CN111088197B - 一株产碱普罗维登斯菌及其在降解四环素与产植物生长素方面的应用 - Google Patents

一株产碱普罗维登斯菌及其在降解四环素与产植物生长素方面的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN111088197B
CN111088197B CN202010064609.0A CN202010064609A CN111088197B CN 111088197 B CN111088197 B CN 111088197B CN 202010064609 A CN202010064609 A CN 202010064609A CN 111088197 B CN111088197 B CN 111088197B
Authority
CN
China
Prior art keywords
providencia
alcaligenes
culture medium
culture
strain
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202010064609.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111088197A (zh
Inventor
龚贝妮
谭泽文
李永涛
徐会娟
邹艺璇
邓翠文
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
South China Agricultural University
Original Assignee
South China Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by South China Agricultural University filed Critical South China Agricultural University
Priority to CN202010064609.0A priority Critical patent/CN111088197B/zh
Publication of CN111088197A publication Critical patent/CN111088197A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111088197B publication Critical patent/CN111088197B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B09—DISPOSAL OF SOLID WASTE; RECLAMATION OF CONTAMINATED SOIL
    • B09C—RECLAMATION OF CONTAMINATED SOIL
    • B09C1/00—Reclamation of contaminated soil
    • B09C1/10—Reclamation of contaminated soil microbiologically, biologically or by using enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C02—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
    • C02F—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
    • C02F3/00—Biological treatment of water, waste water, or sewage
    • C02F3/34—Biological treatment of water, waste water, or sewage characterised by the microorganisms used
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/10—Nitrogen as only ring hetero atom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C02—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
    • C02F—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
    • C02F2101/00—Nature of the contaminant
    • C02F2101/30—Organic compounds
    • C02F2101/38—Organic compounds containing nitrogen

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Environmental & Geological Engineering (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Hydrology & Water Resources (AREA)
