CN107574173A - 一种重组质粒及其用于构建红曲色素高产菌株的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种重组质粒及其用于构建红曲色素高产菌株的方法，该技术方案首先从植物双元质粒pCambia0380载体出发，改造并构建了一种适合丝状真菌表达的双元质粒载体pNeo0380。在此基础上，从米曲霉中克隆得到α‑淀粉酶基因，与质粒载体连接后，通过根癌农杆菌EHA105介导将其转化至野生型的红色红曲霉中，构建得到了红曲色素高产菌株，该菌株可显著促进底物大米淀粉的降解，从而提高红曲色素产量。与此同时，本发明围绕重组菌株的生物学特性设计了专用于生产淀粉酶和专用于生产红曲色素的两种发酵方法，所产淀粉酶活性及红曲色素产量均显著高于野生型菌株，同时提升了红曲色素中醇溶性成分的比例。
Description
技术领域
本发明涉及工业微生物技术领域，进一步涉及基因工程技术以及霉菌的发酵技术，具体涉及一种重组质粒及其用于构建红曲色素高产菌株的方法。
背景技术
红曲色素是由微生物红曲霉菌(Monasus spp.)，以大米为原料发酵而成的天然色素，在我国有一千多年的历史。作为食品添加剂，红曲色素广泛应用于食品加工和化妆品制造等领域；因其还具有广泛的生物活性如调血脂、降血压、防血管硬化、抗糖尿病、抑制肥胖、抗炎症、抗过敏、防过氧化、抗癌、抗细菌、抗真菌等，它在益生保健产品开发和医疗领域的应用也越来越受到重视。
红曲色素是红曲霉的次级代谢产物，由脂肪酸合成途径和聚酮合成途径共同完成合成代谢。其化学结构主要分为聚酮和脂肪酸链两部分。脂肪酸链的合成以乙酰CoA为前体，经脂肪酸合酶(Fatty acid synthase，FAS)复合体作用，经过一系列合成反应形成中长链脂肪酸，其与乙酰CoA反应生成β-酮酸；聚酮的合成同样以乙酰CoA为前体，在聚酮合酶(Polyketide synthase,PKS)作用下，依次合成多聚酮体化合物，最终形成带有生色基团的聚酮。聚酮的羧基基团与脂肪酸链的羟基基团发生酯化反应，从而形成红曲色素。基于以上原理，为了提高红曲色素的产量，现有技术普遍通过发酵工艺改良来实现红曲霉的代谢调控，进而定向累积目的产物；尽管发酵条件的优化能在一定程度上改善红曲色素产量，但受限于红曲霉自身的代谢特性，红曲色素累积很难再进一步提高。
此外，红曲霉所产红曲色素分为醇溶性色素和水溶性色素。醇溶性色素为红曲霉在发酵过程中直接合成，存在于胞内；水溶性色素是红曲霉自身合成的色素与发酵液中氨基酸等物质结合形成的复合色素，分布于胞外。在天然菌株的生长过程中，这两种红曲色素均有产生，单纯凭借培养方法无法实现定向生产其中一种红曲色素。
发明内容
本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种重组质粒及其用于构建红曲色素高产菌株的方法，以解决现有技术中常规培养红色红曲霉产红曲色素时产量较低的技术问题。
本发明要解决的另一技术问题是现有技术中常规培养红色红曲霉产红曲色素时难以定向累积醇溶性红曲色素。
为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：
一种重组质粒，是由以下方法构建的：
1)取植物双元质粒pCambia0380，用限制性内切核酸酶Hind III与Bgl II酶切，而后将序列为SEQ ID No:1、SEQ ID No:2的一对寡核苷酸序列通过T4DNA连接酶与之连接，即得到双元质粒表达载体pCambia0380G；
2)以质粒pUR5750为模板，以序列为SEQ ID No:3、SEQ ID No:4的一对引物进行PCR扩增，得到gpdA启动子片段，用限制性内切核酸酶BamH I与Pst I同时酶切所述gpdA启动子片段和双元质粒表达载体pCambia0380G，而后通过T4DNA连接酶将二者连接，即得到双元质粒表达载体pCambia0380G-gpdA；
3)以质粒pMD19-TtrpC-PtrpC-Neo为模板，以序列为SEQ ID No:5、SEQ ID No:6的一对引物进行PCR扩增，得到终止子及Neo筛选标记片段，用限制性内切核酸酶Bgl II与SpeI同时酶切所述终止子及Neo筛选标记片段和双元质粒表达载体pCambia0380G-gpdA，而后通过T4DNA连接酶将二者连接，即得到双元质粒表达载体pNeo0380。
作为优选，步骤1)中所述的一对寡核苷酸序列依次含有以下限制性核酸内切酶位点：Hind III、Kpn I、Sac I、Pac I、Pme I、Xho I、Xba I、Bgl II。
同时，本发明提供了应用上述重组质粒构建红曲色素高产菌株的方法，包括以下步骤：
A)以米曲霉NRRL3488的cDNA为模板，以序列为SEQ ID No:7、SEQ ID No:8的一对引物进行PCR扩增得到α-淀粉酶A基因，用限制性内切核酸酶HindIII与SacI同时酶切所述α-淀粉酶A基因和双元质粒表达载体pNeo0380，而后通过T4DNA连接酶将二者连接，即得到双元质粒表达载体pNeo0380-amy；
B)用根癌农杆菌EHA105介导双元质粒表达载体pNeo0380-amy，转化至红色红曲霉(Monascus ruber)菌株中，筛选阳性克隆，即得到所述红曲色素高产菌株。
作为优选，步骤B)所述红色红曲霉菌株是红色红曲霉CICC41233株。
