CN114621893B

CN114621893B - 一种枯草芽孢杆菌及其培养方法和应用

Info

Publication number: CN114621893B
Application number: CN202210092950.6A
Authority: CN
Inventors: 刘梦璐; 曹建帮; 袁卫涛; 李宁; 周焕霞; 高学秀; 宁占国; 陈又铭; 段睿
Original assignee: Shandong Starlight Initiation Biology Technology Co ltd
Current assignee: Shandong Starlight Initiation Biology Technology Co ltd
Priority date: 2022-01-26
Filing date: 2022-01-26
Publication date: 2022-11-18
Anticipated expiration: 2042-01-26
Also published as: CN114621893A

Abstract

本发明涉及微生物技术领域，公开了一种枯草芽孢杆菌，该菌种于2021年11月20日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号CGMCC No.23944。奔赴买那个还公开了该草芽孢杆菌的培养方法以及用该草芽孢杆菌制备D‑阿洛酮糖的应用。本发明显著提高了D‑阿洛酮糖生产过程中的转化率；且产生的D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶的酶作用最适pH范围广泛，更利于生产过程中对条件的控制。

Description

一种枯草芽孢杆菌及其培养方法和应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，特别涉及一种枯草芽孢杆菌及其培养方法与应用。

背景技术

枯草芽孢杆菌，属芽孢杆菌属，为革兰氏阳性需氧型菌。单个细胞0.7-0.8×2-3微米，芽孢0.6-0.9×1.0-1.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色至淡黄色。是食品级微生物，属于GRAS级微生物，不存在内毒素等食品安全问题，被广泛应用于各种工业酶制剂中。

D-阿洛酮糖是稀有糖的一种，是D-果糖C-3位的差向异构体。D-阿洛酮糖不仅是一种无热量的甜味剂，而且可作为其他稀有糖生产的重要原料。目前D-阿洛酮糖的生产方式主要为生物合成法，但普遍存在转化率低、酶活稳定性差等问题。

中国专利文献CN 104894047 B(申请号201510294626.2)公开了基于D-丙氨酸缺陷型筛选标记的表达D-阿洛酮糖 3-差向异构酶的重组枯草芽孢杆菌的构建方法。该发明得到的枯草芽孢杆菌发酵液总酶活达16U/mL，但还达不到工业生产的要求。

因此，寻找一种产高酶活的D-阿洛酮糖3-差向异构酶生产菌株及其合适的培养条件成为解决D-阿洛酮糖大规模生产应用的关键。

发明内容

本发明的目的是解决当前D-阿洛酮糖生产过程中转化率普遍偏低且酶活稳定性差的问题，提供了一种枯草芽孢杆菌及其培养方法与应用。该枯草芽孢杆菌产酶酶活稳定，且其培养方法可高效转化D-果糖生成D-阿洛酮糖，可显著降低生产成本。

本发明是通过如下技术方案实现的：

一种枯草芽孢杆菌，于，2021年11月19日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号CGMCC No.23944。

所述枯草芽孢杆菌的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）出发菌株活化，将出发菌株在LB培养基中摇瓶培养得到菌体，然后将菌体用生理盐水调整菌悬液活菌数为10⁷-10⁸ CFU/mL；

（2）紫外诱变，取倒有菌悬液的培养皿放在紫外灯下进行诱变，然后用无菌生理盐水将诱变后的菌悬液稀释100倍，均匀涂布于固体培养基中进行培养；

（3）复筛，对致死率在70-80%的菌株进行复筛，复筛时挑选菌落大、边缘不整齐、镜检为革兰氏阳性菌、细胞形态成短杆状的单菌落进行酶活力验证，得目标菌株。

所述步骤（1）出发菌株活化中药瓶培养的条件为37℃、200r/min的摇床上振荡培养，达到对数期，将培养好的菌液4000r/min条件下离心10min，得到菌体。

所述步骤（2）紫外诱变中的诱变条件为在紫外灯下方30cm处，照射3min。

所述草芽孢杆菌在制备D-阿洛酮糖中的应用。

一种利用权利前述的草芽孢杆菌制备D-阿洛酮糖的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

步骤a取枯草芽孢杆菌的菌体发酵液离心取沉淀，沉淀用缓冲试剂重悬；

步骤b取重悬后菌液用高压均质机连续均质3次，进行离心，上清液经0.45μm滤膜过滤即为粗酶制剂；

步骤c将步骤b制得的粗酶制剂与D-果糖溶液混合转化、离心，得到D-阿洛酮糖粗液；

步骤d将步骤c制得的阿洛酮糖粗液经脱色过滤、离子交换、真空浓缩、色谱分离、浓缩、结晶、干燥后，制得晶体阿洛酮糖。

所述步骤a中菌体发酵液的制备过程为包括，步骤A，取枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）XGSC-001接种于LB固体培养基中，在37℃的条件下，活化培养13h，制得活化菌株；

