CN103589719A - 一种具有生产和回收纤维素外切酶双重功能的酵母菌株的构建 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具有生产和回收纤维素外切酶双重功能的酵母菌株的构建，属于酶工程领域。通过把酿酒酵母TDH3启动子序列、酿酒酵母分泌信号肽编码序列、黑曲霉纤维素外切酶编码序列、酿酒酵母凝聚因子C端的400个氨基酸片段编码序列、酿酒酵母TDH3终止子序列按顺序合成，在两端加上限制性内切酶位点，通过酶切构建到pPIC9K质粒中，再将该质粒转化到酵母中得到具有生产和回收纤维素外切酶双重功能的酵母菌株。其生产纤维素外切酶的回收率达到86%，发酵后外切酶的酶活达到1.5U/g湿酵母。本发明实现了纤维素外切酶生产和同步浓缩回收的一步完成，降低了能源消耗，降低了成本，具有较强的实用性。

Description

一种具有生产和回收纤维素外切酶双重功能的酵母菌株的构建

 

技术领域

本发明属于酶工程领域，具体涉及一种具有生产和回收纤维素外切酶双重功能的酵母菌株的构建。

背景技术

纤维素是地球上最丰富的可再生资源，地球上每年因光合作用产生的纤维素达到100亿吨左右，利用纤维素生产生物能源，是缓解能源危机，实现人类可持续发展的关键。

纤维素利用的关键是把纤维素降解为可发酵性的糖类-葡萄糖。纤维素的降解需要外切酶、内切酶、葡聚糖苷酶的共同作用。其中外切酶降解晶体结构的纤维素，是纤维素降解的限速步骤。用纤维素酶降解纤维素具有绿色、条件温和、转化率高的特点，但是纤维素较高的生产成本成为纤维素酶降解纤维素的瓶颈。

液体发酵具有发酵体积大，易实现自动化控制等特点，被广泛用来生产纤维素外切酶等。但是液体发酵生产的酶类产品浓度低的特征。生产的纤维素外切酶等都游离在发酵醪液中，为得到高浓度的纤维素外切酶或外切酶的固体粉末，需要对发酵醪液进行浓缩。为纯化浓缩纤维素外切酶往往需要通过真空蒸发或喷雾干燥等工艺来浓缩。在纤维素蒸发浓缩或喷雾干燥的过程中，纤维素外切酶的活性丧失一部分，而且浓缩工艺大幅度提高了纤维素酶的生产成本。在蒸发或喷雾干燥的过程中，消耗大量的能源如电或燃气等。因此浓缩成本，成为降低液体发酵生产纤维素外切酶生产成本的必然选择。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种具有生产和回收纤维素外切酶双重功能的酵母菌株。

本发明的另一目的在于提供用于构建上述酵母菌株的DNA片段。

本发明的再一目的在于提供用于构建上述酵母菌株的质粒。

本发明的目的还在于提供上述酵母菌株的构建方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

用于构建具有生产和回收纤维素外切酶双重功能的酵母菌株的DNA片段，包括按顺序排列的酿酒酵母TDH3启动子序列、酿酒酵母分泌信号肽编码序列、黑曲霉纤维素外切酶编码序列、酿酒酵母凝聚因子C端的400个氨基酸片段编码序列、酿酒酵母TDH3终止子序列；上述序列分别如SEQ ID NO.1～5所示。

优选的，所述的用于构建具有生产和回收纤维素外切酶双重功能的酵母菌株的DNA片段的序列如SEQ ID NO.6所示。

用于构建具有生产和回收纤维素外切酶双重功能的酵母菌株的质粒为包含上述DNA片段的真核表达质粒。所述的真核表达质粒优选为pPIC9K质粒。

所述的用于构建具有生产和回收纤维素外切酶双重功能的酵母菌株的质粒通过包含如下步骤的方法制备得到：合成两端有限制性内切酶识别位点含有上述DNA片段的序列，通过限制性内切酶连接到真核表达质粒上。所述的真核表达质粒pPIC9K质粒时，限制性内切酶优选为BglⅡ和FspAⅠ。