作为优选，步骤B)具体包括以下操作：先制备感受态的根癌农杆菌EHA105，再通过液氮冻融法将所述双元质粒表达载体pNeo0380-amy导入根癌农杆菌EHA105，而后将含有双元质粒表达载体pNeo0380-amy的根癌农杆菌EHA105转化至红色红曲霉菌株中，再筛选阳性克隆，即得到所述红曲色素高产菌株。
作为优选，所述制备感受态的根癌农杆菌EHA105，包括以下步骤：将根癌农杆菌EHA105接种于5～10mL含有50μg/mL利福平的YEP液体培养基中，以温度28℃、搅拌转速200rpm的条件培养24h；取l mL活化的菌液接种于20mL含有50μg/mL利福平的YEP液体培养基中，以温度28℃、搅拌转速200rpm的条件培养至菌液OD600值0.5；将菌液冰浴30min后，在4℃条件下以5000rpm的转速离心5min，弃上清；用0.15mmol/L的氯化钠溶液l0mL重悬沉淀，在4℃条件下以5000rpm的转速离心5min，弃上清，而后悬浮于20mmol/L的氯化钙溶液1mL中。
作为优选，所述通过液氮冻融法将所述双元质粒表达载体pNeo0380-amy导入根癌农杆菌EHA105，包括以下步骤：取1μg所述双元质粒表达载体pNeo0380-amy加入到200μL感受态的根癌农杆菌EHA105中，混合后冰浴30min；液氮中速冻1min，37℃水浴3min，再冰浴2min；加入800μL YEP液体培养基，28℃培养3h；常温下以5000rpm的转速离心3min，浓缩菌体；取200μL浓缩后的菌液涂布于含有50μg/mL利福平、50μg/mL卡那霉素的YEP选择性培养基平板上，28℃倒置培养2d；挑选转化子于YEP液体培养基中培养，并用引物对克隆子进行筛选，得到阳性克隆子，即为含有双元质粒表达载体pNeo0380-amy的根癌农杆菌EHA105。
作为优选，所述将含有双元质粒表达载体pNeo0380-amy的根癌农杆菌EHA105转化至红色红曲霉菌株中，包括以下步骤：
取红色红曲霉菌株，用MPS固体培养基培养7d，获取分生孢子，用无菌水悬浮孢子，振荡分散孢子，经2层擦镜纸过滤，调节孢子浓度；
取含有双元质粒表达载体pNeo0380-amy的根癌农杆菌EHA105，接种于3mL含有50μg/mL利福平、50μg/mL卡那霉素的YEP培养基中，28℃培养48h，而后转接于5mL含有200μmol/L乙酰丁香酮的AIM诱导培养基中，使菌液稀释至OD600值为0.15，再继续培养5～6h，至OD600值为0.5～0.6；
将以上所得的红色红曲霉孢子液和含有双元质粒表达载体pNeo0380-amy的根癌农杆菌EHA105菌液，混合涂布于含200μmol/L乙酰丁香酮的AIM诱导培养基平板上，25℃，避光培养48h。
作为优选，所述筛选阳性克隆，包括以下步骤：在避光培养48h后的AIM诱导培养基平板上再添加一层含80μg/mL G418、200μmol/L头孢噻肟、0.2％Triton X-100的PDA培养基，30℃继续培养5～8d；挑取单菌落转接至含80μg/mLG418的MPS固体培养基平板上，培养3d后将能够生长的菌株，接于MPS液体培养基中培养，按照SDS裂解法提取丝状真菌总DNA进行分子分析，用序列为SEQ ID No:7、SEQ ID No:8的一对引物进行PCR验证，选取阳性菌株。
同时，本发明提供了应用以上任一项所构建高产菌株发酵产红曲色素的方法，其特征在于该方法中：
发酵培养基成分包括：9％(w/w)大米粉，0.2％(w/w)NaNO3，0.1％(w/w)KH2PO4，0.2％(w/w)MgSO4·7H2O，0.2％(w/w)乙酸；
发酵初始时，向培养基中接入所述高产菌株的孢子105个/mL；
发酵条件为：温度30℃，搅拌转速180rpm，发酵6天。
同时，本发明提供了应用以上任一项所构建高产菌株发酵产淀粉酶的方法，其特征在于该方法中：
发酵培养基成分包括：9％(w/w)葡萄糖，0.2％(w/w)NaNO3，0.1％(w/w)KH2PO4，0.2％(w/w)MgSO4·7H2O，0.2％(w/w)乙酸；
发酵初始时，向培养基中接入所述高产菌株的孢子105个/mL；
发酵条件为：温度30℃，搅拌转速180rpm，发酵6天。
在以上技术方案中，所述植物双元质粒pCambia0380、红色红曲霉CICC41233、根癌农杆菌EHA105、米曲霉NRRL3488，均属于常规商品化的生物材料，可自市面购得；其中，红色红曲霉CICC41233购自于中国工业微生物菌株保藏管理中心。
在以上技术方案中，所述质粒pUR5750，其具体制备方法可以参照参考文献“deGroot MJA，Bundock P，Hooykaas PJJ，et al.1998.Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of filamentous fungi.Nature Biotechnology，16：839-842”实施。所述质粒pMD19-TtrpC-PtrpC-Neo可以通过质粒pAN52-mdh扩增得到，其具体制备方法可以参照中国专利文献CN106148209A实施。
在以上技术方案中，所述YEP培养基的配方如下：5.0g蛋白胨，1.0g酵母提取物，5.0g蔗糖，5.0g牛肉膏，0.24g硫酸镁，pH 7.2；若为固体培养基则另添加2％的琼脂粉。