  • Water Supply & Treatment (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Soil Sciences (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一株产碱普罗维登斯菌及其在降解四环素与产植物生长素方面的应用。该产碱普罗维登斯菌名称为Providencia alcalifaciens TC1，保藏编号为GDMCC NO：60787，该菌株于2019年9月25日保藏于广州市先烈中路100号大院59号楼5楼的广东省微生物菌种保藏中心。本发明中的产碱普罗维登斯菌TC1可通过共代谢方式对四环素进行降解且可以分泌生长素或类似物，因此可将其用于土壤和水体中低浓度四环素的降解，以去除或降低四环素在环境中的残留；还可以用于生产植物生长素，用于促进植物生长。

Description

一株产碱普罗维登斯菌及其在降解四环素与产植物生长素方 面的应用
技术领域
本发明属于抗生素污染微生物修复技术领域，特别涉及一株产碱普罗维登斯菌及其在降解四环素与产植物生长素方面的应用。
背景技术
目前，抗生素越来越多地应用于兽医与医疗领域。四环素(TC)作为一种广谱抗生素，因其对革兰氏菌，某些立克次体，滤过性病毒和原虫良好的抑制效果而被广泛应用于禽畜产业上。当TC被用于人或动物体后，部分未被利用的四环素或生物代谢产物会随着动物尿液和粪便排出体外，而将含四环素残留的禽畜粪便作为有机肥料施用于农田上会污染土壤体系甚至污染地下水体系。除此之外，四环素也通过制药废水排放，丢弃过期抗生素等途径进入土壤和水体中。据文献报道，农业土壤中普遍检出四环素，部分样点土壤中四环素抗生素的含量超出了兽药国际协调委员会(VICH)筹划指导委员会提出的土壤抗生素生态毒害效应触发值(100μg/kg)，具有一定的生态风险。TC通过地表径流、污水贮存池渗漏、农田粪便淋溶、畜舍区淋溶等途径进入到环境当中，致此会污染地表水和地下水资源，从而影响环境中微生物多样性和丰度，此外也会诱导产生耐药性。
利用微生物方法降解环境中的四环素残留是一种具有广阔前景的方法。相较于传统的物理化学、植物修复和电化学膜片技术降解四环素，微生物降解产物毒性低，易处理。
生长素IAA自被发现先以来一直是研究热点，并且在植物生长发育过程中扮演着许多重要的角色，如促进植物细胞伸长、分化、分裂以及调节植物生长和衰老等。在IAA生物合成的途径中，植物和微生物合成的途径高度相似，主要包括两个途径，色氨酸独立和色氨酸依赖途径，并且都是以色氨酸为前体物质；通过脱氨基、脱羧基以及氧化等作用促使色氨酸转化成IAA。如今，微生物分泌IAA能力作为微生物促进植物生长的一个主要指标，而现有研究鲜有报道具有同时降解TC能力及分泌IAA微生物。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一株产碱普罗维登斯菌。
本发明的另一目的在于提供所述产碱普罗维登斯菌在降解四环素方面的应用。
本发明的再一目的在于提供所述产碱普罗维登斯菌在生产植物生长素方面的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一株产碱普罗维登斯菌，名称为Providencia alcalifaciens(产碱普罗维登斯菌)TC1，保藏编号为GDMCC NO：60787，该菌株于2019年9月25日保藏于广州市先烈中路100号大院59号楼5楼的广东省微生物菌种保藏中心。
所述的产碱普罗维登斯菌的16S rDNA序列由1416个碱基(bp)组成，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
一种培养所述产碱普罗维登斯菌的方法，具体步骤为：将所述产碱普罗维登斯菌接种于培养基中，于28℃～37℃条件下进行培养。
所述的培养基为LB培养基或King培养基。
所述的King培养基的组成成分如下：蛋白胨20.0g·L-1，K2HPO4·3H2O 1.5g·L-1，甘油10mL·L-1，MgSO4·7H2O 1.5g·L-1，色氨酸0.1g·L-1，pH 7.2。
所述的培养的温度优选为28℃～30℃。
所述的培养的时间为18～48h；优选为20～48h。
所述的培养的为在摇床中进行培养，其转速为125～150rpm。
一种产碱普罗维登斯菌培养物，为通过培养上述产碱普罗维登斯菌得到。
所述的培养的条件为：28℃～37℃培养18～48h；优选为：125～150rpm、30℃培养20h。
所述的培养所用培养基为King培养基。
所述的培养的温度优选为28℃～30℃。
所述的培养的时间优选为20～48h。
所述的产碱普罗维登斯菌和/或产碱普罗维登斯菌培养物在制备植物生长素中的应用，该产碱普罗维登斯菌具有产生长素的性能，能够分泌生长素或类似物，从而促进植物生长。
所述的和/或产碱普罗维登斯菌培养物作为植物生长素的应用。
所述的植物生长素优选为吲哚乙酸(IAA)。
所述的产碱普罗维登斯菌和/或产碱普罗维登斯菌培养物在促进植物生长方面的应用。
