CN112574916A - N-甲基吡咯烷酮降解菌及在废水处理中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于环境有机污染物生物处理技术领域，公开了N‑甲基吡咯烷酮降解菌及在废水处理中的应用。本发明以长期用于处理N‑甲基吡咯烷酮的活性污泥为菌源，以N‑甲基吡咯烷酮为唯一碳源的无机盐培养基作为筛选培养基，分离纯化得到一株能高效降解N‑甲基吡咯烷酮，同时进行反硝化脱氮的芽孢杆菌，保藏编号为CCTCC NO：M2020684。本发明的芽孢杆菌可以利用N‑甲基吡咯烷酮作为唯一电子供体进行缺氧反硝化脱氮反应，同步实现N‑甲基吡咯烷酮的矿化降解，具有高效的有机物降解能力和反硝化能力，适用于废水中高浓度硝态氮及难降解有机污染物的去除处理。

Description

N-甲基吡咯烷酮降解菌及在废水处理中的应用

技术领域

本发明属于环境有机污染物生物处理技术领域，涉及一种N-甲基吡咯烷酮降解菌及在废水处理中的应用。

背景技术

N-甲基吡咯烷酮(N-methylpyrrolidone，NMP)，也称为1-甲基-2-吡咯烷酮，是含氮杂环化合物中一种典型的有机极性溶剂，具有低挥发性、高极性和无腐蚀性等特点，用途覆盖了锂电池、粘合剂、颜料、染料和医药等诸多行业。由于N-甲基吡咯烷酮具有良好的水混溶性，极易随着废水排放到环境中。据报道，工业废水中N-甲基吡咯烷酮的含量常常高于10mM，每年有超过2400吨的N-甲基吡咯烷酮通过废水排放进入到自然环境中。然而，N-甲基吡咯烷酮结构稳定，可生化性差且具有较强的生物毒性，在自然界的水土环境中稳定性很强，不易在自然条件下被水解或光解，也不易被环境微生物所降解。未经处理达标的N-甲基吡咯烷酮废水一旦排放到环境中，必然会对生态环境及水域系统造成严重危害。

目前，含N-甲基吡咯烷酮废水的处理方法包括光催化法，臭氧氧化法等高级氧化法、膜分离法、生物处理法等。然而，高级氧化和膜分离等物理化学方法处理含N-甲基吡咯烷酮废水成本较高，极易造成二次污染。生物处理技术具有经济、高效、二次污染小等诸多优点，可实现工业废水的无害化治理，是应用最广的废水处理技术。但是，由于N-甲基吡咯烷酮的高生物毒性和结构稳定性，N-甲基吡咯烷酮废水生物处理的前提是获得能够耐受N-甲基吡咯烷酮生物毒性并能实现N-甲基吡咯烷酮矿化降解的特殊菌株。现有的可降解N-甲基吡咯烷酮的菌株，不仅降解周期较长、降解效率不高，还需在耗氧条件下培养，在实际应用中大大增加了耗电曝气等工艺运行成本。

经检索，中国专利申请号为2016100710813的申请案公开了一种N-甲基吡咯烷酮降解芽孢杆菌NMP-2及其应用，所用菌株经鉴定为芽孢杆菌(Bacillus)。主要生物学特性为G+，菌体为杆状，具有内生孢子，好氧生长。能以N-甲基吡咯烷酮为唯一碳源、氮源进行生长，并将其彻底矿化产生氨氮。该申请案的芽孢杆菌菌种虽然能够达到降解N-甲基吡咯烷酮的目的，然而仍需要在好氧条件下培养，应用成本较高。

考虑到含N-甲基吡咯烷酮的工业废水中通常含有较高浓度的硝酸盐，如能获得可以N- 甲基吡咯烷酮为电子供体、硝态氮为电子受体的反硝化脱氮菌株，在缺氧反硝化脱氮的同时实现N-甲基吡咯烷酮的高效降解，将对含N-甲基吡咯烷酮和硝态氮的工业废水的低成本和无害化处理产生重要意义。