一种具有生产和回收纤维素外切酶双重功能的酵母菌株，含有上述质粒。所述的酵母菌株优选为酵母菌株 SMD1168。

所述的具有生产和回收纤维素外切酶双重功能的酵母菌株的构建方法，包括如下步骤：制备酵母电转化感受态细胞，将上述质粒通过电转化转进酵母中得到。

本发明相对于现有技术具有如下优点和效果：

本发明的酵母菌株能在生产纤维素外切酶的同时，把纤维素外切酶吸收在菌株自身表面，通过简单过滤，就能达到浓缩纤维素外切酶的目的。

   本发明大大简化了纤维素外切酶的浓缩工艺，降低了能源消耗，大幅度降低了成本，因此该发明具有较强的实用性。

本发明把黑曲霉（Aspergillus niger）纤维外切酶基因在酵母内表达，并实现了烟曲霉外切酶生产和同步浓缩回收的一步完成，现有技术未有相关报道，具有较高的创新型。

本发明酵母菌株生产纤维素外切酶的回收率达到88%，发酵后外切酶的酶活达到1.5 U/g湿酵母。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

     实施例1

（1）pPIC9K质粒的提取

1）接1%含pPIC9K质粒的大肠杆菌细胞于2 mL LB培养基。 

2）37 ℃振荡培养12 h。

3）取1.5 mL菌液于EP管，以4000 rpm离心3 min，弃上清液。 

4）加0.l mL溶液Ⅰ（1%葡萄糖，50 mM EDTA pH 8.0，25 mM Tris-HCl pH 8.0）充分混合。 

5）加入0.2 mL溶液Ⅱ（0.2 mM NaOH，1% SDS），轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min。 

6）加入0.15 mL预冷溶液Ⅲ（5 mol/L KAc，pH4.8），轻轻翻转混匀，冰浴5 min。

7）以10000 rpm离心20 min，取上清液于另一新EP管中。

8）加入等体积的异戊醇，混匀后静置10 min。 

9）再以10000 rpm离心20 min，弃上清。 

10）用70%乙醇0.5 mL洗涤一次，抽干所有液体。

11）待沉淀干燥后，溶于0.05 mL TE缓冲液中。

（2）大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备

1）将大肠杆菌DH5α 置于LB或其它营养丰富的培养基上，在37 ℃下过夜培养。

2）高温灭菌大的离心瓶（250～500 mL）以备第二天摇瓶用。

3）准备几瓶灭菌水（总量约1.5升），保存于冷冻室中以备第二天重悬浮细胞用。

4）转移0.2～1 mL过夜培养物至装有20 mL LB（或其他营养丰富的培养基）的100 mL摇瓶。

5）37 ℃下剧烈振荡培养6小时。

6）监控OD600值（培养1小时后每半小时测定一次）。

7）当OD600值达到0.5～1.0时，从摇床中取出摇瓶，置于冰上冷却15分钟。

8）细胞在4 ℃ 5000g下离心15分钟，弃上清液。

9）用灭菌的冰水重悬浮细胞，先用涡旋仪或吸液管重悬浮细胞于少量体积中（几毫升），然后加水稀释至离心管的2/3体积。

10）照上面步骤重复离心，小心弃去上清液。

11）照上面步骤用灭菌的冰水重悬浮细胞。

12）离心，弃上清液。

13）用20 mL灭菌的、冰冷后的10%甘油重悬浮细胞。

14）照上面步骤离心，小心弃去上清液（沉淀可能会很松散）。

15）用10%甘油重悬浮细胞至最终体积为2～3 mL。

16）将细胞按150 μL等份装入微量离心管，于-80 ℃保存。

（3）pPIC9K-CHB质粒构建

1）用限制性内切酶BglⅡ、FspAⅠ分别酶切质粒pPIC9K。限制性内切酶BglⅡ、FspAⅠ（TAkaRA）各1.5 μL，提取的pPIC9K质粒溶液 6 μL，10×K Buffer 1 μL加入到100 μL EP管中，在30 ℃水浴锅中酶切60 min。再通过琼脂糖凝胶电泳回收酶切的质粒pPIC9K。