一种生产植物生长素的方法，包括步骤：将所述的产碱普罗维登斯菌接种到培养基中进行培养，获得植物生长素。
所述的培养基为King培养基。
所述的产碱普罗维登斯菌的接种量为3～5％(v/v)。
所述的培养的条件为：125～150rpm，28～30℃摇床振荡培养18～48h；优选为：125～150rpm，28～30℃摇床振荡培养48h。
所述的植物生长素优选为吲哚乙酸(IAA)。
一种能生产植物生长素的菌剂，含有上述产碱普罗维登斯菌。
所述的产碱普罗维登斯菌在降解四环素方面的应用。
所述的产碱普罗维登斯菌在降解四环素方面的应用，是将所述产碱普罗维登斯菌加入到含有四环素的土壤或水体中，对土壤或水体中的四环素进行降解，以去除或者降低四环素在环境中的残留。
所述的含有四环素的水体中的四环素的浓度为5～50mg·L-1；优选为10mg·L-1。
所述的降解的时间为3～9天；优选为6～9天。
一种四环素生物降解菌剂，含有所述的产碱普罗维登斯菌。
本发明中的产碱普罗维登斯菌TC1在LB平板上生长18～20h后，菌斑呈白色、圆形、菌落扁平、光滑、有光泽，在37℃培养18h后，菌落直径约1～1.5mm。可在四环素浓度为10mg·L-1的含有10g·L-1蛋白胨的无机盐液体培养基中生长良好。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明中的产碱普罗维登斯菌TC1可通过共代谢方式对四环素进行降解，将菌株TC1接种于四环素浓度为10mg·L-1的含有10g·L-1蛋白胨的无机盐液体培养基中，30℃，150r·min-1震荡培养0、3、5、9天，四环素3d后自然水解s率为32.42％，加菌后降解率为49.43％；5d后自然水解率为39.48％，加菌后降解率为55.35％；9d后自然水解率为42.34％，加菌后降解率为63.33％。说明菌株TC1具有降解四环素的性能，可应用于土壤和水体中低浓度四环素的降解，菌株TC1对中低浓度四环素的降解作用可以去除或降低四环素在环境中的残留。
(2)将菌株TC1接种在King培养基中，28℃，125rmp震荡培养48h，进行产生长素定性验试。样品和阳性对照(IAA 100ug·L-1)与比色液分别混合，15min后，阳性对照显现为红色，样品显现为橘色(由于TC1菌液本身为黄色，而产生的IAA红色与菌液本身黄色掺杂在一起，导致颜色显现为橘色)，而阴性对照(无菌培养基)不显红色，说明菌株TC1分泌IAA。因此，该菌株TC1可应用于液体和土壤中的残留四环素去除且具备促进植物生长的潜能，可用在生产促植物生长的生长素方面。
附图说明
图1是菌株TC1的菌落形态图(培养皿直径9cm)。
图2是菌株TC1的系统发育树图。
图3是菌株TC1在含有10g·L-1蛋白胨的MSM培养基中对四环素的降解图(CK代表不加菌对照)。
图4是菌株TC1的产生长素的定性试验比色图(CK-代表不加菌阴性对照；CK+代表加10ug/mL吲哚乙酸阳性对照；TC1代表加入菌株处理48h；Water代表蒸馏水；TC1菌液代表加入菌株，未经比色；King培养基代表CK-未经比色前处理)。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。除非特别说明，本发明所用试剂均可通过市售获得。
实施例1菌株TC1的筛选、分离纯化以及鉴定
一、一株四环素降解菌株TC1筛选方法
1.材料准备
菌株筛选土壤来源：取自湖南省株洲市茶陵县左垅村农家施肥菜地，土样用采样袋密封，4℃带回实验室保存并备用。
LB培养基：蛋白胨10.0g，酵母提取粉5.0g，NaCl 10.0g，pH7.0～7.2，蒸馏水定容至1L；固体培养基另加18.0g琼脂粉。121℃灭菌15min。
无机盐培养基(MSM培养基)：将5mL磷酸缓冲溶液(KH2PO4 8.5g·L-1、K2HPO4·H2O21.75g·L-1、Na2HPO4·12H2O 33.4g·L-1、NH4 Cl 5.0g·L-1)，3.0mL 22.5g·L-1的MgSO4溶液(MgSO4·7H2O 46.125g·L-1)，1.0mL 0.25g·L-1的FeCl3溶液(FeCl3·6H2O 0.42g·L-1)，1.0mL 36.4g·L-1的CaCl2溶液(CaCl2·2H2O 48.22g·L-1)，1.0mL微量元素溶液(MnSO4·H2O 39.9mg·L-1，ZnSO4·H2O 42.8mg·L-1，(NH4)6Mo7O24·4H2O 34.7mg·L-1)混匀，pH7.0～7.2，后用纯水定容至1L，121℃灭菌15min。
含有10g·L-1蛋白胨的MSM培养基：胰蛋白胨10.0g加入到1L的MSM培养基中，pH7.0～7.2，-121℃灭菌15min。
2.实验仪器与设备
立式压力蒸汽灭菌锅(BL-50A，上海静科实业有限公司)、便携式pH计(PHB-4，上海精密科学有限公司)、离心机(Centrifuge 5810R)、电热烘箱(DGG-9070A，上海森信实验仪器有限公司)、数显恒温水浴锅(HH系列，常州国宇仪器制造有限公司)、冰箱(RCD-205AG7，海信电器)、生化培养箱(PYX-208S-A，科力仪器)、超净工作台(SW-CJ-1F，苏净安泰空气技术有限公司)、涡旋混合器(XW-80A，上海精科实业有限公司)、MyCycler PCR(美国BIO-RAD公司)、电泳仪(DYY-6C，北京六一仪器厂)、Nano Drop核酸蛋白定量检测仪(德国Thermo)、凝胶成像系统(美国BIO-RAD公司)、落地恒温振荡器(HZQ-211C)。