所述MPS培养基配方如下：10g/L麦芽提取物，10g/L蛋白胨，40g/L可溶性淀粉；若为固体培养基则另添加2g/L琼脂。
所述述AIM诱导培养基配方如下：0.8mL磷酸钾缓冲液(1.25mol/L，pH 4.8，用磷酸二氢钾与磷酸氢二钾配制)，0.6g MgSO4.7H2O，0.3g NaCL，1mL CaCL2(1％)，1mL FeSO4(1mg/mL)，1mL(NH4)2SO4(0.33g/L)，10mL甘油(50％)，40mL MES(pH值5.5，用NaOH调节)，5mL微量元素储存液，1mL CaCL2(1％)，2g/L葡萄糖(液体培养基用)，1g/L葡萄糖(固体培养基用)。pH值5.4；若为固体培养基则另添加2％的琼脂粉。
本发明提供了一种重组质粒及其用于构建红曲色素高产菌株的方法，该技术方案首先从植物双元质粒pCambia0380载体出发，改造并构建了一种适合丝状真菌表达的双元质粒载体pNeo0380。在此基础上，从米曲霉中克隆得到α-淀粉酶基因，与质粒载体连接后，通过根癌农杆菌EHA105介导将其转化至野生型的红色红曲霉中，构建得到了红曲色素高产菌株，该菌株可显著促进底物大米淀粉的降解，从而提高红曲色素产量。与此同时，本发明围绕重组菌株的生物学特性设计了专用于生产淀粉酶和专用于生产红曲色素的两种发酵方法，所产淀粉酶活性及红曲色素产量均显著高于野生型菌株，同时提升了红曲色素中醇溶性成分的比例。
具体来看，在以葡萄糖为唯一碳源的培养基中发酵，本发明所构建的红色红曲霉重组菌相比野生株红色红曲霉CICC41233，淀粉酶酶活性在第3d和6d分别提高了6.65倍和4.26倍。当采用9.0％大米粉为主要碳源发酵48小时时，淀粉已经完全降解；而野生型的红色红曲霉CICC41233在发酵48小时，剩余43.93mg/mL的淀粉，直至144小时，仍剩余7.29mg/mL淀粉。
在最佳发酵条件下(30℃，180rpm培养至第6天)，野生型的红色红曲霉CICC41233总色价和醇溶色价分别为34.60U，21.93U；而本发明所构建的红色红曲霉重组菌总色价和醇溶色价分别为54.11U，50.77U。总色价和醇溶色价分别提高了56.39％和132％，并且醇溶色价占总色价的比值分别由63.39％提高到93.83％。
附图说明
图1是植物双元质粒pCambia0380载体图谱。
图2是本发明具体实施方式中米曲霉α-淀粉酶基因片段的扩增电泳图及双元质粒表达载体pNeo0380图谱；其中，a部分为米曲霉α-淀粉酶基因片段的扩增电泳图；b部分为双元质粒表达载体pNeo0380图谱。
图3是本发明具体实施方式中红色红曲霉CICC41233与红色红曲霉Amy9所产α-淀粉酶的活性比较图。
图4是本发明具体实施方式中红色红曲霉CICC41233与红色红曲霉Amy9所产红曲色素产量比较图和生物量比较图；其中a部分为二者所产红曲色素产量比较图；b部分为二者累积的生物量比较图。
图5是本发明具体实施方式中定量PCR分析发酵过程中基因表达情况图；其中a部分为半定量PCR的结果电泳图；b部分为4种基因的相对表达水平图；c部分为上述相对表达水平的倍数关系图，图中将红色红曲霉CICC41233所得结果定义为1倍。
具体实施方式
以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。
以下实施例中所用到的部分基因片段及引物如表1所示：
表1部分基因片段及引物的名称及序列
表1中，名称后缀为F的表示正向引物，名称后缀为R的为反向引物。
实施例1
1、双元质粒表达载体pNeo0380的构建
根据商业化的植物双元质粒pCambia0380为原始载体(图1)。设计1对寡核苷酸序列F&R，序列有上海生工生物工程有限公司合成。该序列依次含有以下限制性核酸内切酶位点(Hind III、Kpn I、Sac I、Pac I、Pme I、Xho I、Xba I、Bgl II)。采用限制性内切核酸酶Hind III与Bgl II酶切双元质粒表达载体pCambia0380。通过T4DNA连接酶，将寡核苷酸序列与酶切载体pCambia0380连接，获得双元质粒表达载体pCambia0380G。
以实验室保藏的质粒pUR5750为模板，采用引物PgpdA-BamH I-F&PgpdA-Pst I-R扩增得到gpdA启动子片段。采用限制性内切核酸酶BamH I与Pst I同时酶切启动子片段及双元质粒表达载体pCambia0380G。通过T4DNA连接酶，将启动子片段及双元质粒表达载体pCambia0380G连接，获得双元质粒表达载体pCambia0380G-gpdA。
以实验室保藏的质粒pMD19-TtrpC-PtrpC-Neo为模板，采用引物TtrpC-BglII-F&Neo-Spe I-R扩增得到终止子及Neo筛选标记片段。采用限制性内切核酸酶Bgl II与Spe I同时酶切上述片段及双元质粒表达载体pCambia0380G-gpdA。通过T4DNA连接酶连接，获得双元质粒表达载体pNeo0380(图2b)。
2、米曲霉α-淀粉酶基因(AoamyA)克隆，双元质粒表达载体pNeo0380-amy构建