发明内容

1.要解决的技术问题

针对现有技术中用于降解N-甲基吡咯烷酮的芽孢杆菌通常在好氧条件下进行降解反应，应用成本较高，本发明提供了一种能够在缺氧条件下能够高效降解N-甲基吡咯烷酮的芽孢杆菌(Bacillus pumilus)，该菌株可以利用N-甲基吡咯烷酮作为电子供体、硝态氮为电子受体高效降解N-甲基吡咯烷酮，同步实现反硝化脱氮的功能菌株。

2.技术方案

针对上述技术问题，本发明提供的技术方案如下：

发明人以长期用于降解N-甲基吡咯烷酮的活性污泥为菌源，利用以N-甲基吡咯烷酮作为碳源的筛选培养基，进行菌株的纯化分离，得到了一株可以利用N-甲基吡咯烷酮为电子供体进行反硝化的芽孢杆菌，经分子生物学鉴定为Bacillus pumilus，命名为Bacillus pumilus NJUST39。该菌株已于2020年11月06日在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏地址为中国武汉市武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M2020684。

所述芽孢杆菌的16S rRNA基因序列如SEQ ID NO:1所示(表1)。

所述芽孢杆菌的形态学、生理生化特征及分子生物学鉴定如下：

(2.1)形态学特征：NJUST39的菌落呈扁平状，表面粗糙不透明，微黄色，形态不规则，在液体培养基中程扩散性混浊。该菌株NJUST39的细胞呈杆状，尺寸为0.5～0.7μm×0.8～1.9 μm，图1为芽孢杆菌NJUST39的扫描电子显微镜照片。

(2.2)生理生化特征：革兰氏阳性菌，过氧化氢酶呈阳性，硝酸盐还原酶呈阳性。

(2.3)分子生物学鉴定：以NJUST39菌株的核DNA为模板，以细菌扩增的通用引物进行PCR扩增，测定菌株NJUST39的基因序列。将菌株的16S rRNA基因序列与GenBank数据库进行同源性比较，结果表明，NJUST39与Bacillus pumilus strain EE106-P2(MN581176.1)的序列相似度达99％以上。

优选的方案，本发明提供了所述芽孢杆菌的筛选方法，以长期用于降解N-甲基吡咯烷酮的活性污泥为菌源，进行菌株的分离、纯化、鉴定。

优选的方案，所述的芽孢杆菌的筛选方法，包括以下步骤：

1)从用于降解N-甲基吡咯烷酮的活性污泥中取样，加入至生理盐水中静置得到上清液；

2)将上清液加入至无机盐液体培养基，培养后涂布于无机盐琼脂培养基平板上，恒温培养、挑选单菌落纯化培养，得到单一菌株；

3)将单一菌株加入至含有N-甲基吡咯烷酮及硝态氮的无机盐液体培养基中进行缺氧培养，筛选能有效去除培养基中N-甲基吡咯烷酮和硝态氮的菌株。

优选的，菌株的筛选方法具体为：

从长期用于降解N-甲基吡咯烷酮的活性污泥中取样5g，加入到100mL无菌生理盐水 (0.85％氯化钠溶液)中，搅拌均匀后，静置两个小时。取1mL上清液加入到经121℃高温灭菌20分钟后的无机盐液体培养基中，180转/分钟摇床富集培养三天，连续三次富集后，取培养液用无菌生理盐水(0.85％氯化钠溶液)梯度稀释至10^-4-10^-10倍。制备无机盐琼脂固体培养基平板，取稀释后的培养液20μL，分别涂布于无机盐琼脂固体培养基平板上，置于生化培养箱中30～35℃恒温培养三天。挑选培养皿上具有明显差异的单菌落，采用平板划线分离的方法进行纯化培养，连续纯化五次后，得到单一菌株，进行斜面保存。

配制100mL含有N-甲基吡咯烷酮及硝态氮的无机盐液体培养基装入120mL血清瓶中，用纯氦气进行曝气以去除溶解氧，121℃高温灭菌20分钟后接种分离纯化得到的纯菌株，在恒温震荡培养箱中180转/分钟和30～35℃的条件下缺氧培养，监测N-甲基吡咯烷酮及硝态氮的浓度变化。选取能有效去除培养基中N-甲基吡咯烷酮和硝态氮的菌株，命名为NJUST39，将其进行斜面保存和-80℃低温保存。