3.四环素降解菌株富集筛选及分离纯化
(1)菌株的分离与纯化
称取采集污染土壤1g，加至50mL含0.5mg·L-1TC的含有10g·L-1蛋白胨的MSM培养基中驯化培养(即将TC加入到含有10g·L-1蛋白胨的MSM培养基中，使TC的终浓度为0.5mg·L-1)，驯化两天后以2％(v/v)的接种量转接至1mg·L-1TC的含有10g·L-1蛋白胨的MSM培养基驯化，然后按2％(v/v)的接种量分别转接至TC浓度为2.5、5和10mg·L-1TC的含有10g·L-1蛋白胨的MSM培养基中驯化。驯化筛选后，将菌液用培养基稀释至106、107、108和109倍，分别取稀释液0.2mL涂布于LB固体培养基，30℃培养至菌落形成；后将长出来的单菌落挑选出来，分离并纯化。
(2)菌株筛选
将步骤(1)分离纯化得到的纯化菌株接种到LB液体培养基中进行扩大培养20～24h。活化后按2％(v/v)的比例加至含有10mg·L-1TC的10g·L-1蛋白胨的MSM培养基中，150r·min-130℃避光培养，0、2、6和9天后收集菌液。菌液以8000r·min-1离心10min，收集上清过0.22μm有机滤膜，滤液用高效液相色谱方法(HPLC)进行测定，计算菌株对四环素的降解速率，以上所有实验步骤都尽量避光。得到能降解TC的菌株，将其命名为菌株TC1。
液相色谱条件(HPLC)：液相色谱柱为CNW C18-WP(4.6×250mm，5μm)，A相为甲醇，B相为乙腈，C相为0.01mol·L-1草酸，V(A):V(B):V(C)＝15:15:70，流速为1mL·min-1，柱温31℃；进样量20μL；紫外检测器检测波长355nm。
二、菌落形态特征观察
菌株TC1在LB培养基上生长较快，可在30～37℃生长。菌斑呈白色、圆形、菌落扁平、光滑、有光泽，在37℃培养18h后，菌落直径约1～1.5mm(图1)。可在四环素浓度为10mg/L的含有10g/L蛋白胨的MSM培养基中生长良好。
2.16S rDNA扩增
以提取的细菌总DNA为模板，采用细菌16S rDNA通用引物扩增，正向引物为27f：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，反向引物为1492r：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'(Stackebrandt et al.,1991)扩增16S rDNA基因序列。
PCR反应总体系为25μL：上、下游引物各2μL，模板DNA 0.5μL，2×Taq PCR MasterMix 12.5μL，无菌超纯至总体积25μL。
PCR反应程序为：95℃预变性3min，95℃变性50s，56℃退火50s，72℃延伸50s，35个循环；最后72℃补充延伸5min。PCR结束后用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，选择DL2000 Marker。凝胶成像系统下观察，其中在Marker 1000bp与2000bp条带中间范围出现明显的亮带。
3.16S rDNA序列的测定
PCR扩增后产物送北京睿博兴科生物技术有限公司(广州分公司)测序。得到菌株的16S rDNA基因序列如下：
TGCAAGTCGAGCGGTAACAGGGGAAGCTTGCTTCTCGCTGACGAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGTATGGGGATCTGCCCGATAGAGGGGGATAACTACTGGAAACGGTAGCTAATACCGCATAATCTCTNAGGAGCAAAGCAGGGGAACTTCGGTCCTTGCGCTATCGGATGAACCCATATGGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTAGGGTTGTAAAGTACTTTCAGTTGGGAGGAAGGCGTTGATGCTAATATCATCAGCGATTGACGTTACCAACAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCAGGCGGTTGATTAAGTTAGATGTGAAATCCCCGGGCTTAACCTGGGAATGGCATCTAAGACTGGTCAGCTAGAGTCTTGTAGAGGGGGGTAGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACAAAGACTGACGCTCAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCTGTAAACGATGTCGATTTGGAGGTTGTTCCCTTGAGGAGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAATCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACTCTTGACATCCAGAGAATTTAGCAGAGATGCTTTAGTGCCTTCGGGAACTCTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTTGTTGCCAGCGATTCGGTCGGGAACTCAAAGGAGACTGCCGGTGATAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGAGTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGTATACAAAGAGAAGCGACCTCGCGAGAGCAAGCGGAACTCATAAAGTACGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTAGATCAGAATGCTACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCAAAAGAAGTAGGTAGCTTAACCTTCGGGAGGGCGCTTACCACTTGG。
上述序列由1416碱基(bp)组成。
将获得的16S rDNA基因序列提交至美国国立生物信息中心(NCBI)网页进行BLAST对比，与LPSN数据库(http://www.bacterio.net/index.html)中相关模式菌株的16S rDNA基因进行同源性比对分析，下载同源性较高的模式菌株序列在美国国立生物信息中心(NCBI)网站上对扩增产物序列进行BLAST比对和同源性分析，采用Mega 6.0软件，以Neighbour-Joining法构建系统发育树。经16S rDNA序列进行比较发现，菌株TC1与产碱普罗维登斯菌(Providencia alcalifaciens)CIP 82.90有99.65％的同源性(图2)。
四、菌株TC1鉴定为一种新功能菌株
根据菌株TC1菌落形态特征和分子生物学鉴定结果，将菌株TC1命名为产碱普罗维登斯菌TC1(Providencia alcalifaciens TC1)。该菌株已保存于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏号为GDMCC NO：60787，该菌株于2019年9月25日。保藏单位地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
目前，国内外尚无文献报道产碱普罗维登斯菌(Providencia alcalifaciens)具有降解四环素的功能。因此，产碱普罗维登斯菌TC1为一株具有降解四环素功能的新菌株。
实施例2菌株TC1在含有四环素和蛋白胨的无机盐培养基中对四环素的降解
将菌株TC1划线与LB平板上30℃培养20h后，挑取单菌落接种于LB液体培养基中，30℃、150r·min-1的摇床中培养20h后按2％(v/v)的比例接种至TC含量为10mg·L-1的含10g·L-1胰蛋白胨的MSM培养基中培养，并于3、5、9d(天)后取样；以不添加菌株TC952为对照(CK)。样液以10000r·min-1离心1min，上清液用0.22μm滤膜过滤，过滤后HPLC测定其TC的残留量(四环素测定方法同实施例1)。
结果表明，未加菌的对照TC发生水解，加菌TC1后，TC降解明显加快加强。TC初始浓度为10ppm时，3、5和9d后的水解率分别为32.42％、39.48、42.34％，可知随着时间增加，自然水解率增加。加入TC1后TC降解速率加快，3、5和9d后的TC降解效率(水解+生物降解)为49.43％、55.35％、63.33％。TC自然水解或生物降解3、5、9天后四环素残余浓度见图3。
实施例3菌株TC1的生长素分泌定性验试
将画线于LB固体培养基菌株TC1接种于LB液体培养基，于125～150rpm，28-30℃摇床振荡培养18～24h，后以2％的接种量(V/V)接种至King培养基中(TC1处理组)，以2％无菌水加入King培养基中处理作为阴性空白对照(CK-)，置于125rpm，28℃摇床振荡培养48h(每一处理都为三次重复)。室温条件下，分别吸取50ul各组处理液至白色比色板上，同时加入50μL比色液；黑暗处理15min后观察各组颜色的变化，颜色为粉红色则反应呈阳性，说明其能分泌产生IAA，且颜色越深其分泌IAA能力越强；反之，则为阴性(图4)。
各处理组说明如下：
(1)CK-组(阴性对照组)：加入50μL King培养基，同时加入50μL比色液；
(2)CK+组(阳性对照组)：加入50μL浓度为10mg·L-1的植物生长素吲哚乙酸(IAA)，同时加入50μL比色液；
(3)TC1组(实验组)：加入50μL加菌King培养液，同时加入50μL比色液；
(4)Water组(空白对照组)：加入50μL蒸馏水，同时加入50μL比色液；
(5)TC1菌液组(对照组1)：取100μL King培养基培养菌液至比色板；
(6)King培养基组(对照组2)：未加菌株培养King培养基，且未加比色液比色。
上述所需培养基及试剂配方如下：
King培养基：蛋白胨20.0g·L-1，K2HPO4·3H2O 1.5g·L-1，甘油10mL·L-1，MgSO4·7H2O 1.5g·L-1，色氨酸0.1g·L-1，pH 7.2；
