CN109337932B - 一种提高红曲色素产量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种提高红曲色素产量的方法。该技术方案首先从植物双元质粒pCambia0380载体出发，改造并构建了一种适合丝状真菌基因敲除的双元质粒载体pHph0380。在此基础上，从红色红曲霉CICC41233中克隆得到糖转运蛋白gltp1基因上下游同源臂片段，与质粒载体pHph0380连接后，通过根癌农杆菌EHA105介导将其转化至亲本红色红曲霉中，构建得到了重组菌株。红曲色素发酵结果表明，本方法所构建的重组菌株，其红曲色素积累时间显著提前，且醇溶性色素产量得到明显提高，在发酵144h时，醇溶性色素产量较亲本菌株提高74％。本发明利用基因工程手段使红曲霉发酵产红曲色素的时间提前，提高了淀粉的利用率，提高了红曲色素的产量。

Description

一种提高红曲色素产量的方法
技术领域
本发明涉及工业微生物技术领域，进一步涉及基因工程技术以及霉菌的发酵技术，具体涉及一种提高红曲色素产量的方法。
背景技术
红曲色素是由微生物红曲霉菌(Monasus spp.)，以大米为原料发酵而成的天然色素，在我国有一千多年的历史。作为食品添加剂，红曲色素广泛应用于食品加工和化妆品制造等领域；因其还具有广泛的生物活性如调血脂、降血压、防血管硬化、抗糖尿病、抑制肥胖、抗炎症、抗过敏、防过氧化、抗癌、抗细菌、抗真菌等，它在益生保健产品开发和医疗领域的应用也越来越受到重视。
红曲色素是红曲霉的次级代谢产物，由脂肪酸合成途径和聚酮合成途径共同完成合成代谢。其化学结构主要分为聚酮和脂肪酸链两部分。脂肪酸链的合成以乙酰CoA为前体，经脂肪酸合酶(Fatty acid synthase，FAS)复合体作用，经过一系列合成反应形成中长链脂肪酸，其与乙酰CoA反应生成β-酮酸；聚酮的合成同样以乙酰CoA为前体，在聚酮合酶(Polyketide synthase,PKS)作用下，依次合成多聚酮体化合物，最终形成带有生色基团的聚酮。聚酮的羧基基团与脂肪酸链的羟基基团发生酯化反应，从而形成红曲色素。基于以上原理，为了提高红曲色素的产量，现有技术普遍通过发酵工艺改良来实现红曲霉的代谢调控，进而定向累积目的产物；尽管发酵条件的优化能在一定程度上改善红曲色素产量，但受限于红曲霉自身的代谢特性，红曲色素累积很难再进一步提高。
此外，红曲霉所产红曲色素分为醇溶性色素和水溶性色素。醇溶性色素为红曲霉在发酵过程中直接合成，存在于胞内；水溶性色素是红曲霉自身合成的色素与发酵液中氨基酸等物质结合形成的复合色素，分布于胞外。在天然菌株的生长过程中，这两种红曲色素均有产生，单纯凭借培养方法无法实现定向生产其中一种红曲色素。
另外，在红曲霉素的工业化生产中，发酵进程是影响整体工艺时长的关键因素，由于红曲霉素是红曲霉的次级代谢产物，因此当发酵开始一段时间后才累积红曲霉素。在这种情况下，如果能通过基因重组或代谢调控手段将该启动时间提前，则有望缩短工艺时长，提高生产效率。
发明内容
本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种提高红曲色素产量的方法，以解决现有技术中常规培养红色红曲霉产红曲色素时产量较低的技术问题。
本发明要解决的另一技术问题是现有技术中常规培养红色红曲霉产红曲色素时难以定向累积醇溶性红曲色素。
本发明要解决的再一技术问题是现有技术中常规培养红色红曲霉产红曲色素时，红曲霉素积累的启动时间较晚。
为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：
一种提高红曲色素产量的方法，包括以下步骤：
1)取植物双元质粒pCambia0380，用限制性内切核酸酶Hind III与Bgl II酶切，而后将一对依次含有Hind III、Kpn I、Sac I、Pac I、Pme I、Xho I、Xba I、Bgl II酶切位点的寡核苷酸序列通过T4 DNA连接酶与之连接，即得到双元质粒表达载体pCambia0380G；
2)以质粒pMD19-PgpdA-hph-TtrpC为模板，采用一对引物扩增得到hph表达盒片段，用限制性内切核酸酶Sac I与Xho I同时酶切所述hph表达盒片段以及双元质粒表达载体pCambia0380G，而后通过T4DNA连接酶将二者连接，即得到双元质粒敲除载体pHph0380；
3)以红色红曲霉CICC41233总DNA为模板，采用一对引物扩增出糖转运蛋白gltp1基因的上游同源臂片段；以红色红曲霉CICC41233总DNA为模板，采用另一对引物扩增出糖转运蛋白gltp1基因的下游同源臂片段；将所述上游同源臂片段和所述下游同源臂片段分别连接至所述载体pHph0380上，即得到双元质粒敲除载体pHph0380-GLTP；
4)将所述双元质粒敲除载体pHph0380-GLTP导入红色红曲霉菌株中，构建得到重组菌株；
5)利用所述重组菌株发酵产红曲霉素。
作为优选，步骤1)中所述的一对依次含有Hind III、Kpn I、Sac I、Pac I、Pme I、Xho I、Xba I、Bgl II酶切位点的寡核苷酸序列，分别如SEQ ID No:1、SEQ ID No:2所示。
作为优选，步骤2)中所述的一对引物分别为PgpdA-Sac I-F和TtrpC-Xho I-R，其序列分别如SEQ ID No:3、SEQ ID No:4所示。