根据米曲霉α-淀粉酶基因序列(1,500bp,GenBank accession no.D00434.1)。设计引物amy-HindIII-F(含有HindIII)与amy-SacI-R(含有SacI)(序列见表1)，以菌株米曲霉NRRL3488的cDNA为模板，PCR扩增得到基因片段(图2a)，并测序。将测序正确符合的目的片段，采用HindIII和SacI酶切PCR片段并回收。同时酶切pNeo0380载体并回收。
利用T4DNA连接酶将酶切pNeo0380回收片段与酶切回收AoamyA片段连接，转化E.coli DH5α感受态细胞中，挑取克隆子于LB液体培养基中培养，并用引物对克隆子进行筛选。提取质粒后并酶切验证，该构建好的载体命名为pNeo0380-amy。
3、将构建成功的载体pNeo0380-amy，转化亲本红色红曲霉CICC41233，获得基因工程菌株红色红曲霉Amy9
3.1根癌农杆菌感受态细胞制备
①将农杆菌EHA105接种于5～10mL YEP液体培养基中(含有50μg/mL利福平)，28℃，200r/min培养24h。
②取l mL活化的菌液接种于20mL含有相同抗生素的YEP培养基中，同样条件下培养(约4h)至OD600值0.5。
③将菌液冰浴30min后，4℃，离心(5000r/min，5min)，收集菌体。
④弃上清，用0.15mmol/L氯化钠冰冷溶液l0mL重悬沉淀，在同样条件下离心收集菌体，然后悬浮于20mmol/L氯化钙冰冷溶液1mL中。
⑤按每管200μL分装，液氮速冻1min。
⑥此时的菌悬液可以直接转化，也可以储存于-70℃冰柜保存备用。
上述YEP培养基：5.0g蛋白胨，1.0g酵母提取物，5.0g蔗糖，5.0g牛
肉膏，0.24g硫酸镁，pH 7.2。固体培养基再添加2％的琼脂粉。
3.2液氮冻融法将双元质粒载体导入根癌农杆菌
①取1μg双元质粒载体pNeo0380-amy加到200μL冰上溶化的农杆菌感受态细胞中，轻混，冰浴30min。
②液氮中速冻1min，37℃水浴3min，再迅速冰浴2min。
③加入800μL YEP液体培养基，28℃培养3h。
④常温下离心(5000r/min，3min)，适当浓缩菌体。
⑤取200μL菌液涂布于YEP选择平板上(含有50μg/mL利福平，50μg/mL卡那霉素)，28℃倒置培养2d。
⑥挑选转化子于YEP液体培养基中培养，并用引物对克隆子进行筛选，得到阳性克隆子。
3.3根癌农杆菌介导转化红色红曲霉CICC41233
(1)菌体准备
红色红曲霉CICC41233：MPS固体培养基培养7d，获取分生孢子，用无菌水悬浮孢子，振荡分散孢子，经2层擦镜纸过滤，调节合适孢子浓度。
根癌农杆菌：将含有双元质粒载体的农杆菌接种于3mL YEP培养基中(含有50μg/mL利福平，50μg/mL卡那霉素)，28℃培养48h，然后转接于含有200μmol/L乙酰丁香酮(AS)的5mL AIM诱导培养基中，使菌液稀释至OD600为0.15，再继续培养5～6h，至OD600为0.5～0.6。
上述MPS培养基：10g/L麦芽提取物，10g/L蛋白胨，40g/L可溶性淀粉。固体培养基：另加2g/L琼脂。
(2)农杆菌与红色红曲霉CICC41233共培养
制备AIM诱导培养基平板(含有200μmol/L AS)。将农杆菌与红色红曲霉CICC41233(按等比例)。混合物涂布于AIM平板上，25℃，避光放置培养48h。
(3)转化子筛选验证
在AIM培养基平板上再添加一层筛选培养基上(PDA培养基，含有80μg/mLG418，200μmol/L头孢噻肟，0.2％Triton X-100)。30℃，继续培养5～8d。将生长的单菌落菌株，转接至另一MPS固体平板(含有G418)，培养3d后观察，菌株仍然能够生长；将能够生长的菌株，接于MPS液体培养基中培养，按照SDS裂解法提取丝状真菌总DNA进行分子分析。采用引物对amy-HindIII-F和amy-SacI-R进行PCR验证，有7株为阳性菌株。经红曲色素初步发酵，确定一株菌株即Amy9，为本发明的工程菌株红色红曲霉(Monascus ruber)Amy9。
上述AIM培养基：0.8mL磷酸钾缓冲液(1.25mol/L，pH 4.8，用磷酸二氢钾与磷酸氢二钾配制)，0.6g MgSO4.7H2O，0.3g NaCL，1mL CaCL2(1％)，1mL FeSO4(1mg/mL)，1mL(NH4)2SO4(0.33g/L)，10mL甘油(50％)，40mL MES(pH值5.5，用NaOH调节)，5mL微量元素储存液，1mL CaCL2(1％)，2g/L葡萄糖(液体培养基用)，1g/L葡萄糖(固体培养基用)。pH值5.4。固体培养基再添加2％的琼脂粉。
4、新构建的工程菌株红色红曲霉Amy9与亲本株CICC41233发酵产淀粉酶及红曲色素能力的对比。
4.1采用MPS固体培养基培养
将红色红曲霉Amy9与红色红曲霉CICC41233，在MPS固体培养基培养7d后，收集孢子悬液，按照孢子接种量为1*105个/mL。发酵条件为：30℃，180rpm发酵至第6天。
生产淀粉酶的发酵培养基组分为：9.0％葡萄糖，0.2％NaNO3，0.1％KH2PO4，0.2％MgSO4·7H2O，0.2％乙酸。菌株孢子接种量为1*105个/mL。
生产红曲色素的发酵培养基组分为：9.0％大米粉，0.2％NaNO3，0.1％KH2PO4，0.2％MgSO4·7H2O，0.2％乙酸。
4.2淀粉酶酶活性测定