2）序列合成 

合成两端具有BglⅡ和FspAⅠ识别序列的序列GGAGATCTTCTAGACC–酿酒酵母TDH3启动子序列–酿酒酵母分泌信号肽编码序列–黑曲霉纤维素外切酶编码序列–酿酒酵母凝聚因子C端的400个氨基酸片段编码序列–酿酒酵母TDH3终止子序列–GGTGCGCACCC，各片段及全长片段如SEQ ID NO.1～6所示。

3）连接

合成的碱基序列20 μL，酶切的pPIC9K质粒5 μL，10×buffer 5 μL，ddH₂O 10μL，T4 DNA连接酶（Takara）5 μL加入100 μL EP管中，16 ℃连接过夜。

4）将上述连接产物电转化到大肠杆菌DH5α，电转化具体方法如下：

4.1）在冰上解冻大肠杆菌DH5α感受态细胞添加1～10 μL连接产物，冰上放置约5分钟。

4.2）转移连接产物/细胞混合物至冷却后的2mm电穿孔容器中。

4.3）加载电转仪P1000，准备好300 μL LB或2×YT。

4.4）对电穿孔容器进行脉冲（200欧姆，25 μF，2.5千伏），检查时间常数，应该在3以上。

4.5）立即添加300 μL的LB或2×YT至电转杯中 。

4.6）37 ℃下培养细胞40分钟至1小时以复苏。

4.7）复苏后离心弃掉150 μL上清，剩余150 μL重悬菌体涂布到含有氨苄（100 μg/mL）的LB或2×YT培养基的固体平板上，于37 ℃培养过夜。

5）挑去固体平板上生长的单克隆，通过培养，提取质粒，用BglⅡ和FspAⅠ对质粒进行酶切鉴定，鉴定正确的质粒再进一步测序，得到质粒pPIC9K-CBH。

（4）酵母感受态细胞的制备

1）挑一环酵母菌（SMD1168）接种于5 mL YEPD培养基中，30 ℃ 250～300 rpm培养过夜得到一级种子。

2）取1 mL一级种子分别接种于两瓶50 mL YEPD培养基中，30 ℃ 250～300 rpm培养约16～18 h（OD600约1.3～1.5）。

3）于4 ℃离心收集菌体，用25 mL冰预冷无菌水洗涤一次后，细胞用10 mL冰预冷无菌水重悬，可换成较小的离心管。

4）加入1 mL pH 7.5的10×TE缓冲液，摇晃均匀，再加入1 mL 10×LiAc，旋转摇匀，于30 ℃轻轻摇动45 min。

5）再加入0.4 mL 1 mol/L DTT，并同时旋转摇动，于30 ℃轻轻摇动15 min。

6）于4 ℃离心，弃上清（用枪吸），再用25 mL冰预冷无菌水洗涤。

7）2.5 mL冰预冷的1 mol/L山梨醇洗涤，离心收集菌体，弃上清（用枪吸）。

8）每管用100 μL 1 mol/L山梨醇溶解，分装于3个EP管中（80 μL/管），于-70℃冰箱保存。 

    （5）pPIC9K-CBH质粒电转化酵母

1）向酵母感受态细胞中加入约5～10 μg（体积小于10 μL）pPIC9K-CBH质粒，用枪吹吸均匀，转移至预冷的电转杯中，静置5min。

2）擦干电转杯，电击，电击参数：1.5 KV，25 μF，200欧姆。 

3）立即加入1 mL冰预冷的1 mol/L山梨醇，转移至离心管中，于30 ℃静置1h。

4）离心，弃上清，加入1 mL YEPD后，于30 ℃、200 rpm培养2 h。

5）离心得菌体后，吸除550 μL上清液，然后取150 μL涂100 μg/mL氨苄YEPD板于30 ℃培养至长出转化子。

（6）酵母转化子发酵

挑取的转化子在YEPD培养基中30 ℃培养24 h，以10%接种量（v/v）接种于发酵培养基（酵母浸膏10 g/L，蛋白胨20 g/L，50 mM柠檬酸缓冲液，麸皮200 g/L，羟甲基纤维素20 g/L，1 L水）中。发酵在500 mL摇瓶中发酵，装液量为20%（v/v）。在发酵培养基中培48 h。

（7）纤维素外切酶的回收

   发酵液在离心机中4000 r/m 离心10 min，收集上清（上清中有游离的外切酶，用于外切酶回收率的计算），按酵母沉淀湿重与蒸馏水质量比1:10 的比例加入蒸馏水，用蒸馏水洗涤两次，收集酵母沉淀，纤维素外切酶固定在酵母表面。 