作为优选，步骤3)中所述的一对引物分别为Gltp-QC-UF-Pst I和Gltp-QC-UR-SacI，其序列分别如SEQ ID No:9、SEQ ID No:10所示；所述糖转运蛋白gltp1基因的上游同源臂片段的长度为1740bp；步骤3)中所述的另一对引物分别为Gltp-QC-DF-Bgl II和Gltp-QC-DR-Spe I，其序列分别如SEQ ID No:11、SEQ ID No:12所示；所述糖转运蛋白gltp1基因的下游同源臂片段的长度为1764bp。
作为优选，步骤4)包括：制备感受态的根癌农杆菌EHA105，通过液氮冻融法将所述双元质粒敲除载体pHph0380-GLTP导入根癌农杆菌EHA105，而后将含有双元质粒敲除载体pHph0380-GLTP的根癌农杆菌EHA105转化至红色红曲霉CICC41233中，筛选阳性克隆，即得到所述重组菌株。
作为优选，所述制备感受态的根癌农杆菌EHA105，包括以下步骤：将根癌农杆菌EHA105接种于5～10mL含有50μg/mL利福平的YEP液体培养基中，以温度28℃、搅拌转速200rpm的条件培养24h；取l mL活化的菌液接种于20mL含有50μg/mL利福平的YEP液体培养基中，以温度28℃、搅拌转速200rpm的条件培养至菌液OD600值0.5；将菌液冰浴30min后，在4℃条件下以5000rpm的转速离心5min，弃上清；用0.15mmol/L的氯化钠溶液l0mL重悬沉淀，在4℃条件下以5000rpm的转速离心5min，弃上清，而后悬浮于20mmol/L的氯化钙溶液1mL中。
作为优选，所述通过液氮冻融法将所述双元质粒敲除载体pHph0380-GLTP导入根癌农杆菌EHA105，包括以下步骤：取1μg所述双元质粒敲除载体pHph0380-GLTP加入到200μL感受态的根癌农杆菌EHA105中，混合后冰浴30min；液氮中速冻1min，37℃水浴3min，再冰浴2min；加入800μL YEP液体培养基，28℃培养3h；常温下以5000rpm的转速离心3min，浓缩菌体；取200μL浓缩后的菌液涂布于含有50μg/mL利福平、50μg/mL卡那霉素的YEP选择性培养基平板上，28℃倒置培养2d；挑选转化子于YEP液体培养基中培养，并用引物对克隆子进行筛选，得到阳性克隆子，即为含有双元质粒敲除载体pHph0380-GLTP的根癌农杆菌EHA105。
作为优选，所述将含有双元质粒敲除载体pHph0380-GLTP的根癌农杆菌EHA105转化至红色红曲霉CICC41233中，包括以下步骤：
取红色红曲霉CICC41233，用MPS固体培养基培养7d，获取分生孢子，用无菌水悬浮孢子，振荡分散孢子，经2层擦镜纸过滤，调节孢子浓度；
取含有双元质粒敲除载体pHph0380-GLTP的根癌农杆菌EHA105，接种于3mL含有50μg/mL利福平、50μg/mL卡那霉素的YEP培养基中，28℃培养48h，而后转接于5mL含有200μmol/L乙酰丁香酮的AIM诱导培养基中，使菌液稀释至OD600值为0.15，再继续培养5～6h，至OD600值为0.5～0.6；
将以上所得的红色红曲霉孢子液和含有双元质粒敲除载体pHph0380-GLTP的根癌农杆菌EHA105菌液，混合涂布于含200μmol/L乙酰丁香酮的AIM诱导培养基平板上，25℃，避光培养48h。
作为优选，所述筛选阳性克隆，包括以下步骤：在避光培养48h后的AIM诱导培养基平板上再添加一层含100μg/mL hph、200μmol/L头孢噻肟、0.2％Triton X-100的MPS培养基，30℃继续培养5～8d；挑取单菌落转接至含100μg/mL hph的MPS固体培养基平板上，培养3d后将能够生长的菌株，接于MPS液体培养基中培养，按照SDS裂解法提取丝状真菌总DNA进行分子分析，用序列为SEQ ID No:15、SEQ ID No:16的一对引物进行PCR验证，选取阳性菌株即为所述重组菌株。
作为优选，步骤5)中：
发酵培养基成分包括：9％(w/w)大米粉，0.2％(w/w)NaNO3，0.1％(w/w)KH2PO4，0.2％(w/w)MgSO4·7H2O，0.2％(w/w)乙酸；
发酵初始时，向培养基中接入所述重组菌株的孢子105个/mL；
发酵条件为：温度30℃，搅拌转速180rpm，发酵6天。
作为优选，还包括以下步骤6)：以红色红曲霉CICC41233总DNA为模板，以序列分别如SEQ ID No:7、SEQ ID No:8所示的一对引物执行PCR扩增，利用Hind III和Sac I分别酶切该PCR扩增产物以及pNeo0380载体，利用T4DNA连接酶将二者连接，而后将连接产物转化至E.coli DH5α感受态细胞中，提取pNeo0380-GLTP质粒载体；将所述pNeo0380-GLTP质粒载体转化至所述重组菌株中，得到回补菌株，而后比较所述重组菌株与所述回补菌株发酵产红曲色素的能力。
在以上技术方案中，所述植物双元质粒pCambia0380、红色红曲霉CICC41233、根癌农杆菌EHA105、均属于常规商品化的生物材料，可自市面购得；其中，红色红曲霉CICC41233购自于中国工业微生物菌株保藏管理中心。
在以上技术方案中，所述质粒pMD19-PgpdA-hph-TtrpC可根据现有技术自行制备，其具体制备方法可以参照参考文献“de Groot MJA，Bundock P，Hooykaas PJJ，etal.1998.Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of filamentousfungi.Nature Biotechnology，16：839-842”实施。
在以上技术方案中，gltp1基因的核苷酸序列如SEQ ID No:17所示；GLTP1氨基酸序列的氨基酸序列如SEQ ID No:18。
在以上技术方案中，所述YEP培养基的配方如下：5.0g蛋白胨，1.0g酵母提取物，5.0g蔗糖，5.0g牛肉膏，0.24g硫酸镁，pH 7.2；若为固体培养基则另添加2％的琼脂粉。
