臭水体适应性强、生物稳定性好等特点。它们不仅可以有效地降低污水的COD，其最大优势是能够在低温(<10℃)条件下对污水进行处理，仍然具有良好的微生物活性。在本发明的一个实施例中，利用该菌种进行生化现场实验，与人工湿地配合运行180天，微生物生长良好，系统出水稳定。
本发明的有益效果在于：
本发明新分离出一种肠杆菌，可有效的在低温下吸附降解黑臭水体有机物，净化水质。此外，人工湿地系统及硅基填料可以为该菌种提供适宜的生长环境，上述工艺流程无需额外提供电能，对黑臭水体有机物降解效率高，运营成本低，处理有效且稳定。
附图说明
图1为本发明所述肠杆菌YWH-5的扫描电镜照片。
图2为本发明实施例2所述的人工湿地示意图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
用于分离培养上述肠杆菌的培养基(简称：分离培养基)，配方为：
0.5g/L乳酸钠，0.5g/L葡萄糖，0.1g/L氯化钙，0.05g/L磷酸氢二钾，0.5g/L硫酸氨，1000mL蒸馏水，结冷胶30g/L。
配置时将结冷胶以外的成分混合均匀后加入结冷胶，调pH7.0，121℃下灭菌25分钟。按上述比例配置100ml培养基，每20mL倒一块平板。
用于富集培养上述肠杆菌的培养基(简称：富集培养基)，配方为：0.5g/L乳酸钠，0.5g/L葡萄糖，0.1g/L氯化钙，0.05g/L磷酸氢二钾，0.5g/L硫酸氨，1000mL蒸馏水。
配置时将各成分混合均匀，调pH7.0，121℃下灭菌25分钟。
实施例1菌株的筛选与鉴定
1、筛选
1)在100mL含所述肠杆菌泥样中加入0.3g酵母粉，在10℃摇床100rpm轻轻震荡富集培养1周，利用显微镜检测判断细菌生长情况；泥样取自济南腊山河。细菌生长至测量细菌培养液在600nm处的吸光值，得到的OD600的数值如果在0.6-0.8之间。
2)采用膜过滤将上述培养液中的细菌过滤，并将细菌用20mL无菌水洗下。以5％的接种量分别接种于多个100mL富集培养基中，温度10℃进行培养，并设置不接种对照(CK)。100rpm摇床培养两周后观察细菌生长情况。
3)将富集培养基液梯度稀释1、2、3、4、5(分别对应10-1，10-2，10-3，10-4，10-5)，分别取100μL稀释液涂布在分离培养基配制的平板上，10℃培养三天。挑单菌落进行进一步平板划线，分离得到单菌落。挑取单菌落后，转入新的固体培养基平板中，利用平板划线分离法继续进行分离培养，直至获得单菌落。
2、鉴定
通过菌株形态观察和理化指标分析，挑选出10株菌株进行实验室内的低温下(10℃)黑臭水体处理实验，实验水体为1000mL，处理前水中氨氮为15±2mg/L、总氮为50±2mg/L和COD为300±3mg/L，实验接菌量为2×108CFU/mL，25℃摇床培养15h。
编号为YWH-5的菌株处理污水的综合效果最佳。经肠杆菌YWH-5菌株处理15h后，污水中化学需氧量(COD)、总氮(TN)和总磷(P)的去除率分别达到90％、90％和80％，其净化水体的能力最强。
YWH-5菌株的菌体细胞呈短杆状，大小为2μm×1μm。无鞭毛的革兰氏染色阴性直杆菌。菌落近似圆形，表面光滑。
用16S rDNA克隆文库技术分析鉴定菌种YWH-5。将1mL菌液离心得到菌泥，提取总DNA，利用PCR技术以原核生物通用引物530f和1490r扩增16S rDNA片段。PCR产物纯化后与Promega的T-easy载体连接，转化大肠杆菌DH5α。挑取的白色菌落通过菌落PCR确定阳性菌落，经酶切分型，对4个克隆测序。所得序列经Blast比较表明，该菌株为Enterobacter属细菌，命名为肠杆菌(Enterobacter sp.)YWH-5。将该菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，保藏日期为2017年1月16日，保藏编号为CGMCC No.13631。
实施例2低温下净化水体
1、将典型黑臭水体(济南腊山河黑臭水体)通入控温人工湿地(温度为10℃)，该湿地表面填充市售硅基多孔填料，厚度≥10cm。
该废水水质如下：pH7.0；化学需氧量(COD)，55mg/L；总氮(TN)，20mg/L，总磷(P)，2mg/L。
2、将实施例1经鉴定的肠杆菌YWH-5的菌种，接种在富集培养基中10℃摇床100rpm培养至菌浓度为108CFU/mL；然后将菌液(也可称作菌剂，同发明内容中所述菌剂)接种至硅基填料内，接种量为3L/m3。水力停留时间3小时；
3、人工湿地出水为最终出水；
5、整个系统连续运转30天，出水水质分析如下：化学需氧量(COD)去除率85％，总氮(TN)去除率90％，总磷(P)去除率75％。
本发明提供的处理黑臭水体的方法，通过将该菌粘附于硅基填料上生长，并将硅基填料覆盖于如图2所示的人工湿地表面，在肠杆菌菌种的吸附降解作用下，黑臭水体可获得有效处理。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (11)

1.一种肠杆菌（Enterobacter sp.）YWH-5，其保藏编号为CGMCC No. 13631。
2.权利要求1所述的肠杆菌YWH-5在净化水体中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，在净化水体时系统温度为5-40℃。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，在净化水体时系统温度为10℃。
5.一种用于净化水体的微生物菌剂，其特征在于，其含有权利要求1所述的肠杆菌YWH-5。
6.根据权利要求5所述的微生物菌剂，其特征在于，所述菌剂中肠杆菌YWH-5的数量不小于108CFU/ mL。
7.一种净化水体的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
S1、将待净化水体通入搭建好的人工湿地；
S2、在人工湿地表面敷设硅基填料；
S3、将权利要求1所述的肠杆菌YWH-5富集培养后，接种至硅基填料层；
S4、人工湿地以温度5-40℃运行，水力停留2-4小时；
S5、人工湿地出水，得到净化水体。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，人工湿地表面敷设硅基填料厚度≥10cm；和/或，
步骤S3中，肠杆菌YWH-5的添加量相对于填料堆积体积为2×1011-4×1011CFU/m3。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，S2中，所述富集培养的方法为将所述肠杆菌YWH-5接种入富集培养基中，在10℃的培养温度下，摇床培养至菌液浓度达到≥108CFU/mL。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述富集培养基的配方为：0.5g/L乳酸钠，0.5g/L葡萄糖，0.1g/L氯化钙，0.05g/L磷酸氢二钾，0.5g/L硫酸氨，1000mL蒸馏水，pH=7.0。
11.根据权利要求7、8、10任一项所述的方法，其特征在于，所述待净化水体为COD>40mg/L、总氮>15mg/L、总磷>1mg/L的易缺氧黑臭的水体。
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