CN114854630B - 一种耐硒芽孢杆菌及其选育方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种耐硒芽孢杆菌及其选育方法和应用，保藏号CGMCC NO.24522，命名为副蕈状芽孢杆菌B.paramycoides 1805。在5mmol/L亚硒酸钠LB培养基中，该菌株对亚硒酸钠的还原率可达到65.7％，其对亚硒酸钠的耐受能力为80mmol/L。该菌株在液体和固体平板中对亚硒酸钠的最终耐受性分别达到190mmol/L、140mmol/L，原来耐受性的2.375倍与1.75倍。本发明为微生物合成纳米硒市场提供了一种新菌株，具有极其广阔的应用前景和工业价值。

Description

一种耐硒芽孢杆菌及其选育方法和应用

技术领域

本发明属于微生物选育方法和用途，特别涉及一种耐硒芽孢杆菌的选育方法和应用。

背景技术

硒（Se）在维持动物植物的机体健康发展与疾病防控方面起着关键的作用，有着裨益，如何合理利用硒成了至关重要的难题。目前饮食补硒法是改善硒匮乏情况的最有效方式之一，与当前化学法与物理法合成硒单质相比，生物方法具有绿色安全、环保、可控等优势。纳米硒也是如此，它与无机硒与有机硒相比较发现，纳米硒生物活性强、毒性低，易吸收，是目前补硒最安全可靠的方式。

纳米硒的合成方法分为化学法和生物法。化学合成法制备的纳米硒稳定性较差，需要加入分散剂或保护剂，这使得纳米硒合成工序复杂且生产成本提高。生物法制备纳米硒主要是利用微生物（细菌、真菌、放线菌等）生长发育过程中的产物和硒盐反应制备纳米硒，该方法反应条件温和，制备的纳米硒生物活性高、尺寸较小、粒径均匀，稳定性强且环境友好，是目前合成纳米硒领域的热点。

当前，随着科技水平的发展，越来越多的微生物被发现具有可将无机硒转化成纳米硒的功效与能力，但一些问题也逐渐突显。目前研究相关的微生物，其对高浓度的无机硒普遍耐受性较差，其最大硒耐受浓度约为150 mmol/L，且大部分微生物的还原速度较慢，基本需要48-108 h才能将无机硒还原成纳米硒，这导致其在实际生产生活中的应用受到很大程度限制。

发明内容

发明目的：本发明的目的在于提供一种耐硒芽孢杆菌。

本发明的另一目的在于提供所述耐硒芽孢杆菌的选育方法及用途。技术方案：本发明所述的耐硒芽孢杆菌，其保藏号为 CGMCC NO.24522，分类命名为副蕈状芽孢杆菌B. paramycoides 1805（即Bacillus paramycoides 1805）。保藏机构为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏时间为2022年03月11日；保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

所述的耐硒芽孢杆菌的选育方法，其特征在于：包括如下步骤：从富硒土壤中采集样品，培养纯化后，取待测悬浮液接种到硒酸钠固体LB培养基中，培养，选出具有合成能力的菌落；将菌株接种到亚硒酸钠LB培养基中，培养，取上清在紫外分光光度计测OD₅₀₀；通过响应面优化温度、pH、转速，得到B. paramycoides 1805最佳生长条件和还原条件。

进一步地，所述B. paramycoides1805可在24h内将2mmol/L的亚硒酸钠充分合成单质纳米硒。

所述B. paramycoides 1805在没有优化的条件下还原亚硒酸钠的效率为65.7%，其在固体平板peiyang条件下对亚硒酸钠的耐受性能达到80mmol/L。

所述B. paramycoides 1805最佳生长条件为30℃、pH为6、转速200rmp/min。

所述B. paramycoides1805合成红色单质纳米硒的条件为30-40℃、pH为4-7、转速100-150 rmp/min。

合成的纳米硒的尺寸在100-200nm之间。

所述B. paramycoides 1805合成红色单质纳米硒的最佳条件—温度、pH、转速三因素之间相互独立，干扰较小，所以操作条件简单易控制。

所述B. paramycoides 1805合成红色单质纳米硒的最佳条件为37℃、pH为6、转速140rmp/min。

所述纳米硒具有很强的抗氧化活性和抑菌能力。

所述B. paramycoides 1805通过适应性驯化后，在液体LB培养基亚硒酸钠的最大耐受达到190mmol/L，在固体平板中亚硒酸钠的最大耐受达到140mmol/L。