所述MPS培养基配方如下：10g/L麦芽提取物，10g/L蛋白胨，40g/L可溶性淀粉；若为固体培养基则另添加2g/L琼脂。
所述述AIM诱导培养基配方如下：0.8mL磷酸钾缓冲液(1.25mol/L，pH 4.8，用磷酸二氢钾与磷酸氢二钾配制)，0.6g MgSO4.7H2O，0.3g NaCL，1mL CaCL2(1％)，1mL FeSO4(1mg/mL)，1mL(NH4)2SO4(0.33g/L)，10mL甘油(50％)，40mL MES(pH值5.5，用NaOH调节)，5mL微量元素储存液，1mL CaCL2(1％)，2g/L葡萄糖(液体培养基用)，1g/L葡萄糖(固体培养基用)。pH值5.4；若为固体培养基则另添加2％的琼脂粉。
本发明提供了一种提高红曲色素产量的方法。该技术方案首先从植物双元质粒pCambia0380载体出发，改造并构建了一种适合丝状真菌基因敲除的双元质粒载体pHph0380。在此基础上，从红色红曲霉CICC41233中克隆得到糖转运蛋白gltp1基因上下游同源臂片段，与质粒载体pHph0380连接后，通过根癌农杆菌EHA105介导将其转化至亲本红色红曲霉中，构建得到了重组菌株。红曲色素发酵结果表明，本方法所构建的重组菌株，其红曲色素积累时间显著提前，且醇溶性色素产量得到明显提高，在发酵144h时，醇溶性色素产量较亲本菌株提高74％。
此外，本发明利用pNeo0380载体与gltp1基因连接，通过根癌农杆菌EHA105介导转化上述重组菌株，构建得到了4株红色红曲霉回补菌株，回补菌株所产红曲色素与亲本菌株相比，没有统计学差异。本发明利用基因工程手段使红曲霉发酵产红曲色素的时间提前，提高了淀粉的利用率，提高了红曲色素的产量。
附图说明
图1是红曲霉CICC41233中gltp1基因PCR扩增片段的电泳图；
图2是红曲霉gltp1基因敲除原理图；
图3是基因敲除工程菌株的PCR鉴定结果电泳图；其中，泳道1-2：采用引物F3&R3扩增gltp1基因；泳道3-4：采用引物F4&R4扩增筛选标记hph基因；泳道5-6：采用引物F5&R5验证hph整合到gltp1基因位点；泳道1,3,5：红曲霉CICC41233总DNA为模板；泳道2,4,6：敲除菌株红曲霉GLTP24总DNA为模板；
图4是红色红曲霉CICC41233与红色红曲霉GLTP24发酵产红曲色素结果比较图；其中，(a)红曲霉不同发酵时间表型；(b)不同发酵时间剩余淀粉含量；(c)红曲色素色价；(d)光谱扫描水溶性色素；(e)光谱扫描醇溶性色素；
图5是红色红曲霉CICC41233与红色红曲霉回补菌株产红曲色素结果比较图。
具体实施方式
以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。以下实施例中所使用的近似性语言可用于定量表述，表明在不改变基本功能的情况下可允许数量有一定的变动。除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。
以下实施例中所用到的部分基因片段及引物如表1所示：
表1部分基因片段及引物的名称及序列
Figure GDA0003086518570000061
Figure GDA0003086518570000071
表1中，名称后缀为F的表示正向引物，名称后缀为R的为反向引物。
实施例1
1、双元质粒敲除载体pHph0380构建。
根据商业化的植物双元质粒pCambia0380为原始载体。设计1对寡核苷酸序列F&R，序列有上海生工生物工程有限公司合成。该序列依次含有以下限制性核酸内切酶位点(Hind III、Kpn I、Sac I、Pac I、Pme I、Xho I、Xba I、Bgl II)。采用限制性内切核酸酶Hind III与Bgl II酶切双元质粒载体pCambia0380。通过T4DNA连接酶，将寡核苷酸序列与酶切载体pCambia0380连接，获得双元质粒载体pCambia0380G。
以实验室保藏的质粒pMD19-PgpdA-hph-TtrpC为模板，采用引物PgpdA-Sac I-F&TtrpC-Xho I-R扩增得到hph表达盒。采用限制性内切核酸酶Sac I与Xho I同时酶切hph表达盒片段及双元质粒载体pCambia0380G。通过T4DNA连接酶，将hph表达盒片段及双元质粒载体pCambia0380G连接，获得双元质粒敲除载体pHph0380。
2、红曲霉gltp1基因克隆，双元质粒表达载体pNeo0380-GLTP构建
根据转录组测序提供的基因序列(924bp)，设计引物Gltp1-JYF-HindIII(含有HindIII)与Gltp1-JYR-SacI(含有SacI)(序列见表1)，以红色红曲霉CICC41233，总DNA为模板，PCR扩增得到基因片段(图1)，并测序。将测序正确符合目的片段，采用HindIII和SacI酶切PCR片段并回收。同时酶切pNeo0380载体并回收。
利用T4DNA连接酶将酶切pNeo0380回收片段与酶切回收gltp1基因片段连接，转化E.coli DH5α感受态细胞中，挑取克隆子于LB液体培养基中培养，并用引物对克隆子进行筛选。提取质粒后并酶切验证，该构建好的载体命名为pNeo0380-GLTP。
3、红曲霉gltp1基因上下游同源臂片段扩增，以及双元质粒敲除载体pHph0380-GLTP构建。