发酵液常温离心(10000r/min，20min)，上清液即为粗酶液，用于酶活测定。采用南京建成生物工程研究所提供的淀粉酶(AMS)测试盒(C016)检测。红色红曲霉Amy9，在第3天和第6天淀粉酶酶活分别为55.84U/dL、68.44U/dL。显著高于亲本菌株红色红曲霉CICC41233的酶活性，仅为8.40U/dL、16.05U/dL(图3)。淀粉酶活性在3d和6d，分别提高了6.65倍和4.26倍。
4.3红曲色素色价测定
胞外红曲色素(水溶)色价测定：将发酵液在离心管中定容到25mL，冷冻高速离心(10 000rpm，30min)，上清液即为胞外色素。取一定量的滤液用水稀释适当倍数，以水为参照，用分光光度计测定(红曲复合色素的吸收主峰在505nm)稀释液的吸收度值，计算其总色价。计算方法为：总色价＝稀释倍数*吸光度。
胞内红曲色素(醇溶)色价测定：发酵液离心后收集沉淀，用70％乙醇在60℃下静置萃取1h，期间旋涡振荡数次。冷冻高速离心(10 000rpm，20min)，上清液即为胞内色素。取一定量的滤液用70％乙醇稀释适当倍数，以70％乙醇为参照，用分光光度计测定(红曲复合色素的吸收主峰在505nm)稀释液的吸收度值，计算其总色价。计算方法同上。
总色价为胞外红曲色素(水溶)色价与胞内红曲色素(醇溶)色价之和
红色红曲霉Amy9，在发酵第6天，总色价和醇溶色价分别为54.11U、50.77U。相比亲本红色红曲霉CICC41233，总色价和醇溶色价分别为34.60U，21.93U，分别提高了56.39％和132％，并且醇溶色价占总色价的比值分别由63.39％提高到93.83％(图4a)。
4.4生物量测定
将上述制备胞内红曲色素(醇溶)，离心得到的沉淀烘干至恒重(图4b)。
4.5定量分析发酵过程中基因表达情况
收集发酵菌体样品后，采用液氮研磨结合Trizol试剂盒提取总RNA。Nanodrop核酸定量分析仪检测RNA含量。取等量的RNA，反转录成cDNA，以稀释10倍的样品做模板，加入靶基因上下引物，在20μl体系中进行半定量PCR(图5a)，检测结果表明米曲霉AoamyA基因在工程菌株红色红曲霉Amy9中表达。
采用荧光定量PCR分析表明，相比亲本菌株红曲色素CICC41233，工程菌株红色红曲霉Amy9，红曲色素合成过程中的关键基因acl2(编码ATP-柠檬酸裂解酶)分别提高了1.43，1.57，和1.33倍在48h，72h和144h；pks(编码聚酮合成酶)分别提高了2.43，2.20，和2.40倍在48h，72h和144h；fasB(脂肪酸合成酶beta亚基)分别提高了1.39，1.80，和1.32倍在48h，72h和144(图5b、5c)。
实施例2
一种重组质粒，是由以下方法构建的：
1)取植物双元质粒pCambia0380，用限制性内切核酸酶Hind III与Bgl II酶切，而后将序列为SEQ ID No:1、SEQ ID No:2的一对寡核苷酸序列通过T4DNA连接酶与之连接，即得到双元质粒表达载体pCambia0380G；
2)以质粒pUR5750为模板，以序列为SEQ ID No:3、SEQ ID No:4的一对引物进行PCR扩增，得到gpdA启动子片段，用限制性内切核酸酶BamH I与Pst I同时酶切所述gpdA启动子片段和双元质粒表达载体pCambia0380G，而后通过T4DNA连接酶将二者连接，即得到双元质粒表达载体pCambia0380G-gpdA；
3)以质粒pMD19-TtrpC-PtrpC-Neo为模板，以序列为SEQ ID No:5、SEQ ID No:6的一对引物进行PCR扩增，得到终止子及Neo筛选标记片段，用限制性内切核酸酶Bgl II与SpeI同时酶切所述终止子及Neo筛选标记片段和双元质粒表达载体pCambia0380G-gpdA，而后通过T4DNA连接酶将二者连接，即得到双元质粒表达载体pNeo0380。
一种应用上述重组质粒构建红曲色素高产菌株的方法，包括以下步骤：
A)以米曲霉NRRL3488的cDNA为模板，以序列为SEQ ID No:7、SEQ ID No:8的一对引物进行PCR扩增得到α-淀粉酶A基因，用限制性内切核酸酶HindIII与SacI同时酶切所述α-淀粉酶A基因和双元质粒表达载体pNeo0380，而后通过T4DNA连接酶将二者连接，即得到双元质粒表达载体pNeo0380-amy；
B)用根癌农杆菌EHA105介导双元质粒表达载体pNeo0380-amy，转化至红色红曲霉菌株中，筛选阳性克隆，即得到所述红曲色素高产菌株。
在以上技术方案的基础上，满足以下条件：
步骤B)具体包括以下操作：先制备感受态的根癌农杆菌EHA105，再通过液氮冻融法将所述双元质粒表达载体pNeo0380-amy导入根癌农杆菌EHA105，而后将含有双元质粒表达载体pNeo0380-amy的根癌农杆菌EHA105转化至红色红曲霉菌株中，再筛选阳性克隆，即得到所述红曲色素高产菌株。
所述制备感受态的根癌农杆菌EHA105，包括以下步骤：将根癌农杆菌EHA105接种于5mL含有50μg/mL利福平的YEP液体培养基中，以温度28℃、搅拌转速200rpm的条件培养24h；取l mL活化的菌液接种于20mL含有50μg/mL利福平的YEP液体培养基中，以温度28℃、搅拌转速200rpm的条件培养至菌液OD600值0.5；将菌液冰浴30min后，在4℃条件下以5000rpm的转速离心5min，弃上清；用0.15mmol/L的氯化钠溶液l0mL重悬沉淀，在4℃条件下以5000rpm的转速离心5min，弃上清，而后悬浮于20mmol/L的氯化钙溶液1mL中。