本发明公开了一种耐硒芽孢杆菌的选育和应用。该B. paramycoides 1805由本实验室自主筛选、鉴定，可在24h内将2mmol/L的亚硒酸钠充分合成单质纳米硒。该耐硒芽孢杆菌的选育方法具体如下：从富硒土壤中采集样品，培养纯化后，分别取100μL待测悬浮液接种到5mmol/L亚硒酸钠固体LB培养基中，37℃培养，选出24h内具有合成能力的菌落；将筛选出的菌株接种到2mmol/L亚硒酸钠LB培养基中，37℃、200rmp/min震荡培养24h后，取上清在紫外分光光度计测OD₅₀₀；通过响应面优化温度、pH、转速，得到B. paramycoides 1805最佳生长条件和还原条件；对B. paramycoides 1805进行适应性驯化，增加其耐受环境能力，发现B. paramycoides 1805在液体LB培养基中耐受性提高至190 mmol/L，固体平板中耐受性也提高至140 mmol/L，该耐受能力高于目前市面上绝大部分菌株对亚硒酸钠的耐受能力。

有益效果：本发明与现有技术相比，具有如下优势：

本发明分离纯化出一株芽孢杆菌B. paramycoides 1805，其具有良好的纳米硒合成效率、极高的亚硒酸钠耐受性、优良的抗氧化能力、显著的抑菌效果、较好的环境适应性，在高富硒环境的治理及纳米硒的工业规模生产中具有广泛的应用前景。在5 mmol/L亚硒酸钠LB培养基中，该菌株对亚硒酸钠的还原率可达到65.7%，其对亚硒酸钠的耐受能力为80mmol/L。通过适应性进化，发现该菌株在液体和固体平板中对亚硒酸钠的最终耐受性分别达到190mmol/L、140mmol/L，原来耐受性的2.375倍与1.75倍。本发明为微生物合成纳米硒市场提供了一种新菌株，具有极其广阔的应用前景和工业价值。

附图说明

图1是B. paramycoides 1805与其他细菌构建的进化树示意图；

图2是B. paramycoides 1805合成纳米硒适应性驯化效果图，其中，左图a-l，液体培养基中亚硒酸钠的添加量为80-190mmol/L，右图，a-g，固体培养基中亚硒酸钠的添加量为80-140 mmol/L；

图3是B. paramycoides 1805合成纳米硒粒径分布图；

图4是B. paramycoides 1805合成纳米硒电镜图；

图5是B. paramycoides 1805合成纳米硒抗氧化能力图，其中，清除DPPH能力（a）、还原能力（b）。

具体实施方式

实施例1：B. paramycoides 1805的筛选

从淮安市洪泽湖养殖塘采集肥沃的底泥备用。称取1g土壤分装到100mlLB培养基中，每个土壤厌氧与耗氧方式各培养3瓶，置于37℃、200rmp/min摇床培养一周，观察培养基是否变浑浊，细菌是否生长较好。然后摇匀在操作台上，用灭菌移液枪吸取适量的上层液体用去离子水梯度稀释，分别各取0.2ml置于LB固体培养皿中，涂布均匀后，用封口膜将培养皿密封。待无液体流动后，倒置于37℃培养箱中培养1~7d。分离得到的微生物多次用平板划线进行纯化，挑出单菌落用斜面培养基保存于4℃冰箱中，进行记录。厌氧方式同理，只是在液体LB培养基中采用液体石蜡与空气隔绝，静置培养7d，在固体平板中采用双层平板法。在培养皿中涂布划线后，保存方法同上。初步筛选出的菌株，在5mmol/L的亚硒酸钠固体LB培养基平板及液体LB培养基中分别接种100μl待测菌悬浮液，每个菌株各3各平行重复，37℃培养2d，挑选出能在24h合成红色单质的菌株。

实施例2：B. paramycoides 1805的16S rRNA分子学鉴定

菌株的基因组提取试剂盒（细菌）采用“Ezp柱式基因组DNA抽提试剂盒”（南京诸唯赞生物科技有限公司）进行提取:在PCR扩增仪上，以提取的基因组DNA为模板，用通用引物27-F:5'-AGAGTTTGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'跟1492-R5'-AATTACCTTGTTACGACTT-3'进行16SrRNA基因扩增，设置为: 94°C,1min; 55°C,30s; 72°C，1min; 4°C， 保温; 30个循环。PCR 扩增后得到产物跑胶验证是否单一条带后，胶试剂盒回收送到上海生工有限公司测序。得到的序列通过NCBI的GenBank数据库进行BLAST比对。并构建系统发育树。