根据克隆得到的gltp1基因序列，在Monascus ruber NRRL1597基因组数据中分析，寻找其上下游序列。以红色红曲霉CICC41233，总DNA为模板，设计引物Gltp-QC-UF-PstI&Gltp-QC-UR-Sac I PCR扩增出1740bp上游臂片段；Gltp-QC-DF-Bgl II&Gltp-QC-DR-SpeI PCR扩增出1764bp下游臂片段(序列见表1)。将测序正确符合目的片段，采用酶切酶连的方法，分别连接到pHph0380载体上，该构建好的载体命名为pHph0380-GLTP。红曲霉gltp1基因敲除原理如图2所示。
4、重组菌株红色红曲霉GLTP24的构建
4.1根癌农杆菌感受态细胞制备
①将农杆菌EHA105接种于5～10mL YEP液体培养基中(含有50μg/mL利福平)，28℃，200r/min培养24h。
②取l mL活化的菌液接种于20mL含有相同抗生素的YEP培养基中，同样条件下培养(约4h)至OD600值0.5。
③将菌液冰浴30min后，4℃，离心(5000r/min，5min)，收集菌体。
④弃上清，用0.15mmol/L氯化钠冰冷溶液l0mL重悬沉淀，在同样条件下离心收集菌体，然后悬浮于20mmol/L氯化钙冰冷溶液1mL中。
⑤按每管200μL分装，液氮速冻1min。
⑥此时的菌悬液可以直接转化，也可以储存于-70℃冰柜保存备用。
上述YEP培养基：5.0g蛋白胨，1.0g酵母提取物，5.0g蔗糖，5.0g牛肉膏，0.24g硫酸镁，pH 7.2。固体培养基再添加2％的琼脂粉。
4.2液氮冻融法将双元质粒载体导入根癌农杆菌
①取1μg双元质粒载体pHph0380-GLTP加到200μL冰上溶化的农杆菌感受态细胞中，轻混，冰浴30min。
②液氮中速冻1min，37℃水浴3min，再迅速冰浴2min。
③加入800μL YEP液体培养基，28℃培养3h。
④常温下离心(5000r/min，3min)，适当浓缩菌体。
⑤取200μL菌液涂布于YEP选择平板上(含有50μg/mL利福平，50μg/mL卡那霉素)，28℃倒置培养2d。
⑥挑选转化子于YEP液体培养基中培养，并用引物对克隆子进行筛选，得到阳性克隆子。
4.3根癌农杆菌介导转化红色红曲霉CICC41233
(1)菌体准备
红色红曲霉CICC41233：MPS固体培养基培养7d，获取分生孢子，用无菌水悬浮孢子，振荡分散孢子，经2层擦镜纸过滤，调节合适孢子浓度。
根癌农杆菌：将含有双元质粒载体的农杆菌接种于3mL YEP培养基中(含有50μg/mL利福平，50μg/mL卡那霉素)，28℃培养48h，然后转接于含有200μmol/L乙酰丁香酮(AS)的5mL AIM诱导培养基中，使菌液稀释至OD600为0.15，再继续培养5～6h，至OD600为0.5～0.6。
上述MPS培养基：10g/L麦芽提取物，10g/L蛋白胨，40g/L可溶性淀粉。固体培养基：另加2g/L琼脂。
(2)农杆菌与红色红曲霉CICC41233共培养
制备AIM诱导培养基平板(含有200μmol/L AS)。将农杆菌与红色红曲霉CICC41233(按等比例)。混合物涂布于AIM平板上，25℃，避光放置培养48h。
(3)转化子筛选验证
在AIM培养基平板上再添加一层筛选培养基(MPS培养基，含有100μg/mL hph，200μmol/L头孢噻肟，0.2％Triton X-100)。30℃，继续培养5～8d。将生长的单菌落菌株，转接至另一MPS固体平板(含有hph)，培养3d后观察，菌株仍然能够生长；将能够生长的菌株，接于MPS液体培养基中培养，按照SDS裂解法提取丝状真菌总DNA进行分子分析。采用引物对(图3)进行PCR验证。确定一株菌株，为本发明的工程菌株红色红曲霉(Monascus ruber)GLTP24。
上述AIM培养基：0.8mL磷酸钾缓冲液(1.25mol/L，pH 4.8，用磷酸二氢钾与磷酸氢二钾配制)，0.6g MgSO4.7H2O，0.3g NaCL，1mL CaCL2(1％)，1mL FeSO4(1mg/mL)，1mL(NH4)2SO4(0.33g/L)，10mL甘油(50％)，40mL MES(pH值5.5，用NaOH调节)，5mL微量元素储存液，1mL CaCL2(1％)，2g/L葡萄糖(液体培养基用)，1g/L葡萄糖(固体培养基用)。pH值5.4。固体培养基再添加2％的琼脂粉。
5、红色红曲霉GLTP24与亲本株CICC41233发酵产红曲色素能力的对比
5.1采用MPS固体培养基培养
将红色红曲霉GLTP24与红色红曲霉CICC41233，在MPS固体培养基培养7d后，收集孢子悬液，按照孢子接种量为1*105个/mL。发酵条件为：30℃，180rpm发酵至第6天。
生产红曲色素的发酵培养基组分为：9.0％大米粉，0.2％NaNO3，0.1％KH2PO4，0.2％MgSO4·7H2O，0.2％乙酸。
5.2红曲色素色价测定
胞外红曲色素(水溶)色价测定：将发酵液在离心管中定容到25mL，冷冻高速离心(10 000rpm，30min)，上清液即为胞外色素。取一定量的滤液用水稀释适当倍数，以水为参照，用分光光度计测定(红曲复合色素的吸收主峰在505nm)稀释液的吸收度值，计算其总色价。计算方法为：总色价＝稀释倍数*吸光度。
胞内红曲色素(醇溶)色价测定：发酵液离心后收集沉淀，用70％乙醇在60℃下静置萃取1h，期间旋涡振荡数次。冷冻高速离心(10 000rpm，20min)，上清液即为胞内色素。取一定量的滤液用70％乙醇稀释适当倍数，以70％乙醇为参照，用分光光度计测定(红曲复合色素的吸收主峰在505nm)稀释液的吸收度值，计算其总色价。计算方法同上。
红色红曲霉GLTP24，发酵36h，相比亲本菌株，外观观察产生大量的红曲色素，表明产红曲色素的时间提前(图4a)。醇溶色价为0.29U，相比亲本红色红曲霉CICC41233，醇溶色价为0.09U，提高了2倍(图4c，4e)。发酵144h，醇溶色价为49.46U。相比亲本红色红曲霉CICC41233，醇溶色价为28.42U，提高了74％(图4c，4e)。水溶性色素没有显著差别(图4c，4d)