所述通过液氮冻融法将所述双元质粒表达载体pNeo0380-amy导入根癌农杆菌EHA105，包括以下步骤：取1μg所述双元质粒表达载体pNeo0380-amy加入到200μL感受态的根癌农杆菌EHA105中，混合后冰浴30min；液氮中速冻1min，37℃水浴3min，再冰浴2min；加入800μL YEP液体培养基，28℃培养3h；常温下以5000rpm的转速离心3min，浓缩菌体；取200μL浓缩后的菌液涂布于含有50μg/mL利福平、50μg/mL卡那霉素的YEP选择性培养基平板上，28℃倒置培养2d；挑选转化子于YEP液体培养基中培养，并用引物对克隆子进行筛选，得到阳性克隆子，即为含有双元质粒表达载体pNeo0380-amy的根癌农杆菌EHA105。
所述将含有双元质粒表达载体pNeo0380-amy的根癌农杆菌EHA105转化至红色红曲霉菌株中，包括以下步骤：
取红色红曲霉菌株，用MPS固体培养基培养7d，获取分生孢子，用无菌水悬浮孢子，振荡分散孢子，经2层擦镜纸过滤，调节孢子浓度；
取含有双元质粒表达载体pNeo0380-amy的根癌农杆菌EHA105，接种于3mL含有50μg/mL利福平、50μg/mL卡那霉素的YEP培养基中，28℃培养48h，而后转接于5mL含有200μmol/L乙酰丁香酮的AIM诱导培养基中，使菌液稀释至OD600值为0.15，再继续培养5～6h，至OD600值为0.5；
将以上所得的红色红曲霉孢子液和含有双元质粒表达载体pNeo0380-amy的根癌农杆菌EHA105菌液，混合涂布于含200μmol/L乙酰丁香酮的AIM诱导培养基平板上，25℃，避光培养48h。
所述筛选阳性克隆，包括以下步骤：在避光培养48h后的AIM诱导培养基平板上再添加一层含80μg/mL G418、200μmol/L头孢噻肟、0.2％Triton X-100的PDA培养基，30℃继续培养5～8d；挑取单菌落转接至含80μg/mL G418的MPS固体培养基平板上，培养3d后将能够生长的菌株，接于MPS液体培养基中培养，按照SDS裂解法提取丝状真菌总DNA进行分子分析，用序列为SEQ ID No:7、SEQ ID No:8的一对引物进行PCR验证，选取阳性菌株。
一种应用以上所构建高产菌株发酵产红曲色素的方法，该方法中：
发酵培养基成分包括：9％(w/w)大米粉，0.2％(w/w)NaNO3，0.1％(w/w)KH2PO4，0.2％(w/w)MgSO4·7H2O，0.2％(w/w)乙酸；
发酵初始时，向培养基中接入所述高产菌株的孢子105个/mL；
发酵条件为：温度30℃，搅拌转速180rpm，发酵6天。
一种应用以上所构建高产菌株发酵产淀粉酶的方法，该方法中：
发酵培养基成分包括：9％(w/w)葡萄糖，0.2％(w/w)NaNO3，0.1％(w/w)KH2PO4，0.2％(w/w)MgSO4·7H2O，0.2％(w/w)乙酸；
发酵初始时，向培养基中接入所述高产菌株的孢子105个/mL；
发酵条件为：温度30℃，搅拌转速180rpm，发酵6天。
实施例3
一种重组质粒，是由以下方法构建的：
1)取植物双元质粒pCambia0380，用限制性内切核酸酶Hind III与Bgl II酶切，而后将序列为SEQ ID No:1、SEQ ID No:2的一对寡核苷酸序列通过T4DNA连接酶与之连接，即得到双元质粒表达载体pCambia0380G；
2)以质粒pUR5750为模板，以序列为SEQ ID No:3、SEQ ID No:4的一对引物进行PCR扩增，得到gpdA启动子片段，用限制性内切核酸酶BamH I与Pst I同时酶切所述gpdA启动子片段和双元质粒表达载体pCambia0380G，而后通过T4DNA连接酶将二者连接，即得到双元质粒表达载体pCambia0380G-gpdA；
3)以质粒pMD19-TtrpC-PtrpC-Neo为模板，以序列为SEQ ID No:5、SEQ ID No:6的一对引物进行PCR扩增，得到终止子及Neo筛选标记片段，用限制性内切核酸酶Bgl II与SpeI同时酶切所述终止子及Neo筛选标记片段和双元质粒表达载体pCambia0380G-gpdA，而后通过T4DNA连接酶将二者连接，即得到双元质粒表达载体pNeo0380。
一种应用上述重组质粒构建红曲色素高产菌株的方法，包括以下步骤：
A)以米曲霉NRRL3488的cDNA为模板，以序列为SEQ ID No:7、SEQ ID No:8的一对引物进行PCR扩增得到α-淀粉酶A基因，用限制性内切核酸酶HindIII与SacI同时酶切所述α-淀粉酶A基因和双元质粒表达载体pNeo0380，而后通过T4DNA连接酶将二者连接，即得到双元质粒表达载体pNeo0380-amy；
B)用根癌农杆菌EHA105介导双元质粒表达载体pNeo0380-amy，转化至红色红曲霉菌株中，筛选阳性克隆，即得到所述红曲色素高产菌株。
在以上技术方案的基础上，满足以下条件：
步骤B)具体包括以下操作：先制备感受态的根癌农杆菌EHA105，再通过液氮冻融法将所述双元质粒表达载体pNeo0380-amy导入根癌农杆菌EHA105，而后将含有双元质粒表达载体pNeo0380-amy的根癌农杆菌EHA105转化至红色红曲霉菌株中，再筛选阳性克隆，即得到所述红曲色素高产菌株。