外切酶酶活测定：以微晶纤维素为底物，在50 ℃进行酶降解反应。在25 mL试管中加入10 mL含有20 g/L pH 5.0的微晶纤维素柠檬酸缓冲液（微晶纤维素溶于pH 5.0的0.05 M柠檬酸缓冲液），再加入离心后上清液 20 mL或酵母沉淀0.1 g，在水浴锅中50 ℃保温30 min，然后用沸水煮沸5 min。用DNS法测定还原糖的含量。

酶活定义为：每分钟释放出1 μmol还原糖所需要的酶量。

外切酶回收率（%）=酵母沉淀的酶活/(上清液的酶活+酵母沉淀的酶活)×100%。

经过测定外切酶的回收率达到88%，发酵后外切酶的酶活达到1.5 U/g湿酵母。外切酶较高的回收率，说明在发酵的时候，构建的酵母能很好的富集浓缩纤维素外切酶，实现了发酵和浓缩的一步完成。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

 

<110>  湖北工业大学

 

<120>  一种具有生产和回收纤维素外切酶双重功能的酵母菌株的构建

 

<130>  1

 

<160>  8    

 

<170>  PatentIn version 3.5

 

<210>  1

<211>  711

<212>  DNA

<213>  Saccharomyces cerevisiae

 

<400>  1

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<210>  2

<211>  253

<212>  DNA

<213>  Saccharomyces cerevisiae

 

<400>  2

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<210>  3

<211>  1548

<212>  DNA

<213>  Aspergillus niger

 

<400>  3

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<210>  4

<211>  1203

<212>  DNA

<213>  Saccharomyces cerevisiae

 

<400>  4

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taa                                                                   1203

 

 

<210>  5

<211>  281

<212>  DNA

<213>  Saccharomyces cerevisiae

 

<400>  5

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gtaagcgtga cataactaat tacatgatgc ggccctttaa a                          281

 

 

<210>  6

<211>  3996

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 

<220>

<223>  用于构建具有生产和回收纤维素外切酶双重功能的酵母菌株的DNA片段

 

<400>  6

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aaataattaa tagtagtgat tttcctaact ttatttagtc aaaaaattag ccttttaatt      120

 

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ctccagtcaa cactacaaca gaagatgaaa cggcacaaat tccggctgaa gctgtcatcg      840