比色液：0.5mol·L-1的FeCl3 1.0ml，浓硫酸30ml(质量分数95～98％)，蒸馏水50ml。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华南农业大学
<120> 一株产碱普罗维登斯菌及其在降解四环素与产植物生长素方面的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1416
<212> DNA
<213> Providencia alcalifaciens
<220>
<223> 产碱普罗维登斯菌（Providencia alcalifaciens ）
<220>
<221> misc_feature
<222> (131)..(131)
<223> n is a, c, g, t or u
<400> 1
tgcaagtcga gcggtaacag gggaagcttg cttctcgctg acgagcggcg gacgggtgag 60
taatgtatgg ggatctgccc gatagagggg gataactact ggaaacggta gctaataccg 120
cataatctct naggagcaaa gcaggggaac ttcggtcctt gcgctatcgg atgaacccat 180
atgggattag ctagttggtg aggtaatggc tcaccaaggc gacgatccct agctggtctg 240
agaggatgat cagccacact gggactgaga cacggcccag actcctacgg gaggcagcag 300
tggggaatat tgcacaatgg gcgcaagcct gatgcagcca tgccgcgtgt atgaagaagg 360
ccttagggtt gtaaagtact ttcagttggg aggaaggcgt tgatgctaat atcatcagcg 420
attgacgtta ccaacagaag aagcaccggc taactccgtg ccagcagccg cggtaatacg 480
gagggtgcaa gcgttaatcg gaattactgg gcgtaaagcg cacgcaggcg gttgattaag 540
ttagatgtga aatccccggg cttaacctgg gaatggcatc taagactggt cagctagagt 600
cttgtagagg ggggtagaat tccatgtgta gcggtgaaat gcgtagagat gtggaggaat 660
accggtggcg aaggcggccc cctggacaaa gactgacgct caggtgcgaa agcgtgggga 720
gcaaacagga ttagataccc tggtagtcca cgctgtaaac gatgtcgatt tggaggttgt 780
tcccttgagg agtggcttcc ggagctaacg cgttaaatcg accgcctggg gagtacggcc 840
gcaaggttaa aactcaaatg aattgacggg ggcccgcaca agcggtggag catgtggttt 900
aattcgatgc aacgcgaaga accttaccta ctcttgacat ccagagaatt tagcagagat 960
gctttagtgc cttcgggaac tctgagacag gtgctgcatg gctgtcgtca gctcgtgttg 1020
tgaaatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc gcaaccctta tcctttgttg ccagcgattc 1080
ggtcgggaac tcaaaggaga ctgccggtga taaaccggag gaaggtgggg atgacgtcaa 1140
gtcatcatgg cccttacgag tagggctaca cacgtgctac aatggcgtat acaaagagaa 1200
gcgacctcgc gagagcaagc ggaactcata aagtacgtcg tagtccggat tggagtctgc 1260
aactcgactc catgaagtcg gaatcgctag taatcgtaga tcagaatgct acggtgaata 1320
cgttcccggg ccttgtacac accgcccgtc acaccatggg agtgggttgc aaaagaagta 1380
ggtagcttaa ccttcgggag ggcgcttacc acttgg 1416

Claims (9)

1.一株产碱普罗维登斯菌，其特征在于：名称为产碱普罗维登斯菌(Providencia alcalifaciens )TC1，保藏编号为GDMCC NO：60787，该菌株于2019年9月25日保藏于广州市先烈中路100号大院59号楼5楼的广东省微生物菌种保藏中心。
2.一种培养权利要求1所述产碱普罗维登斯菌的方法，其特征在于：将产碱普罗维登斯菌接种于培养基中，于28℃～37℃条件下进行培养；
所述的培养基为LB培养基或King培养基；
所述的培养的时间为18～48 h；