所述制备感受态的根癌农杆菌EHA105，包括以下步骤：将根癌农杆菌EHA105接种于10mL含有50μg/mL利福平的YEP液体培养基中，以温度28℃、搅拌转速200rpm的条件培养24h；取l mL活化的菌液接种于20mL含有50μg/mL利福平的YEP液体培养基中，以温度28℃、搅拌转速200rpm的条件培养至菌液OD600值0.5；将菌液冰浴30min后，在4℃条件下以5000rpm的转速离心5min，弃上清；用0.15mmol/L的氯化钠溶液l0mL重悬沉淀，在4℃条件下以5000rpm的转速离心5min，弃上清，而后悬浮于20mmol/L的氯化钙溶液1mL中。
所述将含有双元质粒表达载体pNeo0380-amy的根癌农杆菌EHA105转化至红色红曲霉菌株中，包括以下步骤：
取红色红曲霉菌株，用MPS固体培养基培养7d，获取分生孢子，用无菌水悬浮孢子，振荡分散孢子，经2层擦镜纸过滤，调节孢子浓度；
取含有双元质粒表达载体pNeo0380-amy的根癌农杆菌EHA105，接种于3mL含有50μg/mL利福平、50μg/mL卡那霉素的YEP培养基中，28℃培养48h，而后转接于5mL含有200μmol/L乙酰丁香酮的AIM诱导培养基中，使菌液稀释至OD600值为0.15，再继续培养5～6h，至OD600值为0.6；
将以上所得的红色红曲霉孢子液和含有双元质粒表达载体pNeo0380-amy的根癌农杆菌EHA105菌液，混合涂布于含200μmol/L乙酰丁香酮的AIM诱导培养基平板上，25℃，避光培养48h。
实施例4
一种重组质粒，是由以下方法构建的：
1)取植物双元质粒pCambia0380，用限制性内切核酸酶Hind III与Bgl II酶切，而后将序列为SEQ ID No:1、SEQ ID No:2的一对寡核苷酸序列通过T4DNA连接酶与之连接，即得到双元质粒表达载体pCambia0380G；
2)以质粒pUR5750为模板，以序列为SEQ ID No:3、SEQ ID No:4的一对引物进行PCR扩增，得到gpdA启动子片段，用限制性内切核酸酶BamH I与Pst I同时酶切所述gpdA启动子片段和双元质粒表达载体pCambia0380G，而后通过T4DNA连接酶将二者连接，即得到双元质粒表达载体pCambia0380G-gpdA；
3)以质粒pMD19-TtrpC-PtrpC-Neo为模板，以序列为SEQ ID No:5、SEQ ID No:6的一对引物进行PCR扩增，得到终止子及Neo筛选标记片段，用限制性内切核酸酶Bgl II与SpeI同时酶切所述终止子及Neo筛选标记片段和双元质粒表达载体pCambia0380G-gpdA，而后通过T4DNA连接酶将二者连接，即得到双元质粒表达载体pNeo0380。
一种应用上述重组质粒构建红曲色素高产菌株的方法，包括以下步骤：
A)以米曲霉NRRL3488的cDNA为模板，以序列为SEQ ID No:7、SEQ ID No:8的一对引物进行PCR扩增得到α-淀粉酶A基因，用限制性内切核酸酶HindIII与SacI同时酶切所述α-淀粉酶A基因和双元质粒表达载体pNeo0380，而后通过T4DNA连接酶将二者连接，即得到双元质粒表达载体pNeo0380-amy；
B)先制备感受态的根癌农杆菌EHA105，再通过液氮冻融法将所述双元质粒表达载体pNeo0380-amy导入根癌农杆菌EHA105，而后将含有双元质粒表达载体pNeo0380-amy的根癌农杆菌EHA105转化至红色红曲霉菌株中，再筛选阳性克隆，即得到所述红曲色素高产菌株。
以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种重组质粒，其特征在于是由以下方法构建的：
1)取植物双元质粒pCambia0380，用限制性内切核酸酶Hind III与Bgl II酶切，而后将序列为SEQ ID No:1、SEQ ID No:2的一对寡核苷酸序列通过T4DNA连接酶与之连接，即得到双元质粒表达载体pCambia0380G；
2)以质粒pUR5750为模板，以序列为SEQ ID No:3、SEQ ID No:4的一对引物进行PCR扩增，得到gpdA启动子片段，用限制性内切核酸酶BamH I与Pst I同时酶切所述gpdA启动子片段和双元质粒表达载体pCambia0380G，而后通过T4DNA连接酶将二者连接，即得到双元质粒表达载体pCambia0380G-gpdA；
3)以质粒pMD19-TtrpC-PtrpC-Neo为模板，以序列为SEQ ID No:5、SEQ ID No:6的一对引物进行PCR扩增，得到终止子及Neo筛选标记片段，用限制性内切核酸酶Bgl II与Spe I同时酶切所述终止子及Neo筛选标记片段和双元质粒表达载体pCambia0380G-gpdA，而后通过T4DNA连接酶将二者连接，即得到双元质粒表达载体pNeo0380。
2.根据权利要求1所述的一种重组质粒，其特征在于步骤1)中所述的一对寡核苷酸序列依次含有以下限制性核酸内切酶位点：Hind III、Kpn I、Sac I、Pac I、Pme I、Xho I、XbaI、Bgl II。
3.应用权利要求1所述重组质粒构建红曲色素高产菌株的方法，其特征在于包括以下步骤：