 

gttactcaga tttagaaggg gatttcgatg ttgctgtttt gccattttcc aacagcacaa      900

 

ataacgggtt attgtttata aatactacta ttgccagcat tgctgctaaa gaagaagggg      960

 

tatccagcag gttggcacct acaccactga gacgcatccg tctttgacct ggcaaacctg     1020

 

caccagcagt ggcagctgca ctactaatga cggcgcggtg gtcattgatg ccaattggcg     1080

 

ctgggtgcac tcgacctcca gctccaccaa ctgctacact ggcaacgagt gggacacctc     1140

 

gatctgtacc gacgatgtga cctgcgccgc gaactgcgcg ctcgatggtg ccacttacga     1200

 

ggcgacctac ggtgtgacta cctccggcga cgagctgcgc ctgaacttcg tcacccaggg     1260

 

ctccagcaag aacatcggat cccggttgta cctcatgagt gatgacagta cctatgagat     1320

 

gttcaagctc ctcggccagg agttcacatt tgacgtggac gtgtccaacc tcccctgcgg     1380

 

tctcaacggc gcgctgtact tcgtcgccat ggacgctgac ggcggcacct cggagtactc     1440

 

tggcaacaag gccggcgcca aatacggtac cggatactgc gactcgcagt gcccccgcga     1500

 

cctgaagttc atcaatggcg aagccaactg cgacggctgg gagccatcta gcaacaacgt     1560

 

caacaccggt gttggcgacc acggctcctg ctgccctgag atggacatct gggaagcgaa     1620

 

cagcatctcc aacgccttca ccgcacaccc atgcgactcc gtcagccaga ccatgtgcga     1680

 

cggcgactcc tgcggtggaa cttacagcgc cagcggcgac cgctacagcg gcacttgcga     1740

 

ccccgacggc tgcgactaca acccctaccg tctgggcaac acggactttt acggtcccgg     1800

 

cctgaccgtc gacacgaaca gccccttcac cgtcgtcacc cagttcatca ccgacgacgg     1860

 

cacctcctcc ggtaccctga ccgagatcaa gcggttgtac gtgcaaaacg gcgaggtcat     1920

 

cgccaacggc gcctccacct actccagcgt caacggcagc tcgatcactt ccgatttctg     1980

 

tgaatcagaa aagactctgt ttggcgatga gaacgtgttt gacacgcacg gcggtctcgc     2040

 

aggcatgggc gaggctatgg cgaatggaat ggtcttggtc ctgagtctgt gggatgacta     2100

 

cgccgccaac atgctctggc ttgacagcga ctaccccgtc aactcgtcgg cctcaacacc     2160

 

gggtgtggct cgcggtactt gtagcactga ctcgggtgtc ccggctactg tggaggcgga     2220

 

ttcacccaat gcgtatgtca cgtactcgaa catcaagttc gggcccattg gctcgactta     2280

 

ctccagtggg tcttcttcgg ggtcggggtc tagctccagc tccagctcta ctaccacgaa     2340

 

ggccacttcg acgaccttga agactaccac gacgaccagc agcggtagca gttctacttc     2400

 

ggcggcgcag gcatatggac agtgtggtgg acagagctgg acgggtccga ccacttgtgt     2460

 

gagtggatac acttgcacgt atcagaatgc gtactactcg cagtgtttgt agatgaaatt     2520

 

tagttctact acattattag ctgtgttagc atcactttcg gccactgtca atgccggatg     2580

 

ttcatttgaa ggtggaaact actactgttc agaaaccaaa aaagtcgtct acaagggtat     2640

 

cggattctct ggttcttatc aagacgttac caatatggat gaaaacactg gtaaatgtac     2700

 

tcaaaaatca tattccttta gtggtaactt gtctccatta gacgaagaat tatctgttca     2760

 

tttcagagga cctttgaaat tattagaatt tggtgtttac tacccaagca gtaatggtaa     2820

 

ttcaaagaga caagttgacg aacaagattg taatacaaaa cacgttcatc ataaacacaa     2880

 

gagagcaact gaagttgttc aagtcacaca aacagttttc gttgatggta atggtaacac     2940

 

tgttacttct caagccctcc aaacctctac tattgaaaca aattcagctg cttcatcacc     3000

 

tgctgctaat aatgatgcca actcaggttc tggttctggt tccggttccg gttatggatc     3060

 

tgtttctgcc cttgacggtg aaggcaaagc ttatagaacc gatatctcaa ccaaatctgc     3120

 