所述的King培养基的组成成分如下：蛋白胨20.0 g·L-1，K2HPO4·3H2O 1.5g·L-1，甘油10 mL·L-1，MgSO4·7H2O 1.5g·L-1，色氨酸0.1 g·L-1，pH 7.2。
3.一种产碱普罗维登斯菌培养物，其特征在于：为通过培养权利要求1所述的产碱普罗维登斯菌得到；
所述的培养所用培养基为King培养基；
所述的培养的条件为：28℃～37℃培养18～48 h；
所述的King培养基的组成成分如下：蛋白胨20.0 g·L-1，K2HPO4·3H2O 1.5g·L-1，甘油10 mL·L-1，MgSO4·7H2O 1.5g·L-1，色氨酸0.1 g·L-1，pH 7.2。
4.权利要求1所述的产碱普罗维登斯菌和/或权利要求3所述的产碱普罗维登斯菌培养物在制备植物生长素中的应用。
5.权利要求3所述的产碱普罗维登斯菌培养物作为植物生长素的应用。
6.权利要求1所述的产碱普罗维登斯菌和/或权利要求3所述的产碱普罗维登斯菌培养物在促进植物生长方面的应用。
7.一种生产植物生长素的方法，其特征在于，包括步骤：将权利要求1所述的产碱普罗维登斯菌接种到培养基中进行培养，获得植物生长素；
所述的培养基为King培养基；
所述的培养的条件为：125~150rpm，28～30℃摇床振荡培养18～48h；
所述的King培养基的组成成分如下：蛋白胨20.0 g·L-1，K2HPO4·3H2O 1.5g·L-1，甘油10 mL·L-1，MgSO4·7H2O 1.5g·L-1，色氨酸0.1 g·L-1，pH 7.2。
8.一种能生产植物生长素的菌剂，其特征在于：含有权利要求1所述的产碱普罗维登斯菌。
9.权利要求1所述的产碱普罗维登斯菌在降解四环素方面的应用。
CN202010064609.0A 2020-01-20 2020-01-20 一株产碱普罗维登斯菌及其在降解四环素与产植物生长素方面的应用 Active CN111088197B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010064609.0A CN111088197B (zh) 2020-01-20 2020-01-20 一株产碱普罗维登斯菌及其在降解四环素与产植物生长素方面的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010064609.0A CN111088197B (zh) 2020-01-20 2020-01-20 一株产碱普罗维登斯菌及其在降解四环素与产植物生长素方面的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111088197A CN111088197A (zh) 2020-05-01
CN111088197B true CN111088197B (zh) 2021-07-23

Family

ID=70399478

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010064609.0A Active CN111088197B (zh) 2020-01-20 2020-01-20 一株产碱普罗维登斯菌及其在降解四环素与产植物生长素方面的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111088197B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113549566B (zh) * 2021-05-28 2023-09-01 华南农业大学 一株耐镉促生雷氏普罗威登斯菌菌株及其应用
CN118497079B (zh) * 2024-07-08 2024-09-17 华南农业大学 一株普罗菲登斯菌及其应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009110940A2 (en) * 2007-12-18 2009-09-11 Amcol International Corporation Virus-, bacteria-, and fungi-interacting layered phyllosilicates and methods of use
CN105603006A (zh) * 2016-02-15 2016-05-25 江南大学 一种微生物转化的方法
CN106905386A (zh) * 2010-05-12 2017-06-30 莱姆派克斯制药公司 氨基糖苷衍生物
WO2019014391A1 (en) * 2017-07-12 2019-01-17 Synlogic Operating Company, Inc. MICROORGANISMS PROGRAMMED TO PRODUCE IMMUNOMODULATORS AND ANTICANCER THERAPEUTIC AGENTS IN TUMOR CELLS
CN110699280A (zh) * 2019-10-18 2020-01-17 华南农业大学 一株能降解四环素的常州鞘氨醇杆菌及其应用