5.3剩余淀粉含量测定
配置I2-KI(2.6g/L I2,5.0g/L KI)溶液，在波长600nm处测定OD值，制备可溶性淀粉标准曲线。将发酵液常温离心(10000r/min，20min)，测定上清液中的淀粉的含量。图4b表明，工程菌株红色红曲霉GLTP24，能够显著促进淀粉降解代谢。发酵36h、48h、144h，工程菌株红色红曲霉GLTP24剩余淀粉含量分别为0.56mg/mL、0.15mg/mL、0mg/mL；红色红曲霉CICC41233剩余44.91mg/mL、34.26mg/mL、9.58mg/mL。
6、回补菌株的构建，及其与亲本菌株红曲霉CICC41233发酵产红曲色素能力的对比
6.1回补菌株的获得
参考实施例4的操作方法，将双元质粒表达载体pNeo0380-GLTP，通过农杆菌介导转化工程菌株红色红曲霉GLTP24(筛选标记换成G418)，获得回补菌株。
6.2红曲色素发酵能力比较
将红色红曲霉CICC41233与4株回补菌株红曲霉HU1、红曲霉HU2、红曲霉HU3、红曲霉HU4，在MPS固体培养基培养7d后，收集孢子悬液，按照孢子接种量为1*105个/mL。发酵条件为：30℃，180rpm发酵至第6天。
生产红曲色素的发酵培养基组分为：9.0％大米粉，0.2％NaNO3，0.1％KH2PO4，0.2％MgSO4·7H2O，0.2％乙酸。
6.3红曲色素色价测定
胞外红曲色素(水溶)色价测定：将发酵液在离心管中定容到25mL，冷冻高速离心(10 000rpm，30min)，上清液即为胞外色素。取一定量的滤液用水稀释适当倍数，以水为参照，用分光光度计测定(红曲复合色素的吸收主峰在505nm)稀释液的吸收度值，计算其总色价。计算方法为：总色价＝稀释倍数*吸光度。
胞内红曲色素(醇溶)色价测定：发酵液离心后收集沉淀，用70％乙醇在60℃下静置萃取1h，期间旋涡振荡数次。冷冻高速离心(10 000rpm，20min)，上清液即为胞内色素。取一定量的滤液用70％乙醇稀释适当倍数，以70％乙醇为参照，用分光光度计测定(红曲复合色素的吸收主峰在505nm)稀释液的吸收度值，计算其总色价。计算方法同上。
红色红曲霉CICC41233与4株回补菌株红曲霉HU1、红曲霉HU2、红曲霉HU3、红曲霉HU4，同时发酵6d。红曲色素色价结果，与亲本菌株相比，无统计学差异(如图5)。
实施例2
1、双元质粒敲除载体pHph0380构建
根据商业化的植物双元质粒pCambia0380为原始载体。设计1对寡核苷酸序列F&R，依次含有以下限制性核酸内切酶位点(Hind III、Kpn I、Sac I、Pac I、Pme I、Xho I、XbaI、Bgl II)。采用限制性内切核酸酶Hind III与Bgl II酶切双元质粒载体pCambia0380。通过T4DNA连接酶，将寡核苷酸序列与载体连接，获得双元质粒载体pCambia0380G。
以实验室保藏的质粒pMD19-PgpdA-hph-TtrpC为模板，采用引物PgpdA-Sac I-F&TtrpC-Xho I-R扩增得到hph表达盒片段。采用限制性内切核酸酶Sac I与Xho I同时酶切启动子片段及双元质粒载体pCambia0380G。通过T4DNA连接酶，将寡核苷酸序列与载体连接，获得双元质粒敲除载体pHph0380。
2、高产红曲色素工程菌株红色红曲霉GLTP24的构建
本发明构建到的基因工程菌株，分类命名为红色红曲霉(Monascus ruber)GLTP24。
本发明以红色红曲霉CICC41233为亲本菌株，克隆gltp1基因的上下游同源臂片段，构建于双元质粒载体pHph0380，通过根癌农杆菌EHA105介导，获得基因工程菌株红色红曲霉GLTP24。
(1)双元质粒敲除载体pHph0380-GLTP构建
以红曲霉CICC41233总DNA为模板，PCR扩增得到gltp1基因的上下游同源臂片段。然后采用限制性内切核酸酶Pst I与SacI同时酶切上游同源臂片段，采用限制性内切核酸酶Bgl II与Spe I同时酶切下游同源臂片段以及双元质粒载体pHph0380。通过T4DNA连接酶，将基因片段与载体连接，获得双元质粒敲除载体pHph0380-GLTP。
(2)根癌农杆菌介导转化红色红曲霉CICC41233
采用根癌农杆菌EHA105介导双元质粒载体pHph0380-GLTP，转化红色红曲霉CICC41233中，成功获得工程菌株红色红曲霉GLTP24。
3、基因工程菌株红色红曲霉GLTP24发酵提高红曲色素的产量
红色红曲霉CICC41233与红色红曲霉GLTP24，同时发酵产红曲色素。发酵培养基组分为：9.0％大米粉，0.2％NaNO3，0.1％KH2PO4，0.2％MgSO4·7H2O，0.2％乙酸。菌株孢子接种量为1*105个/mL。发酵条件为：30℃，180rpm发酵至第6天。结果表明工程菌株发酵产红曲色素时间提前，同时显著促进了淀粉降解代谢。发酵36h，红色红曲霉GLTP24醇溶色价为0.29U，相比亲本红色红曲霉CICC41233，醇溶色价为0.09U，提高了2倍。发酵144h，醇溶色价为49.46U。相比亲本红色红曲霉CICC41233，醇溶色价为28.42U，提高了74％。
4、红曲霉回补菌株的构建及发酵产红曲色素