tccaacctca acatctgctc aaccatcttc atcagaaact gcctctgctg atggtgcttg     3180

 

gaccagagac agtcattaca ctccaggatc cactgataac tgtgtgttct tgaactatca     3240

 

tggtggttct ggttctggtg tttggtctgc taattttggt aactcattat cttatgccaa     3300

 

ctccgataat tctggtgggt cttcaactcc tgttgccttg ggagaaacca ctatcaaatc     3360

 

tggcgaagaa ttcatcatct tctctggttc taaatgtggt agtagttccg attgtggtta     3420

 

ttatagagat ggtactgttg cttatcacgg tttcaaagga actagcaaga tttttgtttt     3480

 

tgaatttgaa atgccaagtg atactaatgg taacggttat aaccaagaca tgccagccgt     3540

 

ttggttattg aatgctaaga tcccaagaac tttacaatac ggtgaagcca cttgttcttg     3600

 

ttggaagacc ggttgtggtg aattagattt gtttgaagtc ttaagcagtg gttccagtaa     3660

 

aatgatttct cacttgcacg atggtcaagg ttcttctcaa aacagtaaca attaaggggg     3720

 

taccgggccc ggccgcaaat taaagccttc gagcgtccca aaaccttctc aagcaaggtt     3780

 

ttcagtataa tgttacatgc gtacacgcgt ctgtacagaa aaaaaagaaa aatttgaaat     3840

 

ataaataacg ttcttaatac taacataact ataaaaaaat aaatagggac ctagacttca     3900

 

ggttgtctaa ctccttcctt ttcggttaga gcggatgtgg ggggagggcg tgaatgtaag     3960

 

cgtgacataa ctaattacat gatgcggccc tttaaa                               3996

 

 

<210>  7

<211>  16

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 

<220>

<223>  BglⅡ识别序列

 

<400>  7

ggagatcttc tagacc                                                       16

 

 

<210>  8

<211>  11

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 

<220>

<223>  FspAⅠ识别序列

 

<400>  8

ggtgcgcacc c                                                            11

 

Claims (10)

1.   用于构建具有生产和回收纤维素外切酶双重功能的酵母菌株的DNA片段，其特征在于：包括按顺序排列的酿酒酵母TDH3启动子序列、酿酒酵母分泌信号肽编码序列、黑曲霉纤维素外切酶编码序列、酿酒酵母凝聚因子C端的400个氨基酸片段编码序列、酿酒酵母TDH3终止子序列。

2.根据权利要求1所述的DNA片段，其特征在于：所述的序列分别如SEQ ID NO.1～5所示。

3.根据权利要求1所述的DNA片段，其特征在于：所述的DNA片段的序列如SEQ ID NO.6所示。

4.用于构建具有生产和回收纤维素外切酶双重功能的酵母菌株的质粒，其特征在于：为包含权利要求1-3任一项所述的DNA片段的真核表达质粒。

5.根据权利要求4所述的质粒，其特征在于：所述的真核表达质粒为pPIC9K质粒。

6.根据权利要求4所述的质粒，其特征在于：通过包含如下步骤的方法制备得到：合成两端有限制性内切酶识别位点含有权利要求1-3任一项所述的DNA片段的序列，通过限制性内切酶连接到真核表达质粒上。

7.根据权利要求6所述的质粒，其特征在于：所述的真核表达质粒为pPIC9K质粒时，限制性内切酶为BglⅡ和FspAⅠ。

8.一种具有生产和回收纤维素外切酶双重功能的酵母菌株，其特征在于：包含权利要求4-7任一项所述的质粒。

9.根据权利要求8所述的酵母菌株，其特征在于：所述的酵母菌株为酵母菌株 SMD1168。

10.权利要求8或9所述的酵母菌株的构建方法，其特征在于包括如下步骤：制备酵母电转化感受态细胞，将权利要求4-7任一项所述的质粒通过电转化转进酵母中得到。