细菌的革兰氏染色按照Phygene life sciences公司购买荣色试制盒操作，细胞形态观察采用100相差显微镜观察，按照伯杰氏手册进行操作。

经过通用物扩增出B. paramycoides 1805菌株的16srRNA基因，进行序列BLAST比对，上海生工公司扩增出来的PCR产物总长度为1450kp，将序列通过NCBI的GenBank数据库进行BLAST比对，构建系统发育树（图1），结果发现bp1805菌株属于芽孢杆菌属（Bacillus），与其Bacillus paramycoidesstrain（MH542275.1）相似度为99.97%，结合传统的生理生化特性鉴定以及16S rDNA序列分析的结果，判定菌株B. paramycoides 1805为芽孢杆菌。

实施例3：B. paramycoides 1805合成纳米硒的条件优化

配置LB培养基，调节pH（2、4、6、8、10、12）后分装在100 mL的三角瓶中，121℃、15min高压蒸汽灭菌后。无菌操作台中LB培养基三角瓶中加入无菌过滤Na₂SeO₃终浓度为2mmol/L，按1%接种量接种活化好的B. paramycoides1805菌液，分别在（20、25、30、35、37、40、42、45℃）的条件下，（0、50、100、150、200、250、300）r/min震荡培养，设置3个重复。同等条件下培养重新活化B. paramycoides 1805菌液为对照，共同培养24 h，测定亚硒酸钠还原率，以菌液同等条件下为对照。通过上述优化，B. paramycoides 1805的最优生长条件为30℃、pH 6、200 r/min。

实施例4：B. paramycoides 1805合成纳米硒适应性驯化

分别对B. paramycoides1805液体培养和固体平板培养中亚硒酸钠的浓度进行适应性驯化。首先在液体LB培养基中亚硒酸钠，发现B. paramycoides1805起始最大耐受性为80 mmol/L。然后从80 mmol/L开始重复3次耐受性，最后加大浓度到达90 mmol/L，重复3次培养后继续重复操作。如图2（左图）所示，菌株的最大耐受性达到190 mmol/L，是最早的80mmol/L的两倍多，通过此方法大大提升了耐受能力。在固体培养基平板中也从80 mmol/L开始适应性进化，重复3次加深其耐受能力，逐步增大亚硒酸钠浓度，每次重复3次，循环操作。最终发现在固体平板亚硒酸钠的耐受性达到140 mmol/L，增加了近一倍的耐受能力，如图2（右图）所示。

实施例5.B. paramycoides 1805合成纳米硒表征

将B. paramycoides 1805接种于LB液体培养基中，并添加亚硒酸钠使其终浓度为2 mmol/L，37℃震荡培养24 h。发酵液颜色明显变红后，12000rpm/min离心15 min，除去上清液，再经12000 rpm高速离心15 min，收集红色沉淀，并经无菌生理盐水反复洗涤3次，得纳米硒纯溶液。通过DLS粒度分析仪测定纳米硒粒径大小分布（图3），同时采用SEM对其形貌组成进行分析（图4）。

实施例6.B. paramycoides 1805合成纳米硒抗氧化能力分析

取B. paramycoides 1805合成纳米硒溶液400 μL与6 mL0.06 mmol/L的DPPH溶液（DPPH配置于无水乙醇溶液中）溶解在一个玻璃试管中，充分震荡，操作期间尽量避光，纳米硒单质溶液400 μL及6 mL无水乙醇做样参调零，充分震荡，以上重复3组实验，避光静置30min，期间不断震荡。紫外分光光度计测定OD₅₂₀波长为A_样品值。另外用无水乙醇溶液作参比调零，400 μL无水乙醇与6 mL的0.06 mmol/LDPPH溶液混合后，同理也需要避光静置30 min，测得混合溶液的OD₅₂₀吸光度值为A_对照。同时以1 g/L的BHA和BHT作为阳性对照计算DPPH清除率。结果发现B. paramycoides 1805、BHA和BHT的DPPH清除率分别为72.79%、78.9%、75.45%，由图5（a）对比直观可知，该生物法合成的纳米硒具有较高的DPPH清除能力。