步骤B，取步骤A制得的活化菌株，接种于种子培养基中，在37℃的条件下，扩增培养14h，制取种子液；

步骤C取步骤B制得的种子液，按体积比3%的比例接种于发酵培养基中，在37℃下培养10h，即可得菌体发酵液。

所述步骤a中洗涤菌体采用试剂为pH7.5、浓度50 mmol/L的Tris-HCl缓冲液。

所述步骤B种子培养基组分按重量百分比为包括蛋白胨1%，酵母浸粉0.5%，氯化钠1%，余量水；pH 7.0。

所述步骤C中发酵培养基组分按重量百分比为包括葡萄糖1.5%，酵母浸粉2%，蛋白胨1%，氯化钠0.8%，七水硫酸镁0.1%，磷酸氢二钠0.1%，硫酸锰0.001%，余量水；pH 7.0。

本发明具有以下技术效果：

（1）本发明首次获得的产高酶活的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）XGSC-001，其发酵液中的D-阿洛酮糖 3-差向异构酶酶活可达到87 U/ml，是出发菌株产酶酶活的5.44倍，显著提高了D-阿洛酮糖生产过程中的转化率；且产生的D-阿洛酮糖 3-差向异构酶的酶作用最适pH范围广泛（5.0-7.5），更利于生产过程中对条件的控制。

（2）本发明所述的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）XGSC-001应用方法中，转化过程中额外添加的0.5-1.2mmol/L的Co²⁺及与D-果糖摩尔比为1：2的硼酸溶液使得该菌株所产D-阿洛酮糖 3-差向异构酶酶活力更加稳定，且转化率提升至原来发酵液转化率（39.19%）的2倍；本发明摈弃传统的全细胞转化，采取高压均质破碎的方法获取粗酶制剂，不仅简单易行，且极大提高了酶与底物果糖溶液的接触面积，利于反应的进行。

附图说明

下面结合附图对本发明作进一步的说明。

图1为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）XGSC-001的平板培养图。

图2为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）XGSC-001的革兰氏染色图。

图3为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）XGSC-001所产D-阿洛酮糖 3-差向异构酶的热稳定性。

图4为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）XGSC-001所产D-阿洛酮糖 3-差向异构酶的pH稳定性。

图5为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）XGSC-001所产D-阿洛酮糖 3-差向异构酶的酶活力曲线。

图6为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）XGSC-001所产D-阿洛酮糖 3-差向异构酶的储存稳定性。

图7为实施例1与对比例1相比生产过程的转化曲线。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细地说明。除非特殊说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。

一种枯草芽孢杆菌，该菌株分类学命名为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），记作枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）XGSC-001，2021年11月19日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号CGMCC No.23944，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中国科学院微生物研究所。

本发明所述枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）XGSC-001的出发菌株为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）SK38.001，经过紫外诱变筛选获得。诱变筛选步骤如下：

（1）出发菌株活化

将出发菌株接种在Luria-Bertani培养基（液体LB培养基）中，置于37℃、200r/min的摇床上振荡培养14h达到对数期，将培养好的菌液4000r/min条件下离心10min，得到菌体；向加入适量生理盐水，调整菌悬液活菌数为10⁷-10⁸ CFU/mL。

（2）紫外诱变

取倒有15mL菌悬液的培养皿放在紫外灯（30W）下方30cm处，照射3min；用无菌生理盐水将诱变后的菌悬液稀释100倍，取0.15mL均匀涂布于固体LB培养基中进行培养。

（3）复筛

复筛时挑选步骤（二）固体培养基中菌落大、边缘不整齐、镜检为革兰氏阳性菌、细胞形态成短杆状的单菌落进行酶活力验证，最终得到产高酶活D-阿洛酮糖 3-差向异构酶的枯草芽孢杆菌菌株（Bacillus subtilis）XGSC-001。

其中酶活力验证方法如下：

①种子液培养

从平板上挑取单菌落于50mL LB液体培养基中，于37 ºC，200 rpm摇瓶（装液量10%）培养12h。

②发酵培养

将种子液以3%的接种量转接至发酵培养基，定期取样检测酶活力。取1mL发酵液离心，弃去上清，细胞用50 mmol/L，pH 7.5的Tris/HCl缓冲液重悬至1mL，取3200uL 100 g/L的果糖溶液和上述菌体溶液上清液800uL混合，在55°C水浴中保温10 min后，取700μL离心后上清液与1.4mL超纯水混合，液相色谱检测阿洛酮糖转化率。