LB培养基的组成如下：胰蛋白胨(10g L^-1)，酵母提取物(5g L^-1)，氯化钠(10g L^-1)。

无机盐培养基的组成如下：NaHPO₄·12H₂O(1.53g L^-1)，KH₂PO₄(0.38g L^-1)，MgSO₄·7H₂O (0.1g L^-1)，CaCl₂(0.05g L^-1)，微量元素溶液SL-4(10mL L^-1)。

微量元素SL-4组成：EDTA(0.5g L^-1)，FeSO₄·7H₂O(0.2g L^-1)，微量元素SL-6(100mL L^-1)。

微量元素SL-6组成：ZnSO₄·7H₂O(0.01g L^-1)，MnCl₂·4H₂O(0.03g L^-1)，H₃BO₄(0.3g L^-1)，CoCl₂·6H₂O(0.2g L^-1)，CuCl₂·2H₂O(0.01g L^-1)，NiCl₂·6H₂O(0.02g L^-1)，Na₂MoO₄·2H₂O (0.03g L^-1)，N-甲基吡咯烷酮和硝酸钠的量根据实验需要投加。

在液体培养基的基础上加入20g L^-1的琼脂，高压蒸汽灭菌锅121℃灭菌20分钟后，倒入无菌培养皿中冷却至室温后获得无机盐琼脂固体培养基平板。

优选的方案，本发明提供了所述的芽孢杆菌的培养方法，将所述芽孢杆菌接种至LB培养基培养，培养pH值为6.0～8.0，培养温度为30℃～35℃。可以进行好氧或缺氧培养。

优选的方案，所述LB培养基中含有N-甲基吡咯烷酮和硝酸钠，N-甲基吡咯烷酮和硝酸钠的摩尔比为(0.4～1.0)：1，和/或N-甲基吡咯烷酮浓度为4.7～13.6mM，硝酸钠浓度为9.9～27.2 mM。

优选的，N-甲基吡咯烷酮和硝酸钠的摩尔比为0.4：1。

优选的方案，本发明提供了所述的芽孢杆菌在降解N-甲基吡咯烷酮，和/或反硝化脱氮中的应用。

优选的方案，在上述应用中，将所述芽孢杆菌用于含N-甲基吡咯烷酮的废水处理。

优选的方案，所述废水中同时含有N-甲基吡咯烷酮及硝态氮。

优选的方案，应用过程中，将所述芽孢杆菌培养为种子液加入至含N-甲基吡咯烷酮的废水中，或将所述芽孢杆菌制备为菌剂加入至含N-甲基吡咯烷酮的废水中。

优选的方案，应用过程包括以下步骤：

1)将所述芽孢杆菌接种在含有N-甲基吡咯烷酮和硝酸钠的LB培养基中培养，培养基 pH为6.0～8.0，培养温度为30℃～35℃，得到种子液；

2)将种子液接种到含有硝态氮和N-甲基吡咯烷酮废水中，缺氧条件下培养，培养温度为30℃～35℃，培养pH为6.0～8.0。

优选的方案，所述步骤2)中种子液的接种量为4％～10％，和/或种子液的OD600为1.5～2.0。

优选的方案，本发明提供了一种含有上述芽孢杆菌的菌剂。

3.有益效果

本发明提供的芽孢杆菌Bacillus pumilus NJUST39，在缺氧反硝化条件下，可以利用N- 甲基吡咯烷酮作为电子供体，硝态氮为电子受体进行代谢和生长，同时具有高效的N-甲基吡咯烷酮降解能力和反硝化脱氮能力。相比于耗氧条件，Bacillus pumilusNJUST39对生存环境的适应能力和耐受能力更强，应用于工业废水的工艺处理中可减少耗氧曝气工段，节约经济成本。在含有N-甲基吡咯烷酮的模拟废水中加入芽孢杆菌Bacilluspumilus NJUST39进行处理，可以实现N-甲基吡咯烷酮和硝态氮同步的高效去除率。