A)以米曲霉NRRL3488的cDNA为模板，以序列为SEQ ID No:7、SEQ ID No:8的一对引物进行PCR扩增得到α-淀粉酶A基因，用限制性内切核酸酶HindIII与SacI同时酶切所述α-淀粉酶A基因和双元质粒表达载体pNeo0380，而后通过T4DNA连接酶将二者连接，即得到双元质粒表达载体pNeo0380-amy；
B)用根癌农杆菌EHA105介导双元质粒表达载体pNeo0380-amy，转化至红色红曲霉菌株中，筛选阳性克隆，即得到所述红曲色素高产菌株。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于步骤B)具体包括以下操作：先制备感受态的根癌农杆菌EHA105，再通过液氮冻融法将所述双元质粒表达载体pNeo0380-amy导入根癌农杆菌EHA105，而后将含有双元质粒表达载体pNeo0380-amy的根癌农杆菌EHA105转化至红色红曲霉菌株中，再筛选阳性克隆，即得到所述红曲色素高产菌株。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述制备感受态的根癌农杆菌EHA105，包括以下步骤：将根癌农杆菌EHA105接种于5～10mL含有50μg/mL利福平的YEP液体培养基中，以温度28℃、搅拌转速200rpm的条件培养24h；取l mL活化的菌液接种于20mL含有50μg/mL利福平的YEP液体培养基中，以温度28℃、搅拌转速200rpm的条件培养至菌液OD600值0.5；将菌液冰浴30min后，在4℃条件下以5000rpm的转速离心5min，弃上清；用0.15mmol/L的氯化钠溶液l0mL重悬沉淀，在4℃条件下以5000rpm的转速离心5min，弃上清，而后悬浮于20mmol/L的氯化钙溶液1mL中。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述通过液氮冻融法将所述双元质粒表达载体pNeo0380-amy导入根癌农杆菌EHA105，包括以下步骤：取1μg所述双元质粒表达载体pNeo0380-amy加入到200μL感受态的根癌农杆菌EHA105中，混合后冰浴30min；液氮中速冻1min，37℃水浴3min，再冰浴2min；加入800μL YEP液体培养基，28℃培养3h；常温下以5000rpm的转速离心3min，浓缩菌体；取200μL浓缩后的菌液涂布于含有50μg/mL利福平、50μg/mL卡那霉素的YEP选择性培养基平板上，28℃倒置培养2d；挑选转化子于YEP液体培养基中培养，并用引物对克隆子进行筛选，得到阳性克隆子，即为含有双元质粒表达载体pNeo0380-amy的根癌农杆菌EHA105。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述将含有双元质粒表达载体pNeo0380-amy的根癌农杆菌EHA105转化至红色红曲霉菌株中，包括以下步骤：
取红色红曲霉菌株，用MPS固体培养基培养7d，获取分生孢子，用无菌水悬浮孢子，振荡分散孢子，经2层擦镜纸过滤，调节孢子浓度；
取含有双元质粒表达载体pNeo0380-amy的根癌农杆菌EHA105，接种于3mL含有50μg/mL利福平、50μg/mL卡那霉素的YEP培养基中，28℃培养48h，而后转接于5mL含有200μmol/L乙酰丁香酮的AIM诱导培养基中，使菌液稀释至OD600值为0.15，再继续培养5～6h，至OD600值为0.5～0.6；
将以上所得的红色红曲霉孢子液和含有双元质粒表达载体pNeo0380-amy的根癌农杆菌EHA105菌液，混合涂布于含200μmol/L乙酰丁香酮的AIM诱导培养基平板上，25℃，避光培养48h。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述筛选阳性克隆，包括以下步骤：在避光培养48h后的AIM诱导培养基平板上再添加一层含80μg/mL G418、200μmol/L头孢噻肟、0.2％Triton X-100的PDA培养基，30℃继续培养5～8d；挑取单菌落转接至含80μg/mL G418的MPS固体培养基平板上，培养3d后将能够生长的菌株，接于MPS液体培养基中培养，按照SDS裂解法提取丝状真菌总DNA进行分子分析，用序列为SEQ ID No:7、SEQ ID No:8的一对引物进行PCR验证，选取阳性菌株。
9.应用权利要求3～7任一项所构建高产菌株发酵产红曲色素的方法，其特征在于该方法中：
发酵培养基成分包括：9％(w/w)大米粉，0.2％(w/w)NaNO3，0.1％(w/w)KH2PO4，0.2％(w/w)MgSO4·7H2O，0.2％(w/w)乙酸；
发酵初始时，向培养基中接入所述高产菌株的孢子105个/mL；
发酵条件为：温度30℃，搅拌转速180rpm，发酵6天。
10.应用权利要求3～7任一项所构建高产菌株发酵产淀粉酶的方法，其特征在于该方法中：
发酵培养基成分包括：9％(w/w)葡萄糖，0.2％(w/w)NaNO3，0.1％(w/w)KH2PO4，0.2％(w/w)MgSO4·7H2O，0.2％(w/w)乙酸；
发酵初始时，向培养基中接入所述高产菌株的孢子105个/mL；
发酵条件为：温度30℃，搅拌转速180rpm，发酵6天。
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