酶活计算公式：

式中：

U为在上述反应条件下1min内生成1μmol的D-阿洛酮糖所需的酶量；

mF为反应体系中果糖的质量，g；

m酶为反应体系中加酶的质量，g；

MA为阿洛酮糖的摩尔质量，g/mol；

t为体系反应时间，min。

高效液相色谱法(HPLC)测定D-阿洛酮糖含量：

HPLC条件：Waters e2695型高效液相色谱仪；色谱柱：Carbomix Ca-NP；流动相：超纯水；流速：0 .6mL/min；柱温：85℃；检测器：示差折光检测器；检测器温度：30℃；进样量：10μL。

根据本发明优选的，上述所有步骤离心均在4℃、12000 r/min条件下进行，离心10 min。

实施例1：

上述枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）XGSC-001的的培养方法，步骤如下：

（A）取枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）XGSC-001接种于LB固体培养基中，在37℃的条件下，活化培养13h，制得活化菌株；

（B）取步骤（A）制得的活化菌株，接种于种子培养基中，在37℃的条件下，扩增培养14h，制取种子液；

（C）取步骤（B）制得的种子液，按体积比3%的比例接种于发酵培养基中，在37℃下培养10h，即可得菌体发酵液。

根据本发明优选的，所述步骤（B）种子培养基组分的重量百分比为：蛋白胨1%，酵母浸粉0.5%，氯化钠1%，余量水，pH 7.0。

根据本发明优选的，所述步骤（C）发酵培养基组分的重量百分比为：葡萄糖1.5%，酵母浸粉2%，蛋白胨1%，氯化钠0.8%，七水硫酸镁0.1%，磷酸氢二钠0.1%，硫酸锰0.001%，余量水，pH 7.0。

上述枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）XGSC-001在制备D-阿洛酮糖中的应用。

上述应用，包括以下步骤：

（a）取前述培养得到的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）XGSC-001的菌体发酵液离心取沉淀，沉淀用缓冲试剂重悬；

（b）取重悬后菌液用高压均质机连续均质3次，进行离心，上清液经0.45μm滤膜过滤即为固体粗酶制剂；（c）将步骤（b）制得的粗酶制剂与D-果糖溶液混合转化、离心，得到D-阿洛酮糖粗液；

（d）将步骤（c）制得的阿洛酮糖粗液经脱色过滤、离子交换、真空浓缩、色谱分离、浓缩、结晶、干燥后，制得晶体阿洛酮糖。根据本发明优选的，所述步骤（a）中洗涤菌体采用试剂为pH7.5、浓度50 mmol/L的Tris-HCl缓冲液；

根据本发明优选的，其特征在于，所述步骤（b）中高压均质条件为100MPa，共均质8min；外通冷冻循环水，防止过程升温。

根据本发明优选的，其特征在于，所述步骤（c）中D-果糖溶液为质量百分比60%的溶液，粗酶制剂添加量为500U/（g果糖），反应条件为55℃下反应20h。

根据本发明优选的，所述步骤（c）中所述粗酶制剂与D-果糖溶液混合过程需要加入1.0 mmol/L的Co²⁺及与103.1g/L的硼酸溶液；具体的，先把D-果糖固体加水溶解成为55%-60%（质量比）浓度的果糖溶液；之后向混合溶液中加入钴离子和硼酸溶液；反应体系建立完全后，再加入粗酶制剂，其中钴离子以氯化钴的形式添加，主要作用是催化转化反应的进行。

根据本发明优选的，所述步骤（c）中转化结束后通过离心的方法获得上清液，将pH调节到4.5解除硼酸根与 D-阿洛酮糖的络合，然后通过结晶的方法取出硼酸根，实现硼酸的重复利用。

根据本发明优选的，上述所有步骤离心均在4℃、10000 r/min条件下进行，离心15min。

实施例2：

上述枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）XGSC-001所产D-阿洛酮糖 3-差向异构酶的酶学性质测定。

（1）在45℃、47.5℃、50℃、52.5℃、55℃、57.5℃、60℃、62.5℃、65℃下分别测定所产D-阿洛酮糖 3-差向异构酶的酶活，结果如附图3所示，表明，该酶最适作用温度为55℃，在50-60℃之间具有较高的酶活；

（2）在55℃，pH4-9的条件下分别测定所产D-阿洛酮糖 3-差向异构酶的酶活，结果如附图4，表明，该酶最适反应pH值为6.5，在pH值为5.0-7.5之间酶活较为稳定；

（3）在55℃、pH6.5条件下测定所产D-阿洛酮糖 3-差向异构酶的酶活，结果表明，该酶活力为87 U/ml，是出发菌株产酶转化率的5.44倍；

（4）在55、60、65、70℃下保存1h、2h、4h、6h、8h，分别测定所产D-阿洛酮糖 3-差向异构酶的酶活，转化条件中添加1.0 mmol/L的Co²⁺及103.1g/L的硼酸溶液。结果如附图6，表明，该酶在55℃下保存6h仍能保持80%以上酶活，60℃以上条件下保存2h仍能保持45%以上酶活。