为进一步研究该基因的作用，以红曲霉CICC41233的DNA为模板，PCR扩增得到糖转运蛋白基因(gltp1)。然后采用限制性内切核酸酶HindIII与SacI同时酶切基因片段，以及双元质粒表达载体pNeo0380。通过T4DNA连接酶，将基因片段与载体连接，获得双元质粒表达载体pNeo0380-GLTP。采用根癌农杆菌EHA105介导表达载体，转化工程菌株红色红曲霉GLTP24中，成功获得回补菌株红色红曲霉HU1、红色红曲霉HU2、红色红曲霉HU3、红色红曲霉HU4。4株红色红曲霉回补菌株，所产红曲色素与亲本菌株相比，没有统计学差异。
以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 江西科技师范大学
<120> 一种提高红曲色素产量的方法
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
agcttggtac cgagctctta attaagttta aacctcgagt ctagaa 46
<210> 2
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
gatcttctag actcgaggtt taaacttaat taagagctcg gtacca 46
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 3
gtgacgaact cgtgagctct gtac 24
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 4
ggacttctag actcgagaag aagga 25
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 5
ctgcactcga cctgctgagg tc 22
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 6
tattcttctc ttcgccggag cc 22
<210> 7
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 7
cccaagctta tgtttgtccc cgaatcccca cg 32
<210> 8
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 8
cgagctctta aagggcctcg gccgaactg 29
<210> 9
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 9
aactgcagcc atctgtatcc tccgtagtta caga 34
<210> 10
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 10
cgagctcgct tacctgacaa tagcagctct tac 33
<210> 11
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 11
gaagatctca gcttctaatg ttgttttgat attgg 35
<210> 12
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 12
ggactagttc tgaatatgga tttcagtgat tatcc 35
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 13
atgcctgaac tcaccgcgac 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 14
cggtcggcat ctactctatt 20
<210> 15
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 15
aggaatagag tagatgccga cc 22
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 16
tccaagtgga caaacttgtg g 21
<210> 17
<211> 948
<212> DNA
<213> 红色红曲霉(Monascus rubber)
<400> 17
atgtttgtcc ccgaatcccc acgtttcctg taccgtcaag gcaaagtcga ggaggctcgt 60
caggtcatgg ccaaactggc tggtgtccca cccaaccatc gccagatcgt ctcggagatg 120
caggagatga aagagaagct cgacgaagag aaagccgccg gcaaggcacc ctggtatgag 180
gtgttcacgg gcccagccat gttctggcgg acaacgctcg gaatagtctt gcagtctctg 240
caacagctca ctggcgccaa cttcatcttc ttttacggta acactatctt ctatgccacc 300
ggccttgaga acagctacga aacccagatt attatgggaa ctgtcaattt cgccatgtcc 360
atcgtctccc tgtgggtcgt ccagcgcttc cgccgtcgtc ccatcctaat tattggtggc 420
atcgccatgt tcatctgttt cctgatcttc gcctccgtcg gccacttctc cctcgaccat 480
gaaaaccccc agaatacccc caaagcaggt acggcactta ttgtcttctc ctgcttcttc 540