附图说明

图1是芽孢杆菌Bacillus pumilus NJUST39的扫描电子显微镜图。

图2是芽孢杆菌Bacillus pumilus NJUST39在N-甲基吡咯烷酮初始浓度为12.0～13.6mM 的液体培养基中对N-甲基吡咯烷酮的降解效果图。

图3是芽孢杆菌Bacillus pumilus NJUST39在硝态氮初始浓度为25.0～27.2mM的液体培养基中对硝态氮的脱氮效果图。

图4是芽孢杆菌Bacillus pumilus NJUST39在不同进水pH条件下降解N-甲基吡咯烷酮同步反硝化脱氮的效果图。

具体实施方式

下面通过具体实施例和附图对本发明作进一步描述，使本领域技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

需要说明的是，本说明书中所引用的如“上”、“下”、“左”、“右”、“中间”等用语，亦仅为便于叙述的明了，而非用以限定可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容下，当亦视为本发明可实施的范畴。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同；本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

如本文所使用，术语“约”用于提供与给定术语、度量或值相关联的灵活性和不精确性。本领域技术人员可以容易地确定具体变量的灵活性程度。

如本文所使用，术语“......中的至少一个”旨在与“......中的一个或多个”同义。例如，“A、B 和C中的至少一个”明确包括仅A、仅B、仅C以及它们各自的组合。

浓度、量和其他数值数据可以在本文中以范围格式呈现。应当理解，这样的范围格式仅是为了方便和简洁而使用，并且应当灵活地解释为不仅包括明确叙述为范围极限的数值，而且还包括涵盖在所述范围内的所有单独的数值或子范围，就如同每个数值和子范围都被明确叙述一样。例如，约1至约4.5的数值范围应当被解释为不仅包括明确叙述的1至约4.5的极限值，而且还包括单独的数字(诸如2、3、4)和子范围(诸如1至3、2至4等)。相同的原理适用于仅叙述一个数值的范围，诸如“小于约4.5”，应当将其解释为包括所有上述的值和范围。此外，无论所描述的范围或特征的广度如何，都应当适用这种解释。

任何方法或过程权利要求中所述的任何步骤可以以任何顺序执行，并且不限于权利要求中提出的顺序。

实施例1

Bacillus pumilus NJUST39的筛选分离及鉴定。

(1)菌株的筛选及分离

从实验室长期用于降解N-甲基吡咯烷酮的活性污泥中取样5g，加入到100mL无菌生理盐水(0.85％氯化钠溶液)中，搅拌均匀后，静置两个小时。取1mL上清液加入到经121℃高温灭菌20分钟后的无机盐液体培养基中，180转/分钟摇床富集培养三天，连续三次富集后，取培养液用无菌生理盐水(0.85％氯化钠溶液)梯度稀释至10^-4-10^-10倍。制备无机盐琼脂固体培养基平板，取稀释后的培养液20μL，分别涂布于无机盐琼脂固体培养基平板上，置于生化培养箱中30～35℃恒温培养三天。挑选培养皿上具有明显差异的单菌落，采用平板划线分离的方法进行纯化培养，连续纯化五次后，得到单一菌株，进行斜面保存。

配制100mL含有N-甲基吡咯烷酮及硝态氮的无机盐液体培养基装入120mL血清瓶中，用纯氦气进行曝气以去除溶解氧，121℃高温灭菌20分钟后接种分离纯化得到的纯菌株，在恒温震荡培养箱中180转/分钟和30～35℃的条件下缺氧培养，监测N-甲基吡咯烷酮及硝态氮的浓度变化。选取能有效去除培养基中N-甲基吡咯烷酮和硝态氮的菌株，命名为NJUST39，将其进行斜面保存和-80℃低温保存。