对比例1：

（A）取枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）XGSC-001接种于LB固体培养基中，在42℃的条件下，活化培养7h，制得活化菌株；

（B）取步骤（A）制得的活化菌株，接种于种子培养基中，在42℃的条件下，扩增培养9 h，制取种子液；

根据本发明优选的，所述步骤（B）种子培养基组分的重量百分比为：蛋白胨1%，酵母浸粉0.5%，氯化钠1%，余量水，pH 6.0。

根据本发明优选的，所述步骤（C）发酵培养基组分的重量百分比为：葡萄糖1.5%，酵母浸粉2%，蛋白胨1%，氯化钠0.8%，七水硫酸镁0.1%，磷酸氢二钠0.1%，硫酸锰0 .001%，余量水，pH 6.0。

上述应用，包括以下步骤：

（a）取枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）XGSC-001的菌体发酵液离心取沉淀，沉淀用缓冲试剂重悬；

（b）取重悬后菌液用高压均质机连续均质3次，进行离心，上清液经0.45μm滤膜过滤即为粗酶制剂；

（c）将步骤（b）制得的粗酶制剂与D-果糖溶液混合转化、离心，得到D-阿洛酮糖粗液；

（d）将步骤（c）制得的阿洛酮糖粗液经脱色过滤、离子交换、真空浓缩、色谱分离、浓缩、结晶、干燥后，制得晶体阿洛酮糖。

根据本发明优选的，所述步骤（a）中洗涤菌体采用试剂为pH7.5、浓度50 mmol/L的Tris-HCl缓冲液；

根据本发明优选的，其特征在于，所述步骤（b）中高压均质条件为100MPa，均质8min；外通冷冻循环水，防止过程升温。

根据本发明优选的，其特征在于，所述步骤（c）中D-果糖溶液为质量百分比60%的溶液，粗酶制剂添加量为500U/g果糖，反应条件为55℃下20h。

对比分析：

在不同转化时间点分别取实施例1 和对比例1，在沸水中加热5分钟终止该反应，并测量样品中D-果糖与D-阿洛酮糖的浓度。不同反应时间的D-阿洛酮糖产量显示在下表1中，并依据表1中的数据制作曲线图7。

表1不同反应时间的D-阿洛酮糖产量

结果显示，反应18小时，以实施例培养的枯草芽孢杆菌产生的粗酶为催化剂的反应体系中D-阿洛酮糖的转化率为78.38%；而以对比例培养的枯草芽孢杆菌产生的粗酶为催化剂的反应体系中D-阿洛酮糖转化率仅为28.28%.由上述结果可以看出，培养条件不在本发明所述权利要求范围内时，D-阿洛酮糖的转化率大幅降低。

通过实施例2、附图6看出添加Co^2+,使得酶活力更加稳定；通过对比分析及附图7中看出添加Co^2+后转化率是原来发酵液转化率的2倍。

Claims

1.一种利用草芽孢杆菌制备D-阿洛酮糖的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

步骤d将步骤c制得的阿洛酮糖粗液经脱色过滤、离子交换、真空浓缩、色谱分离、浓缩、结晶、干燥后，制得晶体阿洛酮糖；

所述枯草芽孢杆菌，于2021年11月19日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号CGMCC No. 23944；

所述步骤c中所述粗酶制剂与D-果糖溶液混合过程需要加入1.0 mmol/L的Co²⁺及103.1g/L的硼酸溶液。

2.根据权利要求1所述的制备D-阿洛酮糖的方法，其特征在于：所述步骤a中菌体发酵液的制备过程为包括，步骤A，取所述枯草芽孢杆菌接种于LB固体培养基中，在37℃的条件下，活化培养13h，制得活化菌株；

步骤C取，将步骤B制得的种子液，按体积比3%的比例接种于发酵培养基中，在37℃下培养10h，即可得菌体发酵液。

3.根据权利要求1所述的制备D-阿洛酮糖的方法，其特征在于：所述步骤a中洗涤菌体采用试剂为pH7.5、浓度50 mmol/L的Tris-HCl缓冲液。

4.根据权利要求2所述的制备D-阿洛酮糖的方法，其特征在于：所述步骤B种子培养基组分按重量百分比为包括蛋白胨1%，酵母浸粉0.5%，氯化钠1%，余量水；pH 7.0。

5.根据权利要求2所述的制备D-阿洛酮糖的方法，其特征在于：所述步骤C中发酵培养基组分按重量百分比为包括葡萄糖1.5%，酵母浸粉2%，蛋白胨1%，氯化钠0.8%，七水硫酸镁0.1%，磷酸氢二钠0.1%，硫酸锰0.001%，余量水；pH 7.0。