atcgccgcat acgccgttag ctggggtcca cttatctggg ctatctgcgg tgaactgttc 600
ccatccaaat accgtgacgt ttgcgtcagc ttgagtaccg catcgaactg gacctggaac 660
ttcctactct gcttctttac gcccttcatc tccagcgcta tcgattatcg gtacggttat 720
gtcttcggcg catgttgtgc tgccggatcc atcatcacct acttcttcgt caacgaatcc 780
tacggccgga ccctcgagga aatcgacacc atgtacgtca tgcacgtcaa gccatggcag 840
agcaagaact gggttgctcc tcctgccatc cgaaacggcg agaacagggt ccccaacttg 900
gaaagccacg aagctactcc tgcacacagt tcggccgagg ccctttaa 948
<210> 18
<211> 315
<212> PRT
<213> 红色红曲霉(Monascus rubber)
<400> 18
Met Phe Val Pro Glu Ser Pro Arg Phe Leu Tyr Arg Gln Gly Lys Val
1 5 10 15
Glu Glu Ala Arg Gln Val Met Ala Lys Leu Ala Gly Val Pro Pro Asn
20 25 30
His Arg Gln Ile Val Ser Glu Met Gln Glu Met Lys Glu Lys Leu Asp
35 40 45
Glu Glu Lys Ala Ala Gly Lys Ala Pro Trp Tyr Glu Val Phe Thr Gly
50 55 60
Pro Ala Met Phe Trp Arg Thr Thr Leu Gly Ile Val Leu Gln Ser Leu
65 70 75 80
Gln Gln Leu Thr Gly Ala Asn Phe Ile Phe Phe Tyr Gly Asn Thr Ile
85 90 95
Phe Tyr Ala Thr Gly Leu Glu Asn Ser Tyr Glu Thr Gln Ile Ile Met
100 105 110
Gly Thr Val Asn Phe Ala Met Ser Ile Val Ser Leu Trp Val Val Gln
115 120 125
Arg Phe Arg Arg Arg Pro Ile Leu Ile Ile Gly Gly Ile Ala Met Phe
130 135 140
Ile Cys Phe Leu Ile Phe Ala Ser Val Gly His Phe Ser Leu Asp His
145 150 155 160
Glu Asn Pro Gln Asn Thr Pro Lys Ala Gly Thr Ala Leu Ile Val Phe
165 170 175
Ser Cys Phe Phe Ile Ala Ala Tyr Ala Val Ser Trp Gly Pro Leu Ile
180 185 190
Trp Ala Ile Cys Gly Glu Leu Phe Pro Ser Lys Tyr Arg Asp Val Cys
195 200 205
Val Ser Leu Ser Thr Ala Ser Asn Trp Thr Trp Asn Phe Leu Leu Cys
210 215 220
Phe Phe Thr Pro Phe Ile Ser Ser Ala Ile Asp Tyr Arg Tyr Gly Tyr
225 230 235 240
Val Phe Gly Ala Cys Cys Ala Ala Gly Ser Ile Ile Thr Tyr Phe Phe
245 250 255
Val Asn Glu Ser Tyr Gly Arg Thr Leu Glu Glu Ile Asp Thr Met Tyr
260 265 270
Val Met His Val Lys Pro Trp Gln Ser Lys Asn Trp Val Ala Pro Pro
275 280 285
Ala Ile Arg Asn Gly Glu Asn Arg Val Pro Asn Leu Glu Ser His Glu
290 295 300
Ala Thr Pro Ala His Ser Ser Ala Glu Ala Leu
305 310 315

Claims (8)

1.一种提高红曲色素产量的方法，其特征在于包括以下步骤：
1)取植物双元质粒pCambia0380，用限制性内切核酸酶Hind III与Bgl II酶切，而后将一对依次含有Hind III、Kpn I、Sac I、Pac I、Pme I、Xho I、Xb a I、Bgl II酶切位点的寡核苷酸序列通过T4 DNA连接酶与之连接，即得到双元质粒表达载体pCambia0380G；
2)以质粒pMD19-PgpdA-hph-TtrpC为模板，采用一对引物扩增得到hph表达盒片段，用限制性内切核酸酶Sac I与Xho I同时酶切所述hph表达盒片段以及双元质粒表达载体pCambia0380G，而后通过T4 DNA连接酶将二者连接，即得到双元质粒敲除载体pHph0380；
