CN108102995A - 一种d-阿洛酮糖3-差向异构酶生产菌株及其固定化方法 - Google Patents
一种d-阿洛酮糖3-差向异构酶生产菌株及其固定化方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶生产菌株及其固定化方法，属于生物工程技术领域。本发明构建了产D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶的重组枯草芽孢杆菌pHY300PLK‑DPEase，以该重组菌作为生产菌株，固定化细胞后酶活回收率达64％，固定化细胞的最适温度较全细胞提高了5℃，最适pH无明显变化；以300g/L的果糖为底物连续转化7次，转化率仍可达28％，残留酶活还有81％。该固定化方法简单易行，固定化颗粒性能优异，具有很高的工业化应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种D-阿洛酮糖3-差向异构酶生产菌株及其固定化方法，属于生物工程技术领域。
背景技术
稀少糖是指一类在自然界中存在但含量极少的一类单糖及其衍生物，目前已发现的稀少糖种类有34种，这些稀少糖作为新型的功能型甜味剂，其已被广泛应用于膳食、医药和保健等领域。D-阿洛酮糖是D-果糖C3位上的同分异构体，属于稀少糖的一种。它的甜度是蔗糖的70％，但是能量值只有其0.3％，因此具有多种独特的生理学和营养学功能。
D-阿洛酮糖在自然界中存在极少，目前大多通过酶法催化生产D-阿洛酮糖，但是酶法催化也存在不足，例如重组酶稳定性差不足以满足工业化生产的需求，而且酶液无法重复利用成本较高。D-阿洛酮糖3-差向异构酶(DPEase)，可催化D-果糖C3位置差向异构化从而获得D-阿洛酮糖。近几年来，不同来源的微生物被逐渐发现并在宿主中进行克隆表达，但是D-阿洛酮糖作为一种食品添加剂，安全性问题显得尤为重要。
枯草芽孢杆菌作为一种食品安全菌，属于GRAS微生物，不存在内毒素等安全性问题，被广泛应用于各种工业酶制剂中。而且枯草芽孢杆菌作为表达系统具有高效的目的蛋白分泌能力和发酵条件简单等优点，非常适合作为DPEase的表达宿主。但是目前关于DPEase报道都集中在寻找不同来源的基因进行克隆表达，存在表达量低的问题。2016年来自天津工业微生物研究所的孙媛霞团队，通过筛选合适的启动子，最终在7.5-L发酵罐中重组枯草芽孢杆菌产DPEase酶活可达95U/mL，是目前报道的最高水平。较低的蛋白表达无法满足生产需要。因此选取一株高产DPEase酶蛋白的生产菌株显得尤为重要。
因为DPEase天然状态下是一种胞内酶，破壁得到工业化生产所需的大量酶液不仅耗时费力，而且成本高。在工业化生产D-阿洛酮糖的过程中，游离酶无法重复使用，同时游离酶一般热稳定性差，不适合工业化的连续生产。
发明内容
本发明第一个目的在于提供一种表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶的重组菌，所述重组菌以枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis(CCTCC M2016536)为宿主，表达来源于解纤维梭菌的D-阿洛酮糖3-差向异构酶。
在本发明的一种实施方式，所述编码D-阿洛酮糖3-差向异构酶基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
在本发明的一种实施方式，所述重组菌的构建方法为：将核苷酸序列为SEQ IDNO.1的D-阿洛酮糖3-差向异构酶基因连接到表达载体pHY300PLK上，构建重组质粒pHY300PLK-DPEase，将重组质粒pHY300PLK-DPEase转入枯草芽孢杆菌后得到重组菌。
本发明第二个目的是提供一种利用所述的枯草芽孢杆菌生产D-阿洛酮糖3-差向异构酶的方法，所述方法具体步骤如下：将重组菌接种于LB液体培养基中，于35-38℃、150-250rpm培养8-10h，然后以3-6％的接种量接种至TB培养基中，于30-33℃、150-200rpm培养40-52h。将获得的发酵液稀释后，超声破壁离心后即获得破壁上清粗酶液。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵液稀释至OD600为4-5。
本发明的第三个目的是提供一种D-阿洛酮糖3-差向异构酶的固定化细胞方法，所述固定化细胞的方法步骤如下：
1)培养权利要求1-3所述的重组菌得到发酵液，将发酵液离心后用缓冲液复溶，添加硅藻土；
2)将步骤1)所得的菌悬液与海藻酸钠溶液均匀混合，调节细胞终浓度；
3)将步骤2)所得的混合液用针式注射器以40-60滴/min的速度滴入的CaCl2中成型，4-6℃静置硬化2-3h。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤1)中硅藻土的添加量按质量分数为0.5％-3％。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤1)中硅藻土的添加量按质量分数为0.5％-2％。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤2)中海藻酸钠的添加量按质量分数为0.5％-4％。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤2)中海藻酸钠的添加量按质量分数为1％-2％。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤2)中细胞终浓度为10g/L-200g/L。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤2)中细胞终浓度为20g/L-50g/L。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤3)中CaCl2的添加量按质量分数为0.5％-8％。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤3)中CaCl2的添加量按质量分数为1％-4％。
在本发明的一种实施方式中，所述固定化细胞在制备D-阿洛酮糖上的应用。
本发明的有益效果：
(1)获得一株高产DPEase蛋白的生产菌株，发酵48h胞内酶活达到最高178U/mL；
(2)将产酶的重组菌固定化后可以反复回收利用，在实现连续化生产的同时还能简化下游的分离纯化等操作，具有很大的优越性；固定化细胞具有良好的连续转化能力，连续转化7个批次仍保持28％的转化率；
(3)固定化细胞热稳定性明显提高，55℃下游离酶半衰期为3h，而固定化细胞在连续反应7个批次后仍保留81％的残留酶活。
附图说明
图1重组菌摇瓶发酵破壁上清SDS-PAGE电泳图；
图2固定化细胞转化D-果糖生产D-阿洛酮糖。
具体实施方式
实施例1：解纤维梭菌DPEase编码基因的克隆及表达载体的构建
根据数据库中的DPEase基因和大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体pHY300PLK序列分别设计带有15bp同源臂的两对引物P1和P2、P3和P4：
P1：5’-TAAGGAGTGTCAAGAATGAAACATGGCATC-3’
P2：5’-TTTATTACCAAGCTTTTAGCTATGTTTATGA-3’
P3：5’-TCATAAACATAGCTAAAAGCTTGGTAATAAA-3’
P4：5’-GATGCCATGT TTCATTCTTGACACTCCTTA-3’
分别以带有DPEase基因的质粒和pHY300PLK载体为模板，克隆含有15bp同源臂的目的基因和pHY300PLK载体，将PCR产物分别胶回收，用infusion进行无缝连接。连接体系：目的基因2μL，pHY300PLK 0.5μL，infusion 1μL，ddH2O 1.5μL。将上述体系混匀后放置在50℃水浴中孵化30min后，立即转移到冰盒中冰浴5min，然后将连接产物转化JM109感受态，涂布含有氨苄抗性的LB平板，37℃培养10h后，挑取转化子酶切验证正确后送交测序，测序正确的克隆子即重组质粒pHY300PLK-DPEase。
实施例2：重组质粒pHY300PLK-DPEase的转化
1)新鲜LB平板(LB固体培养基g/L：蛋白胨10，酵母膏5，NaCl 10，0.2琼脂粉)挑枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis(CCTCC M2016536)单菌落接种于10mL LB液体培养基中，37℃，200rpm培养10.5h。
2)取2.5mL过夜培养物转接入40mL加0.5M的山梨醇LB培养基，37℃，200rpm震荡培养4.5h。
3)将菌液冰浴10min，然后5000rpm，4℃，离心5min收集菌体。
4)用50mL预冷的电转培养基(山梨醇0.5M，甘露醇0.5M，葡萄糖10％)洗涤菌体，5000rpm，4℃，离心5min去上清，如此漂洗4次。
5)将洗涤后的菌体重悬于1mL电转培养基中，分装到1.5mL EP管中，每管装200μL感受态细胞。
6)将200μL感受态细胞中加入10μL重组质粒，冰浴孵育15min，加入预冷的电转杯(2mm)中，电击一次。电转仪设置：2.4kv，25uF，200Ω，电击1次。
7)电击完毕立即加入1mL复苏培养基RM(山梨醇0.5M，甘露醇0.38M，蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L)吹吸，37℃，200rpm，复苏3h后，涂板。37℃，过夜培养，挑取菌落至含四环素的LB液体培养基中，进行验证，得到重组菌枯草芽孢杆菌BS-pHY300PLK-DPEase。
实施例3：摇瓶发酵产酶
1)发酵培养
将实施例2中得到的重组枯草芽孢杆菌BS-pHY300PLK-DPEase菌株接种于LB培养基中，在37℃下培养8-10h后以5％接种量转接至TB发酵培养基中，33℃、200rpm恒温培养48h产酶。发酵结束后，超声破壁获取粗酶液。
LB培养基(g/L)：蛋白胨10，酵母膏5，NaCl 10
TB培养基(g/L)：蛋白胨10，酵母粉24，甘油5，K2HPO4·3H2O 16.43，KH2PO42.31。
2)酶活测定
将200μL适当稀释的酶液加入到800μL含有果糖的HEPES缓冲液(20mM/L，pH8.0，0.1mmol/L Co2+)中，使果糖终浓度80g/L。振荡混匀后置于55℃水浴锅中反应10min，煮沸10min灭酶终止反应。样品离心过膜后，经高效液相色谱(HPLC)分析，检测器为示差检测器。酶活单位定义：在pH 8.0，55℃环境下，每分钟内产生1μmoL的D-阿洛酮糖(D-psicose)为一个酶活单位。
发酵48h胞内酶活达到最高178U/mL，蛋白电泳结果显示在33kDa处有一条与理论分子量一致的条带(图1)。
实施例4：海藻酸钠浓度对固定化细胞酶活回收率的影响
配置终浓度为质量分数0.5％、1％、2％、3％、4％的海藻酸钠溶液，然后将实施例3的菌株发酵生产D-阿洛酮糖3-差向异构酶得到的发酵液，离心收集菌体，用缓冲液复溶添加到配好的海藻酸钠中使细胞终浓度50g/L，将得到的体系用针头式注射器以60滴/min的速度滴入2％的CaCl2中成型，并于4℃冰箱静置3h硬化；将硬化后的微球弃去上清，用去离子水洗涤2-3次，即得到固定化细胞。结果如表1所示，显示酶活回收率随着海藻酸钠浓度的增加呈现先升高后降低的趋势，当海藻酸钠终浓度为2％时酶活回收率最高可达42％。
表1海藻酸钠浓度对固定化细胞酶活回收率的影响
实施例5：细胞终浓度对固定化细胞酶活回收率的影响
配置终浓度为2％的海藻酸钠溶液，然后将实施例3的菌株发酵生产D-阿洛酮糖3-差向异构酶得到的发酵液，离心收集菌体，用缓冲液复溶添加到配好的海藻酸钠中使细胞终浓度分别为10g/L、20g/L、50g/L、100g/L、150g/L、200g/L，将得到的体系用针头式注射器以60滴/min的速度滴入2％的CaCl2中成型，并于4℃冰箱静置3h硬化；将硬化后的微球弃去上清，用去离子水洗涤2-3次，即得到固定化细胞。结果如表2所示，显示固定化细胞的酶活回收率随着包埋菌体浓度的增加而增加，但是当菌体包埋超过50g/L时，酶活回收率从42％降至19％，所以选取50g/L作为固定化细胞的最适包埋量。
表2细胞终浓度对固定化细胞酶活回收率的影响
实施例6：CaCl2浓度对固定化细胞酶活回收率的影响
配置终浓度为2％的海藻酸钠溶液，然后将实施例3的菌株发酵生产D-阿洛酮糖3-差向异构酶得到的发酵液，离心收集菌体，用缓冲液复溶添加到配好的海藻酸钠中使细胞终浓度50g/L，将得到的体系用针头式注射器以60滴/min的速度滴入质量分数分别为0.5％、1％、2％、4％、6％、8％的CaCl2中成型，并于4℃冰箱静置3h硬化；将硬化后的微球弃去上清，用去离子水洗涤2-3次，即得到固定化细胞。结果如表3所示，显示当CaCl2为2％时，固定化细胞的酶活回收率达到最高42％，当CaCl2低于或高于2％时，酶活回收率都呈现下降的趋势。
表3CaCl2对固定化细胞酶活回收率的影响
实施例7：硅藻土浓度对固定化细胞酶活回收率的影响
配置终浓度为2％的海藻酸钠溶液，然后将实施例3的菌株发酵生产D-阿洛酮糖3-差向异构酶得到的发酵液，离心收集菌体，用缓冲液复溶添加到配好的海藻酸钠中使细胞终浓度50g/L，添加质量分数分别为0％、0.2％、0.5％、1％、2％、3％的硅藻土，然后将得到的体系用针头式注射器以60滴/min的速度滴入浓度为2％的CaCl2中成型，并于4℃冰箱静置3h硬化；将硬化后的微球弃去上清，用去离子水洗涤2-3次，即得到固定化细胞。结果如表4所示，本实施方式中发现加入一定质量硅藻土可明显提高固定化细胞的酶活回收率，通过添加1％的硅藻土，相对未添加的对照组酶活回收率提高60％，最适条件下所制备的固定化细胞酶活回收率在64％以上。
表4硅藻土添加量对固定化细胞酶活回收率的影响
对固定化细胞进行酶活性质研究，结果显示与游离细胞相比，固定化细胞的最适温度从65℃提高到70℃；固定化细胞与游离细胞的最适pH无明显变化。
实施例8：固定化细胞的应用
1)将实施例7中所制备的固定化细胞用于催化D-果糖生产D-阿洛酮糖：
2)将D-果糖用pH8.0的HEPES缓冲液配置成300g/L的底物溶液；
3)将固定化细胞加入到10mL底物溶液中，反应时间为3h，反应温度55℃，摇床转速100rpm。
将反应结束的溶液弃去上清，并用去离子水清洗固定化微球2-3次，然后加入新鲜的底物溶液，继续在相同条件下反应。
如图2所示，当连续转化7个批次，D-阿洛酮糖的转化率仍可达到28％，且固定化细胞还保留81％的残余酶活。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
序列表
<110> 一种D-阿洛酮糖 3-差向异构酶生产菌株及其固定化方法
<120> 江南大学
<160> 5
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 882
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
atgaaacatg gcatctatta tgcctattgg gaacaggaat gggaagcaga ttacaaatat 60
tatattgaaa aagtggccaa attaggcttt gacattttag aaattgcagc ctctccgtta 120
ccgttttata gtgatattca gatcaatgag ctgaaagcct gcgcacatgg caatggtatc 180
acactgacgg ttggtcatgg tccgagcgcc gaacagaatc tgtctagtcc agatccggat 240
atacgcaaaa atgccaaagc gttttatacg gatctgctga aacgtctgta caaactggat 300
gttcatttga ttggcggtgc cctgtattct tattggccga tcgattatac caaaaccatc 360
gataaaaaag gcgattggga acgtagcgtg gaatcagtgc gcgaagttgc caaagttgcg 420
gaagcatgtg gcgtggattt ttgcttagaa gttctgaatc gctttgaaaa ttacctgatc 480
aatacagctc aggaaggtgt ggattttgtt aaacaggttg atcataacaa tgttaaagtg 540
atgctggata cctttcacat gaatatcgaa gaagatagca tcggtggtgc cattcgtacc 600
gccggtagct atctgggcca tctgcatacg ggcgaatgca atcgtaaagt tccaggtcgc 660
ggtcgcattc cttgggttga aatcggcgaa gccctggccg acattggcta taatggctca 720
gttgtgatgg aaccgtttgt tcgtatgggc ggcaccgtgg gtagtaatat caaagtgtgg 780
cgtgacatct ctaatggtgc agatgaaaaa atgctggatc gcgaagcaca ggcagcctta 840
gatttttcac gctatgtgtt agaatgtcat aaacatagct aa 882
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
taaggagtgt caagaatgaa acatggcatc 30
<210> 3
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
tttattacca agcttttagc tatgtttatg a 31
<210> 4
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
tcataaacat agctaaaagc ttggtaataa a 31
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 5
gatgccatgt ttcattcttg acactcctta 30
Claims (10)
1.一种表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶的重组菌，其特征在于，所述重组菌以枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis(CCTCC M2016536)为宿主，表达来源于解纤维梭菌的D-阿洛酮糖3-差向异构酶。
2.根据权利要求1所述重组菌，其特征在于，所述编码D-阿洛酮糖3-差向异构酶基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.根据权利要求1或2所述重组菌，其特征在于，所述重组菌的构建方法为：将核苷酸序列为SEQ ID NO.1的D-阿洛酮糖3-差向异构酶基因连接到表达载体pHY300PLK上，构建重组质粒pHY300PLK-DPEase，将重组质粒pHY300PLK-DPEase转入枯草芽孢杆菌后得到重组菌。
4.应用权利要求1-3任一所述重组菌生产D-阿洛酮糖3-差向异构酶的方法，其特征在于，所述方法具体步骤如下：将重组菌接种于LB液体培养基中，于35-38℃、150-250rpm培养8-10h，然后以3-6％的接种量接种至TB培养基中，于30-33℃、150-200rpm培养40-52h；将获得的发酵液稀释至OD600为4-5后，超声破壁离心后即获得破壁上清粗酶液。
5.一种固定化细胞方法，其特征在于，具体步骤如下：
1)培养权利要求1-3所述的重组菌得到发酵液，将发酵液离心后用缓冲液复溶，添加硅藻土；
2)将步骤1)所得的菌悬液与海藻酸钠溶液均匀混合，调节细胞终浓度；
3)将步骤2)所得的混合液用针式注射器以40-60滴/min的速度滴入的CaCl2中成型，4-6℃静置硬化2-3h。
6.根据权利要求5所述固定化细胞方法，其特征在于，所述步骤1)中硅藻土的添加量按质量分数为0.5％-3％。
7.根据权利要求5或6所述固定化细胞方法，其特征在于，所述步骤2)中海藻酸钠的添加量按质量分数为0.5％-4％，调节细胞终浓度为10g/L-200g/L。
8.根据权利要求5所述固定化细胞方法，其特征在于，所述步骤3)中CaCl2的添加量按质量分数为0.5％-8％。
9.根据权利要求5-8任一所述固定化细胞方法得到的固定化细胞。
10.权利要求9所述的固定化细胞在制备D-阿洛酮糖上的应用。
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Application publication date: 20180601 Assignee: ZHEJIANG HUAKANG PHARMACEUTICAL Co.,Ltd. Assignor: Jiangnan University Contract record no.: X2023980052533 Denomination of invention: A D-alloketose-3-epimerase producing strain and its immobilization method Granted publication date: 20201201 License type: Common License Record date: 20231219 Application publication date: 20180601 Assignee: SHANDONG FUKUAN BIOLOGICAL ENGINEERING Co.,Ltd. Assignor: Jiangnan University Contract record no.: X2023980052520 Denomination of invention: A D-alloketose-3-epimerase producing strain and its immobilization method Granted publication date: 20201201 License type: Common License Record date: 20231219 |