分别取50 μL、100 μL、200 μL、300 μL、400 μL、500 μL的纳米硒溶液到玻璃试管中，并加入去离子水补至0.5 mL。同时用移液枪在以上试管中分别加入2.5 mL的磷酸缓冲液跟2.5 mL1%的铁氰化钾溶液，充分溶解震荡。将以上混合物溶液50 ℃水浴20 min后加入2.5 mL10%的三氯乙酸，将以上试管室温静置10 min。然后将各个试管取2.5 mL反应溶液，加入2.5 mL蒸馏水和0.5 mL0.1%氯化铁溶液。反应10 min待颜色有明显变化后测定波长OD₇₀₀处吸光值，用不加纳米硒按以上操作溶液调零。该数值越高说明样品的还原性越强。以0.1 mg/mL的BHA和BHT作阳性对照。对于还原能力的研究结果如图5（b）所示，在一定的范围内，随着所加样品浓度的提高，纳米硒、BHA和BHT的还原能力均随之增强。随着时间的增长，效果越明显。B. paramycoides 1805合成的纳米硒最强，BHA、BHT走势相似，BHA略胜于BHT，总之最佳菌株合成的纳米硒还原能力均胜于其它两种还原能力，具有较强的还原能力，为日后应用奠定基础。

序列表

<110> 淮阴工学院

<120> 一种耐硒芽孢杆菌及其选育方法和应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1449

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgggtccct ttagcggctg gctcaaaagg ttaccccacc gacttcgggt gttacaaact 60

ctcgtggtgt gacgggcggt gtgtacaagg cccgggaacg tattcaccgc ggcatgctga 120

tccgcgatta ctagcgattc cagcttcatg taggcgagtt gcagcctaca atccgaactg 180

agaacggttt tatgagatta gctccacctc gcggtcttgc agctctttgt accgtccatt 240

gtagcacgtg tgtagcccag gtcataaggg gcatgatgat ttgacgtcat ccccaccttc 300

ctccggtttg tcaccggcag tcaccttaga gtgcccaact taatgatggc aactaagatc 360

aagggttgcg ctcgttgcgg gacttaaccc aacatctcac gacacgagct gacgacaacc 420

atgcaccacc tgtcactctg ctcccgaagg agaagcccta tctctagggt tttcagagga 480

tgtcaagacc tggtaaggtt cttcgcgttg cttcgaatta aaccacatgc tccaccgctt 540

gtgcgggccc ccgtcaattc ctttgagttt cagccttgcg gccgtactcc ccaggcggag 600

tgcttaatgc gttaacttca gcactaaagg gcggaaaccc tctaacactt agcactcatc 660

gtttacggcg tggactacca gggtatctaa tcctgtttgc tccccacgct ttcgcgcctc 720

agtgtcagtt acagaccaga aagtcgcctt cgccactggt gttcctccat atctctacgc 780

atttcaccgc tacacatgga attccacttt cctcttctgc actcaagtct cccagtttcc 840

aatgaccctc cacggttgag ccgtgggctt tcacatcaga cttaagaaac cacctgcgcg 900

cgctttacgc ccaataattc cggataacgc ttgccaccta cgtattaccg cggctgctgg 960

cacgtagtta gccgtggctt tctggttagg taccgtcaag gtgccagctt attcaactag 1020

cacttgttct tccctaacaa cagagtttta cgacccgaaa gccttcatca ctcacgcggc 1080

gttgctccgt cagactttcg tccattgcgg aagattccct actgctgcct cccgtaggag 1140

tctgggccgt gtctcagtcc cagtgtggcc gatcaccctc tcaggtcggc tacgcatcgt 1200

tgccttggtg agccgttacc tcaccaacta gctaatgcga cgcgggtcca tccataagtg 1260

acagccgaag ccgcctttca atttcgaacc atgcggttca aaatgttatc cggtattagc 1320

cccggtttcc cggagttatc ccagtcttat gggcaggtta cccacgtgtt actcacccgt 1380

ccgccgctaa cttcataaga gcaagctcta atccatcgct cgactggcaa gattgggacc 1440

gcccccgcc 1449

Claims (2)

1.一种耐硒芽孢杆菌，其保藏号为CGMCC NO.24522，分类命名为副蕈状芽孢杆菌Bacillus paramycoides 1805。

2.权利要求1所述的耐硒芽孢杆菌在合成纳米硒中的用途。

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