3)以红色红曲霉CICC41233总DNA为模板，采用一对引物扩增出糖转运蛋白gltp1基因的上游同源臂片段；以红色红曲霉CICC41233总DNA为模板，采用另一对引物扩增出糖转运蛋白gltp1基因的下游同源臂片段；将所述上游同源臂片段和所述下游同源臂片段分别连接至所述载体pHph0380上，即得到双元质粒敲除载体pHph0380-GLTP；
4)将所述双元质粒敲除载体pHph0380-GLTP导入红色红曲霉菌株中，构建得到重组菌株；
5)利用所述重组菌株发酵产红曲霉素；
步骤4)包括：制备感受态的根癌农杆菌EHA105，通过液氮冻融法将所述双元质粒敲除载体pHph0380-GLTP导入根癌农杆菌EHA105，而后将含有双元质粒敲除载体pHph0380-GLTP的根癌农杆菌EHA105转化至红色红曲霉CICC41233中，筛选阳性克隆，即得到所述重组菌株；
所述筛选阳性克隆，包括以下步骤：在避光培养48h后的AIM诱导培养基平板上再添加一层含100μg/mL hph、200μmol/L头孢噻肟、0.2％Triton X-100的MPS培养基，30℃继续培养5～8d；挑取单菌落转接至含100μg/mL hph的MPS固体培养基平板上，培养3d后将能够生长的菌株，接于MPS液体培养基中培养，按照SDS裂解法提取丝状真菌总DNA进行分子分析，用序列为SEQ ID No:15、SEQ ID No:16的一对引物进行PCR验证，选取阳性菌株即为所述重组菌株。
2.根据权利要求1所述的一种提高红曲色素产量的方法，其特征在于步骤1)中所述的一对依次含有Hind III、Kpn I、Sac I、Pac I、Pme I、Xho I、Xba I、Bgl II酶切位点的寡核苷酸序列，分别如SEQ ID No:1、SEQ ID No:2所示。
3.根据权利要求1所述的一种提高红曲色素产量的方法，其特征在于步骤2)中所述的一对引物分别为PgpdA-Sac I-F和TtrpC-Xho I-R，其序列分别如SEQ ID No:3、SEQ ID No:4所示。
4.根据权利要求1所述的一种提高红曲色素产量的方法，其特征在于步骤3)中所述的一对引物分别为Gltp-QC-UF-Pst I和Gltp-QC-UR-Sac I，其序列分别如SEQ ID No:9、SEQID No:10所示；所述糖转运蛋白gltp1基因的上游同源臂片段的长度为1740bp；步骤3)中所述的另一对引物分别为Gltp-QC-DF-Bgl II和Gltp-QC-DR-Spe I，其序列分别如SEQ IDNo:11、SEQ ID No:12所示；所述糖转运蛋白gltp1基因的下游同源臂片段的长度为1764bp。
5.根据权利要求1所述的一种提高红曲色素产量的方法，其特征在于所述通过液氮冻融法将所述双元质粒敲除载体pHph0380-GLTP导入根癌农杆菌EHA105，包括以下步骤：取1μg所述双元质粒敲除载体pHph0380-GLTP加入到200μL感受态的根癌农杆菌EHA105中，混合后冰浴30min；液氮中速冻1min，37℃水浴3min，再冰浴2min；加入800μL YEP液体培养基，28℃培养3h；常温下以5000rpm的转速离心3min，浓缩菌体；取200μL浓缩后的菌液涂布于含有50μg/mL利福平、50μg/mL卡那霉素的YEP选择性培养基平板上，28℃倒置培养2d；挑选转化子于YEP液体培养基中培养，并用引物对克隆子进行筛选，得到阳性克隆子，即为含有双元质粒敲除载体pHph0380-GLTP的根癌农杆菌EHA105。
6.根据权利要求1所述的一种提高红曲色素产量的方法，其特征在于所述将含有双元质粒敲除载体pHph0380-GLTP的根癌农杆菌EHA105转化至红色红曲霉CI CC41233中，包括以下步骤：
取红色红曲霉CICC41233，用MPS固体培养基培养7d，获取分生孢子，用无菌水悬浮孢子，振荡分散孢子，经2层擦镜纸过滤，调节孢子浓度；
取含有双元质粒敲除载体pHph0380-GLTP的根癌农杆菌EHA105，接种于3mL含有50μg/mL利福平、50μg/mL卡那霉素的YEP培养基中，28℃培养48h，而后转接于5mL含有200μmol/L乙酰丁香酮的AIM诱导培养基中，使菌液稀释至OD600值为0.15，再继续培养5～6h，至OD600值为0.5～0.6；
将以上所得的红色红曲霉孢子液和含有双元质粒敲除载体pHph0380-GLTP的根癌农杆菌EHA105菌液，混合涂布于含200μmol/L乙酰丁香酮的AIM诱导培养基平板上，25℃，避光培养48h。
7.根据权利要求1所述的一种提高红曲色素产量的方法，其特征在于步骤5)中：
发酵培养基成分包括：9％(w/w)大米粉，0.2％(w/w)NaNO3，0.1％(w/w)KH2PO4，0.2％(w/w)MgSO4·7H2O，0.2％(w/w)乙酸；
发酵初始时，向培养基中接入所述重组菌株的孢子105个/mL；
发酵条件为：温度30℃，搅拌转速180rpm，发酵6天。
8.根据权利要求1所述的一种提高红曲色素产量的方法，其特征在于还包括以下步骤6)：以红色红曲霉CICC41233总DNA为模板，以序列分别如SEQ ID No:7、SEQ ID No:8所示的一对引物执行PCR扩增，利用Hind III和Sac I分别酶切该PC R扩增产物以及pNeo0380载体，利用T4 DNA连接酶将二者连接，而后将连接产物转化至E.coli DH5α感受态细胞中，提取pNeo0380-GLTP质粒载体；将所述pNe o0380-GLTP质粒载体转化至所述重组菌株中，得到回补菌株，而后比较所述重组菌株与所述回补菌株发酵产红曲色素的能力。
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