LB培养基的组成如下：胰蛋白胨(10g L^-1)，酵母提取物(5g L^-1)，氯化钠(10g L^-1)。

无机盐培养基的组成如下：NaHPO₄·12H₂O(1.53g L^-1)，KH₂PO₄(0.38g L^-1)，MgSO₄·7H₂O (0.1g L^-1)，CaCl₂(0.05g L^-1)，微量元素溶液SL-4(10mL L^-1)。

微量元素SL-4组成：EDTA(0.5g L^-1)，FeSO₄·7H₂O(0.2g L^-1)，微量元素SL-6(100mL L^-1)。

微量元素SL-6组成：ZnSO₄·7H₂O(0.01g L^-1)，MnCl₂·4H₂O(0.03g L^-1)，H₃BO₄(0.3g L^-1)，CoCl₂·6H₂O(0.2g L^-1)，CuCl₂·2H₂O(0.01g L^-1)，NiCl₂·6H₂O(0.02g L^-1)，Na₂MoO₄·2H₂O (0.03g L^-1)，N-甲基吡咯烷酮和硝酸钠的量根据实验需要投加。

在液体培养基的基础上加入20g L^-1的琼脂，高压蒸汽灭菌锅121℃灭菌20分钟后，倒入无菌培养皿中冷却至室温后获得无机盐琼脂固体培养基平板。

(2)菌株的鉴定

对菌株进行形态学、生理生化测试。测定菌株的16S rRNA基因序列，将菌株的16SrRNA 基因序列与GenBank数据库中的基因序列进行同源性比较并分析结果，从分子生物学水平上确定该菌的种属。

(2.1)形态学特征：NJUST39的菌落呈扁平状，表面粗糙不透明，微黄色，形态不规则，在液体培养基中程扩散性混浊。该菌株NJUST39的细胞呈杆状，尺寸为0.5～0.7μm×0.8～1.9 μm，图1为芽孢杆菌NJUST39的扫描电子显微镜照片。

(2.2)生理生化特征：革兰氏阳性菌，过氧化氢酶呈阳性，硝酸盐还原酶呈阳性。

(2.3)分子生物学鉴定：以NJUST39菌株的核DNA为模板，以细菌扩增的通用引物进行PCR扩增，测定菌株NJUST39的基因序列。将菌株的16S rRNA基因序列与GenBank数据库进行同源性比较，结果表明，NJUST39与Bacillus pumilus strain EE106-P2(MN581176.1)的序列相似度达99％以上。该菌株的16S rRNA基因序列见表1。

表1

根据NJUST39的形态学、生理生化测试以及分子生物学分析，菌株NJUST39被鉴定为 Bacillus pumilus，命名为Bacillus pumilus NJUST39。

实施例2

菌株Bacillus pumilus NJUST39降解N-甲基吡咯烷酮及同步反硝化脱氮性能。

将Bacillus pumilus NJUST39接种至含有5mM的N-甲基吡咯烷酮的LB液体培养基中， 30～35℃条件下180转/分钟摇床培养，进行NJUST39的菌株富集，待菌株进入对数生长期后 (约48小时)，将所得菌液用超低温离心机离心10分钟(4℃，6000转/分钟)，得到沉积菌体。用灭菌后的无机盐液体培养基重悬，离心，重复洗涤三次，将菌体重悬于无菌液体无机盐培养基中，得到种子液(控制OD₆₀₀约为1.5～2.0)。

向120mL血清瓶中加入100mL含有N-甲基吡咯烷酮初始浓度为12.8±0.8mM，硝酸钠初始浓度为26.1±1.1mM的无机盐液体培养基作为模拟废水，并连续通入高纯氦气以去除血清瓶及废水中溶解的氧气，构建缺氧反硝化体系。随后，将血清瓶用丁基橡胶塞和铝盖密封，在121℃条件下高压灭菌20分钟，静置至室温。将上述种子液接种至血清瓶中，接种量为 5％，在30～35℃、180转/分钟的条件下摇床培养，监测废水中N-甲基吡咯烷酮和硝态氮的浓度变化。设立未添加硝酸钠的实验组作为厌氧对照体系，其余操作同缺氧反硝化体系；设立未接种NJUST39的实验组作为非生物对照体系，其余操作同缺氧反硝化体系。