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104762228B (zh) * 2015-01-09 2018-08-10 江苏大学 一种源于象草的巨大芽孢杆菌及其用途
CN106011002B (zh) * 2016-05-20 2020-01-17 东莞市保得生物工程有限公司 一种巨大芽孢杆菌t317及其菌剂和菌剂制备方法
CN110205272B (zh) * 2019-06-10 2021-04-23 华南农业大学 一株能降解四环素的台湾假单胞菌及其应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009110940A2 (en) * 2007-12-18 2009-09-11 Amcol International Corporation Virus-, bacteria-, and fungi-interacting layered phyllosilicates and methods of use
CN106905386A (zh) * 2010-05-12 2017-06-30 莱姆派克斯制药公司 氨基糖苷衍生物
CN105603006A (zh) * 2016-02-15 2016-05-25 江南大学 一种微生物转化的方法
WO2019014391A1 (en) * 2017-07-12 2019-01-17 Synlogic Operating Company, Inc. MICROORGANISMS PROGRAMMED TO PRODUCE IMMUNOMODULATORS AND ANTICANCER THERAPEUTIC AGENTS IN TUMOR CELLS
CN110699280A (zh) * 2019-10-18 2020-01-17 华南农业大学 一株能降解四环素的常州鞘氨醇杆菌及其应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Epidemiology and Pathogenesis of Providencia alcalifaciens Infections;Shah Mohammad Monir等;《The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene》;20191231;第101卷(第2期);第290-293页，参见全文 *
山羊瘤胃中单宁降解菌的分离、筛选和鉴定;李兴芳等;《动物营养学报》;20151231;第27卷(第6期);第1921-1927页，参见全文 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN111088197A (zh) 2020-05-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112646753B (zh) 一株产气克雷伯氏菌及其应用
CN110699280B (zh) 一株能降解四环素的常州鞘氨醇杆菌及其应用
CN112574916B (zh) N-甲基吡咯烷酮降解菌及在废水处理中的应用
CN112625981B (zh) 一株黏质沙雷氏菌及其应用
CN111154685B (zh) 一株降解四环素的变栖克雷伯士菌及其应用
CN111088197B (zh) 一株产碱普罗维登斯菌及其在降解四环素与产植物生长素方面的应用
CN110205272B (zh) 一株能降解四环素的台湾假单胞菌及其应用
CN115386520B (zh) 一株嗜吡啶红球菌rl-gz01菌株及其应用
CN114854630B (zh) 一种耐硒芽孢杆菌及其选育方法和应用
CN113583898B (zh) 一株葡萄牙柠檬酸杆菌及其在去除氯霉素和溶磷解钾中的应用
CN106927576A (zh) 一种提高污水中氮类污染物去除效果的方法
CN111662839B (zh) 降解四环素的贝莱斯芽孢杆菌及磁性固定化微生物复合材料与应用
CN108949639B (zh) 一株降解金霉素的鲍氏不动杆菌及其应用
CN107513508B (zh) 一种肠杆菌及其在净化水体方面的应用
CN116083316A (zh) 一种粪产碱菌及其在除藻上的应用
CN115491325A (zh) 一种耐金属贪铜菌及应用方法
CN114480207A (zh) 一种太平洋芽孢杆菌及其降解污废水中硫化物的应用
CN113583901B (zh) 一株变栖克雷伯士菌及其在去除氯霉素和镉离子中的应用
CN113025519B (zh) 一株中间气单胞菌及其在去除氯霉素和溶磷解钾中的应用
CN115895937B (zh) 一株经微重力诱变选育的肺炎克雷伯氏菌及其培养方法和应用
CN107674843B (zh) 一株夹膜红细菌rc1及其应用
CN110964652B (zh) 一种二硝基甲苯磺酸钠降解菌及其筛选方法与应用
CN112375718B (zh) 一株吡蚜酮降解菌iurm f17及其应用
CN114410552B (zh) 一株氧化硫的盖氏假单胞菌及其在黑臭水体空气中降硫应用
CN105255784A (zh) 茶叶叶围优势菌及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant