CN104560741B - 一种温度控制启动表达纤维素外切酶的黑曲霉基因工程菌的构建 - Google Patents

一种温度控制启动表达纤维素外切酶的黑曲霉基因工程菌的构建 Download PDF

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    • C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
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    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01091—Cellulose 1,4-beta-cellobiosidase (3.2.1.91)

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Abstract

本发明公开了一种温度控制启动表达纤维素外切酶活的黑曲霉基因工程菌构建，属于酶工程领域。本发明黑曲霉基因工程菌为在热激蛋白基因的位置整合有纤维素外切酶基因的黑曲霉菌株。该黑曲霉基因工程菌的构建包括如下步骤：合成核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的同源重组片段，用SalI酶切该重组片段和pWM1质粒再连接转化DH5α得到同源重组质粒；用该同源重组质粒转化农杆菌，通过农杆菌介导转化得到目的菌株。本发明实现了纤维素外切酶的热激表达，使黑曲霉的纤维素酶的酶系组成更合理，提高纤维素酶的催化能力；本发明构建的菌株不产生毒素，安全性好，适合工业化应用。

Description

一种温度控制启动表达纤维素外切酶的黑曲霉基因工程菌的 构建
技术领域
本发明发明属于酶工程领域，具体涉及一种温度控制启动表达纤维素外切酶的黑曲霉基因工程菌及其构建方法。
背景技术
纤维素是地球上最丰富的可再生资源，地球上每年因光合作用产生的纤维素达到100亿吨左右，利用纤维素生产生物能源是缓解能源危机、实现人类可持续发展的关键。
纤维素利用的关键是把纤维素降解为可发酵性的糖类-葡萄糖。纤维素的降解需要外切酶、内切酶、葡聚糖苷酶的共同作用。其中，外切酶降解纤维素的晶体结构，是纤维素酶降解纤维素的限速步骤，内切酶降解长片段的纤维素成为二聚体，是纤维素降解的关键步骤。用纤维素酶降解纤维素具有绿色、条件温和、转化率高的特点，但是纤维素较高的生产成本成为纤维素酶降解纤维素的瓶颈。
获得高产纤维素酶的菌株，降低纤维素酶的生产成本成为纤维素酶工业化利用的必由之路。纤维素酶的生产菌株主要有黑曲霉。黑曲霉由于其较高的安全性，被认为是生产纤维素酶最有应用前景的菌株之一。黑曲霉生产的纤维素酶由纤维素内切酶、葡糖苷酶和外切酶组成。其中外切酶破坏纤维素晶体结构，把晶体纤维素降解为可溶性的纤维素片段，该过程是纤维素降解的限速步骤。纤维素的高效降解需要大量的纤维素外切酶。然而，黑曲霉生产的纤维素酶中，葡糖苷酶的活性比外切酶的活性和内切酶的活性高的多。由于黑曲霉产生的纤维素外切酶活性的不足，致使黑曲霉产生的纤维素酶对天然纤维素的降解效率非常低。因此增加纤维素外切酶的活性，成为提高黑曲霉纤维素酶降解效率的重要措施。
现有的增加黑曲霉纤维素酶的方法有和高外切酶活性的纤维素酶混合或黑曲霉菌株与里氏木霉混菌发酵。与高外切酶活性纤维素酶的混合，本身就增加了混合这一道工艺，增加了降解成本。而且高外切酶活性的纤维素酶成本也较高。混菌发酵由于里氏木霉产生毒素，大大限制了纤维素酶的使用范围。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种温度控制启动表达纤维素外切酶的黑曲霉基因工程菌。本发明的目的还在于提供该菌株的构建方法。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种温度控制启动表达纤维素外切酶的黑曲霉基因工程菌，为在热激蛋白基因的位置整合有纤维素外切酶基因的黑曲霉菌株。所述的纤维素外切酶基因优选来源于里氏木霉。
上述温度控制启动表达纤维素外切酶的黑曲霉基因工程菌的构建方法包括如下步骤：
（1）合成黑曲霉热激蛋白基因的前段序列-纤维素外切酶基因序列-黑曲霉热激蛋白基因的后段序列的同源重组片段，该同源重组片段两端含有限制性内切酶酶切位点；将该重组片段连接到pWM1质粒上得到同源重组质粒。
（2）用同源重组质粒转化农杆菌。
（3）通过农杆菌介导转化得到目的菌株。
优选的，步骤（1）为：合成核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的同源重组片段，用SalI酶切；将pWM1质粒也用SalI酶切；将酶切后的重组片段和质粒通过DNA连接酶连接，并转化DH5α得到同源重组质粒。
一种构建纤维素酶高产黑曲霉菌株的方法为通过同源重组和基因工程技术将纤维素外切酶基因整合到黑曲霉热激蛋白基因的位置。
本发明利用黑曲霉的热激蛋白基因的前段序列和后段序列把里氏木霉的纤维素外切酶基因整合到热激蛋白基因的位置，从而实现了纤维素外切酶的热激表达，使黑曲霉的纤维素酶的酶系组成更合理，提高纤维素酶的催化能力。本发明构建的菌株在热激活后，发酵产生的纤维素酶的活性从出发菌株的5.6U/g增加到6.90U/g，构建的菌株没有热激的酶活是6.10 U/g。
本发明通过构温度控制启动表达纤维素外切酶的菌株，在纤维素酶降解纤维素的过程中，黑曲霉产生的外切酶活性逐渐降低，大大降低了纤维素酶的降解效率，通过升高温度，单独激活纤维素外切酶的表达，从而优化纤维素酶的酶系组成，提高纤维素酶的降解效率。本发明的黑曲霉能够内表达纤维素外切酶活性的蛋白，为纤维素酶的高产菌株，该菌株不产生毒素，安全性好，而且酶活性比例更适合降解纤维素，更适合工业化应用。
具体实施方式
以下实施例用于进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制，在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换均属于本发明的范围。若为特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1
A、同源重组质粒的构建
（1）材料：黑曲霉（Aspergillus niger）、大肠杆菌（E.coli）DH5α、农杆菌EHA105和质粒pWM1均为商业化产品。其中，黑曲霉从ATCC购买，菌株编号ATCC10582；农杆菌EHA105和质粒pMW1从Biovector公司购买。
（2）同源重组片段的合成及酶切
人工合成由黑曲霉热激蛋白基因的前段同源片段（起始密码子ATG被修改为非起始密码子以确保从纤维素外切酶基因的起始密码子表达，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示）、里氏木霉纤维素外切酶基因片段（核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示）、黑曲霉热激蛋白基因的后段同源片段（核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示）组成的同源重组片段（核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示），该同源重组片段两端含有SalI酶切位点。
往100μL该同源重组片段中加入SalI酶液2μL（TakaRa购买），30℃酶切16h，酶切后65℃水浴10min。
（3）pMW1质粒的提取及酶切
含有pWM1质粒的大肠杆菌E.coli DH5α于37℃振荡培养12h。取1.5mL菌体于EP管，以4000rpm离心3min，弃上清液。加0.1mL溶液I（1%葡萄糖，50mM EDTA pH8.0，25mM Tris-HCl pH8.0）充分混合。加入0.2 mL溶液II（0.2mM NaOH，1% SDS），轻轻翻转混匀，置于冰浴5min。加入0.15mL预冷溶液III（5mol/L KAc，pH4.8），轻轻翻转混匀，冰浴5min。以10000rpm离心20min，取上清液于另一新EP管。加入等体积的异戊醇，混匀后静置10min。再以10000rpm离心20min，弃上清。用70%乙醇0.5mL洗涤一次，抽干所有液体。待沉淀干燥后，溶于0.05mL TE缓冲液中。
提取的pWM1质粒50μL加入SalI酶液2μL（TakaRa购买），30℃酶切16h，酶切后65℃水浴10min。
（4）连接
酶切的同源重组片段100μL和酶切的pWM1质粒20μL用5μL T4 DNA ligase（TakaRa购买）16℃连接24h。
B、大肠杆菌感受态细胞的制备
（1）将E.coli DH5α置于LB培养基上，在37℃下过夜培养。
（2）高温灭菌大的离心瓶（250-500mL）以备第二天摇瓶用。
（3）准备几瓶灭菌水（总量约1.5升），保存于冷冻室中以备第二天重悬浮细胞用。
（4）转移0.2-1mL过夜培养物至装有20mL LB（或其他营养丰富的培养基）的100mL摇瓶。
（5）37℃下剧烈振荡培养6小时。
（6）监控培养液OD600值（培养1小时后每半小时测定一次）。
（7）当OD600值达到0.5-1.0时，从摇床中取出摇瓶，置于冰上冷却15分钟。
（8）细胞在4℃ 5000g下离心15分钟，弃上清液。
（9）用灭菌的冰水重悬浮细胞。先用涡旋仪或吸液管重悬浮细胞于少量体积中（几毫升），然后加水稀释至离心管的2/3体积。
（10）照上面步骤重复离心，小心弃去上清液。
（11）照上面步骤用灭菌的冰水重悬浮细胞。
（12）离心，弃上清液。
（13）用20mL灭菌的、冰冷后的10%甘油重悬浮细胞。
（14）照上面步骤离心，小心弃去上清液（沉淀可能会很松散）。
（15）用10%甘油重悬浮细胞至最终体积为2-3mL。
（16）将细胞按150μL等份装入微量离心管，于-80℃保存。
C、连接产物转化大肠杆菌
（1）在冰上解冻B步骤制得的感受态细胞。
（2）每100μL感受态细胞添加10μL连接的质粒（A步骤（4）的连接产物），冰上培育约5分钟。
（3）转移DNA/细胞混合物至冷却后的2mm电穿孔容器中。
（4）加载电转化仪，准备好300μL LB培养基。
（5）对电穿孔容器进行脉冲（200欧姆，25μFd，2.5 千伏）（检查时间常数，应该在3以上）。
（6）立即添加300μL的LB至电穿孔容器中。
（7）37℃下培养细胞40分钟至1小时以复原。
（8）转移细胞至含有卡那霉素（50µg/mL）选择培养基上培养，长出含有同源重组质粒（连入同源重组片段的pMW1质粒）的转化子。
D、同源重组质粒的提取
C步骤得到的转化子37℃振荡培养12h。取1.5mL菌液于EP管中，以4000rpm离心3min，弃上清液。加0.1mL溶液I（1%葡萄糖，50 mM EDTA pH 8.0，25mM Tris-HCl pH 8.0）充分混合。加入0.2mL溶液II（0.2mM NaOH，1% SDS），轻轻翻转混匀，置于冰浴5min。加入0.15mL预冷溶液III（5mol/L KAc，pH4.8），轻轻翻转混匀，冰浴5min。以10000rpm离心20min，取上清液于另一新EP管中。加入等体积的异戊醇，混匀后静置10min。再以10000rpm离心20min，弃上清。用70%乙醇0.5mL洗涤一次，抽干所有液体。待沉淀干燥后，溶于0.05mLTE缓冲液中。
E、同源重组质粒转化农杆菌
农杆菌感受态的制备：液体保存的农杆菌EHA105涂布于LB培养基上，28℃培养，等到单菌落长出后，挑取单菌落，接种于5mL的液体培养基中，28℃、150r/m培养24h，按照1:10的接种比例接种于5mL新鲜的液体培养基中，28℃、150r/m培养24h。培养的菌体冰浴40min，5000r/m离心5min，用10mL的0.02mol/L CaCl2菌体重悬菌体。再次5000r/m离心5min，菌体悬浮于1mL的0.02mol/L CaCl2溶液，放置于冰上保藏。
取提取的同源重组质粒1μL与40μL的农杆菌感受态悬液混合，轻轻摇动混合5min后，在液氮上迅速冰冻5min，37℃水浴5min。加入 1mL液体LB培养基，28℃轻轻震荡4h。菌体5000r/m离心5min，弃去上清液，加入LB培养基50μL，震荡重新悬浮液体。液体涂布于含有卡那霉素（50µg/mL）的LB平板上，长出的菌落接种于含有50µg/mL卡那霉素的LB液体培养基中28℃、150r/m培养24h。
F、农杆菌介导转化黑曲霉
黑曲霉接种于PDA培养基斜面上，37℃培养72h，用灭菌的蒸馏水冲洗下孢子，孢子用蒸馏水稀释到108个孢子/mL。孢子与等体积的含有上述同源重组质粒的农杆菌混合均匀，加入乙酰丁香酮至200μmol/L，30℃避光培养24h。然后把孢子涂布在平板上（200g土豆用自来1L水煮沸30min，纱布过滤，加入20g葡萄糖、20g可溶性淀粉、20g琼脂），30℃培养到长出菌落。
长出的菌落分别接种到斜面上（200g土豆用自来1L水煮沸30min，纱布过滤，加入20g葡萄糖、20g琼脂），30℃培养72h，用接种环刮取孢子，接种到麸皮培养基中（麸皮:自来水=1:3（W/W）），每个250mL三角瓶装入30g麸皮培养基，30℃培养3d，然后升温到40℃热激10min，再降温到30℃培养1d，总培养时间是4d。取发酵结束时的培养基5.0g，逐一测定每个菌株的纤维素酶的酶活，筛选得到一个纤维素酶酶活达到6.90U/g的菌株，是出发菌株5.6U/g的1.25倍。对筛选的菌株进一步测序证实里氏木霉的外切酶基因已整合到黑曲霉热激蛋白基因的位置，表明本发明温度控制启动表达纤维素外切酶的黑曲霉基因工程菌构建成功。
构建的菌株接种到斜面上（200g土豆用自来1L水煮沸30min，纱布过滤，加入20g葡萄糖、20g琼脂），30℃培养72h，用接种环刮取孢子，接种到麸皮培养基中（麸皮:自来水=1:3（W/W）），250mL三角瓶装入30g麸皮培养基，30℃培养4d。测得构建的菌株在没有热激条件下纤维素酶的酶活为6.10U/g。
纤维素酶酶活的测定方法：取发酵结束时的培养基5.0g，加入0.05M柠檬酸缓冲液50mL，200r/m浸提30min，滤纸过滤得到酶液在50℃进行酶降解反应。在25mL试管中加入10mL pH 5.0的0.05M柠檬酸缓冲液，滤纸条（0.5cm×2cm）两片作为底物，加入发酵液离心后上清液2mL，在水浴锅中50℃保温30min，然后用沸水煮沸5min，用DNS法测定还原糖的含量。酶活定义为：每分钟释放出1μmol还原糖所需要的酶量为一个酶活单位U。
SEQUENCE LISTING
<110> 湖北工业大学
<120> 一种温度控制启动表达纤维素外切酶的黑曲霉基因工程菌的构建
<130> 1
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 2623
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 同源重组片段
<400> 1
ccgtcgactt gtctgccgag actttcgagt tccaggctga gatctctcag ctcctctccc 60
tcatcatcaa cactgtctac tccaacaagg agattttcct gcgtgagctg atctccaacg 120
cctccgatgc tctggacaag attcgctatg agtccctgtc cgacccctcc aagctcgact 180
cgggcaagga tctccgcatc gacctgatcc ccaacgccga ggccaagacc ctcaccatcc 240
gtgataccgg tatcggtatg accaaggctg taagtttttc tttcctatca ctccccgctc 300
tttcttctgc cattgagcgg taccctctta cgattagagt gaattctgac tttgtgggct 360
ttttttagga cctcatcaac aacctcggta ccattgctcg ctctggtact aagcagttca 420
tggaggctct ctccgctggt gctgatatct ccttgaatga ttgtcggcat tctcaccacg 480
ctggctacgc tggccacact cgcagctagt gtgcctctag aggagcggca agcttgctca 540
agcgtctggg gccaatgtgg tggccagaat tggtcgggtc cgacttgctg tgcttccgga 600
agcacatgcg tctactccaa cgactattac tcccagtgtc ttcccggcgc tgcaagctca 660
agctcgtcca cgcgcgccgc gtcgacgact tctcgagtat cccccacaac atcccggtcg 720
agctccgcga cgcctccacc tggttctact actaccagag tacctccagt cggatcggga 780
accgctacgt attcaggcaa cccttttgtt ggggtcactc cttgggccaa tgcatattac 840
gcctctgaag ttagcagcct cgctattcct agcttgactg gagccatggc cactgctgcg 900
gcagctgtcg caaaggttcc ctcttttatg tggctagata ctcttgacaa gacccctctc 960
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cagtttgtgg tgtatgactt gccggatcgc gattgcgctg cccttgcctc gaatggcgaa 1080
tactctattg ccgatggtgg cgtcgccaaa tataagaact atatcgacac cattcgtcaa 1140
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tgcatcaact acgccgtcac acagctgaac cttccaaatg ttgcgatgta tttggacgct 1320
ggccatgcag gatggcttgg ctggccggca aaccaagacc cggccgctca gctatttgca 1380
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tcaaggccgt tgccaagtct cccttcctgg acagcctcaa gcagaagaac ttcgaggttc 1980
tgttcctggt tgaccccatt gacgagtacg ccttcactca gctgaaggag ttcgacggca 2040
agaagctggt cgacatcacc aaggacttcg agcttgagga gtccgaggag gagaaggctg 2100
agcgcgagaa ggaggagaag gagttcgagg gtctcgccaa gagcctcaag aacatcctcg 2160
gcgacaaggt cgagaaggtc gttgtctccc acaagctcgt tggctctcct tgcgccatcc 2220
gtaccggcca gttcggttgg tccgctaaca tggagcgtat catgaaggcc caggccctcc 2280
gtgacacctc catgagctct tacatgtcct ccaagaagac tttcgagatc tctcccaagt 2340
cctctatcat caaggagctc cgcaagaagg ttgaggccga tggcgagggt gaccgcactg 2400
tcaagtccat cactcagctg ctcttcgaga cctctctcct ggtctccggt ttcaccattg 2460
aggagcccgc cagcttcgct gagcgcatcc acaagctcgt ctcccttggt ctgaacatcg 2520
acgaggaggc tgagaccacc gaggagaagg ctgctgagga ggctgcccct gccgccgccg 2580
ctgccgagag ctccatggag gaggttgact aaccgtcgac ttt 2623
<210> 2
<211> 456
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 黑曲霉热激蛋白基因的前段同源片段
<400> 2
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tcatcatcaa cactgtctac tccaacaagg agattttcct gcgtgagctg atctccaacg 120
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<210> 3
<211> 1416
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 里氏木霉纤维素外切酶基因片段
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gctgcccttg cctcgaatgg cgaatactct attgccgatg gtggcgtcgc caaatataag 660
aactatatcg acaccattcg tcaaattgtc gtggaatatt ccgatatccg gaccctcctg 720
gttattgagc ctgactctct tgccaacctg gtgaccaacc tcggtactcc aaagtgtgcc 780
aatgctcagt cagcctacct tgagtgcatc aactacgccg tcacacagct gaaccttcca 840
aatgttgcga tgtatttgga cgctggccat gcaggatggc ttggctggcc ggcaaaccaa 900
gacccggccg ctcagctatt tgcaaatgtt tacaagaatg catcgtctcc gagagctctt 960
cgcggattgg caaccaatgt cgccaactac aacgggtgga acattaccag ccccccatcg 1020
tacacgcaag gcaacgctgt ctacaacgag aagctgtaca tccacgctat tggacgtctt 1080
cttgccaatc acggctggtc caacgccttc ttcatcactg atcaaggtcg atcgggaaag 1140
cagcctaccg gacagcaaca gtggggagac tggtgcaatg tgatcggcac cggatttggt 1200
attcgcccat ccgcaaacac tggggactcg ttgctggatt cgtttgtctg ggtcaagcca 1260
ggcggcgagt gtgacggcac cagcgacagc agtgcgccac gatttgactc ccactgtgcg 1320
ctcccagatg ccttgcaacc ggcggctcaa gctggtgctt ggttccaagc ctactttgtg 1380
cagcttctca caaacgcaaa cccatcgttc ctgtaa 1416
<210> 4
<211> 751
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 黑曲霉热激蛋白基因的后段同源片段
<400> 4
gtatgcccga gcaccagaag cagatctact acatcaccgg cgagtccatc aaggccgttg 60
ccaagtctcc cttcctggac agcctcaagc agaagaactt cgaggttctg ttcctggttg 120
accccattga cgagtacgcc ttcactcagc tgaaggagtt cgacggcaag aagctggtcg 180
acatcaccaa ggacttcgag cttgaggagt ccgaggagga gaaggctgag cgcgagaagg 240
aggagaagga gttcgagggt ctcgccaaga gcctcaagaa catcctcggc gacaaggtcg 300
agaaggtcgt tgtctcccac aagctcgttg gctctccttg cgccatccgt accggccagt 360
tcggttggtc cgctaacatg gagcgtatca tgaaggccca ggccctccgt gacacctcca 420
tgagctctta catgtcctcc aagaagactt tcgagatctc tcccaagtcc tctatcatca 480
aggagctccg caagaaggtt gaggccgatg gcgagggtga ccgcactgtc aagtccatca 540
ctcagctgct cttcgagacc tctctcctgg tctccggttt caccattgag gagcccgcca 600
gcttcgctga gcgcatccac aagctcgtct cccttggtct gaacatcgac gaggaggctg 660
agaccaccga ggagaaggct gctgaggagg ctgcccctgc cgccgccgct gccgagagct 720
ccatggagga ggttgactaa ccgtcgactt t 751

Claims (2)

1.一种温度控制启动表达纤维素外切酶的黑曲霉基因工程菌，其特征在于：通过包括如下步骤的构建方法得到：
(1)合成核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的同源重组片段，用SalI酶切；将pWM1质粒也用SalI酶切；将酶切后的重组片段和质粒通过DNA连接酶连接，并转化DH5α得到同源重组质粒；
(2)用同源重组质粒转化农杆菌；
(3)通过农杆菌介导转化黑曲霉ATCC10582得到目的菌株。
2.权利要求1所述的温度控制启动表达纤维素外切酶的黑曲霉基因工程菌的构建方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)合成核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的同源重组片段，用SalI酶切；将pWM1质粒也用SalI酶切；将酶切后的重组片段和质粒通过DNA连接酶连接，并转化DH5α得到同源重组质粒；
(2)用同源重组质粒转化农杆菌；
(3)通过农杆菌介导转化黑曲霉ATCC10582得到目的菌株。
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