实验结果如图2所示，在含有硝酸钠的缺氧反硝化体系中，12.8±0.8mM的N-甲基吡咯烷酮在23小时内被完全降解。如图3所示，在含有硝酸钠的缺氧反硝化体系中，26.1±1.1mM 硝态氮在25小时内实现完全脱氮。然而，在未添加电子受体硝酸钠的厌氧对照体系中，相同浓度的N-甲基吡咯烷酮的去除率低于20％(图2)。在未接种NJUST39的非生物对照体系中，硝态氮和N-甲基吡咯烷酮的浓度没有明显变化(图2)。本实施例说明分离得到的Bacillus pumilus NJUST39可成功应用于同时含有硝态氮和N-甲基吡咯烷酮废水的生化处理，实现废水中硝态氮和N-甲基吡咯烷酮的高效去除。

实施例3

配制100mL含N-甲基吡咯烷酮初始浓度为5.1±0.4mM，硝态氮初始浓度为10.8±0.9 mM，初始pH分别为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0的无机盐液体培养基作为模拟废水，加入到120mL血清瓶中，并连续通入高纯氦气以去除血清瓶及废水中溶解的氧气，构建缺氧反硝化体系。随后，将血清瓶用丁基橡胶塞和铝盖密封，在121℃条件下高压灭菌20分钟，静置至室温。将上述种子液接种至血清瓶中，接种量为4％～10％，在30～35℃、180转/分钟的条件下摇床培养，监测废水中N-甲基吡咯烷酮和硝态氮的浓度变化。

实验结果如图4所示，在初始pH为6.0、7.0和8.0的条件下，Bacillus pumilusNJUST39 均可实现N-甲基吡咯烷酮和硝态氮的高效去除，且在初始pH为7.0时去除效果最好；在初始pH为9.0的条件下，Bacillus pumilus NJUST39也可实现N-甲基吡咯烷酮和硝态氮的去除，但去除速率明显较慢；而在pH为5.0与10.0的条件下，N-甲基吡咯烷酮和和硝态氮的去除率低至10％左右。

本实施例说明菌株Bacillus pumilus NJUST39降解N-甲基吡咯烷酮和反硝化脱氮的适合 pH范围在6.0～8.0之间，最佳进水pH值为中性，弱酸或弱碱会略微降低N-甲基吡咯烷酮和硝态氮的去除能力，而过酸和过碱都会显著抑制菌株Bacillus pumilus NJUST39降解N-甲基吡咯烷酮和反硝化脱氮的性能。

序列表

<110> 南京理工大学

湖北臻润环境科技股份有限公司

<120> N-甲基吡咯烷酮降解菌及在废水处理中的应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1479

<212> DNA

<213> 芽孢杆菌(Bacillus pumilus)

<400> 1

caggacgaac gctggcggcg tgcctaatac atgcaagtcg agcggacaga agggagcttg 60

ctcccggatg ttagcggcgg acgggtgagt aacacgtggg taacctgcct gtaagactgg 120

gataactccg ggaaaccgga gctaataccg gatagttcct tgaaccgcat ggttcaagga 180

tgaaagacgg tttcggctgt cacttacaga tggacccgcg gcgcattagc tagttggtgg 240

ggtaatggct caccaaggcg acgatgcgta gccgacctga gagggtgatc ggccacactg 300

ggactgagac acggcccaga ctcctacggg aggcagcagt agggaatctt ccgcaatgga 360

cgaaagtctg acggagcaac gccgcgtgag tgatgaaggt tttcggatcg taaagctctg 420

ttgttaggga agaacaagtg cgagagtaac tgctcgcacc ttgacggtac ctaaccagaa 480

agccacggct aactacgtgc cagcagccgc ggtaatacgt aggtggcaag cgttgtccgg 540

aattattggg cgtaaagggc tcgcaggcgg tttcttaagt ctgatgtgaa agcccccggc 600

tcaaccgggg agggtcattg gaaactggga aacttgagtg cagaagagga gagtggaatt 660

ccacgtgtag cggtgaaatg cgtagagatg tggaggaaca ccagtggcga aggcgactct 720

ctggtctgta actgacgctg aggagcgaaa gcgtggggag cgaacaggat tagataccct 780

ggtagtccac gccgtaaacg atgagtgcta agtgttaggg ggtttccgcc ccttagtgct 840

gcagctaacg cattaagcac tccgcctggg gagtacggtc gcaagactga aactcaaagg 900

aattgacggg ggcccgcaca agcggtggag catgtggttt aattcgaagc aacgcgaaga 960

accttaccag gtcttgacat cctctgacaa ccctagagat agggctttcc cttcggggac 1020

agagtgacag gtggtgcatg gttgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc 1080

cgcaacgagc gcaacccttg atcttagttg ccagcattta gttgggcact ctaaggtgac 1140

tgccggtgac aaaccggagg aaggtgggga tgacgtcaaa tcatcatgcc ccttatgacc 1200

tgggctacac acgtgctaca atggacagaa caaagggctg cgagaccgca aggtttagcc 1260

aatcccataa atctgttctc agttcggatc gcagtctgca actcgactgc gtgaagctgg 1320

aatcgctagt aatcgcggat cagcatgccg cggtgaatac gttcccgggc cttgtacaca 1380

ccgcccgtca caccacgaga gtttgcaaca cccgaagtcg gtgaggtaac ctttatggag 1440

ccagccgccg aaggtggggc agatgattgg ggtgaagtc 1479

Claims (12)

1.一种芽孢杆菌，其特征在于：命名为Bacillus pumilus NJUST39，保藏编号为CCTCCNO：M2020684。

2.根据权利要求1所述的芽孢杆菌，其特征在于：所述芽孢杆菌的16S rRNA基因序列如SEQ ID NO:1所示。

3.权利要求1或2所述的芽孢杆菌的筛选方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)从用于降解N-甲基吡咯烷酮的活性污泥中取样，加入至生理盐水中静置得到上清液；

2)将上清液加入至无机盐液体培养基，培养后涂布于无机盐琼脂培养基平板上，恒温培养、挑选单菌落纯化培养，得到单一菌株；

3)将单一菌株加入至含有N-甲基吡咯烷酮及硝态氮的无机盐液体培养基中进行缺氧培养，筛选能有效去除培养基中N-甲基吡咯烷酮和硝态氮的菌株。

4.权利要求1或2所述的芽孢杆菌的培养方法，其特征在于：将所述芽孢杆菌接种至LB培养基培养，培养pH值为6.0～8.0，和/或培养温度为30℃～35℃。

5.根据权利要求4所述的芽孢杆菌的培养方法，其特征在于：所述LB培养基中含有N-甲基吡咯烷酮和硝酸钠；N-甲基吡咯烷酮和硝酸钠的摩尔比为(0.4～1.0)：1，和/或N-甲基吡咯烷酮浓度为4.7～13.6mM，硝酸钠浓度为9.9～27.2mM。

6.权利要求1或2所述的芽孢杆菌在降解N-甲基吡咯烷酮，和/或反硝化脱氮中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：将所述芽孢杆菌用于含N-甲基吡咯烷酮的废水处理。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述废水中还含有硝态氮。

9.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于，将所述芽孢杆菌培养为种子液加入至含N-甲基吡咯烷酮的废水中，或将所述芽孢杆菌制备为菌剂加入至含N-甲基吡咯烷酮的废水中。

10.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：

1)将所述芽孢杆菌接种在含有N-甲基吡咯烷酮和硝酸钠的LB培养基中培养，培养基pH为6.0～8.0，培养温度为30℃～35℃，得到种子液；

2)将种子液接种到含有硝态氮和N-甲基吡咯烷酮废水中，缺氧条件下培养，培养温度为30℃～35℃，培养pH为6.0～8.0。

11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于：所述步骤2)中种子液的接种量为4％～10％，和/或种子液的OD600为1.5～2.0。

12.一种芽孢杆菌菌剂，其特征在于：含有权利要求1所述的芽孢杆菌。

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