CN106635846B

CN106635846B - 一种高产果胶甲酯酶的黑曲霉菌株

Info

Publication number: CN106635846B
Application number: CN201611231344.9A
Authority: CN
Inventors: 徐晓东; 张珍珍; 徐娟; 刘文瑶
Original assignee: Qingdao Vland Biotech Group Co Ltd
Current assignee: Weifang KDN Biotechnology Co., Ltd.; Qingdao Vland Biotech Group Co Ltd
Priority date: 2016-12-28
Filing date: 2016-12-28
Publication date: 2019-11-08
Anticipated expiration: 2036-12-28
Also published as: CN106635846A

Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种高产果胶甲酯酶的黑曲霉菌株。所述黑曲霉菌株在20L罐发酵后上清液中果胶甲酯酶酶活高达421u/ml。所述黑曲霉重组菌株可广泛应用于果胶甲酯酶的生产，从而有利于降低果胶甲酯酶的生产成本，促进其在果汁加工领域中的推广与应用。

Description

一种高产果胶甲酯酶的黑曲霉菌株

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体内容涉及一种高产果胶甲酯酶的黑曲霉菌株及其应用。

技术背景

在现代工业中果胶是一种重要的物品，例如它可以在诸如果酱制品的视频工业中用作增稠剂或胶凝剂。在细胞壁的果胶降解过程中各种果胶酶都发挥了独特作用。其中果胶溶酶(PL)能够水解果胶产生水溶性果胶，切断聚甲氧基半乳糖醛酸和阿拉伯糖之间的化学键；多聚半乳糖醛酸酶(PG)能切断果胶酸的a-1, 4糖苷键形成游离的半乳糖醛酸；果胶甲酯酶(PME)的作用位点具体地说，是果胶分子的还原性末端或其邻近的游离羧基，对多聚半乳糖醛酸甲酯有高度的专一性，能水解水溶性果胶分子中甲氧基(-OCH₂)与半乳糖醛酸之间的酯键，沿着分子以单链机制进行，从而形成对二价阳离子异常敏感的果胶酸和甲醇，再经过PG作用形成游离的半乳糖醛酸。

果胶甲酯酶(Pectin methyl esterase, PME)是一种能催化、水解果胶生成果胶酸和甲醇的重要的果胶酶，普遍存在于高等植物的不同组织器官，如根、茎、叶、果实等。其对细胞壁组成和降解，细胞游离、花粉发育、种子萌发、根尖延伸、种子开裂、果实软化成熟、抗病等方面具有重要作用。目前在食品加工、茶饮料、造纸等生产工艺中已广泛利用果胶甲酯酶的活性来改善产品品质。

对果胶酯酶结构和基因方面的研究，目前研究的最多的是蕃茄和柑橘中的果胶酯酶。但也有不少学者将果胶酯酶从草莓、烟草以及一些真菌中得到克降与表达。随着基因工程技术的发展，从微生物中克隆果胶甲酯酶基因，构建高效表达体系，诱导果胶甲酯酶表达，这是获得大量果胶甲酯酶的新途径之一。例如，从菊欧文氏菌B374克隆果胶甲酯酶，在枯草芽孢杆菌中进行表达，可以获得没有外源污染的果胶甲酯酶。从米曲霉KBN616克隆果胶甲酯酶基因(pmeA)，在黑曲霉中进行超量表达，其果胶甲酯酶可用于降解大豆果胶，制备豆酱。

较于国外，国内对果胶甲酯酶基因工程的研究还比较缓慢，通过基因工程手段改造宿主细胞，提高果胶甲酯酶的表达量，以促进酶工业和食品工业的进一步发展是本发明的研究重点。

发明内容

本发明为解决现有技术问题，提供了一株高产果胶甲酯酶的黑曲霉菌株。申请人在出发菌黑曲霉Su（Aspergillus niger Su）中敲除了EG、PL、PG1和PG2四个基因，构建得到新的宿主菌黑曲霉Su4，并在黑曲霉Su4中过表达果胶甲酯酶，能大大提高果胶甲酯酶的产量，为该酶的广泛应用奠定了基础。

本发明一方面涉及一种新的宿主细胞黑曲霉Su4（Aspergillus niger Su4），其缺失了糖化酶、α淀粉酶、高峰淀粉酶、葡聚糖酶、果胶裂解酶、聚半乳糖醛酸酶1和聚半乳糖醛酸酶2七个基因。

所述糖化酶基因的编码核苷酸序列为SEQ ID NO:3；

所述α淀粉酶基因的编码核苷酸序列为SEQ ID NO:4；

所述高峰淀粉酶基因的编码核苷酸序列为SEQ ID NO:5；

所述葡聚糖酶基因的编码核苷酸序列为SEQ ID NO:6；

所述果胶裂解酶基因的编码核苷酸序列为SEQ ID NO:7；

所述聚半乳糖醛酸酶1基因的编码核苷酸序列为SEQ ID NO:8；

所述聚半乳糖醛酸酶2基因的编码核苷酸序列为SEQ ID NO:9。

本发明另一方面涉及一种重组菌株，是将携带有果胶甲酯酶基因的表达载体转化入上述宿主细胞获得的。

所述果胶甲酯酶的氨基酸序列为SEQ ID NO：1，其编码核苷酸序列为SEQ ID NO：2。

所述重组菌株命名为黑曲霉Su4-PME（Aspergillus niger Su4-PME），已于2016年12月22日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2016778。

所述重组菌株在果胶甲酯酶生产中的应用。

本发明构建的以黑曲霉Su为宿主细胞构建得到的重组表达果胶甲酯酶PME的工程菌株黑曲霉Su-PME，其摇瓶发酵上清液中果胶甲酯酶活力为33u/ml，20L罐发酵上清液中果胶甲酯酶活力为256u/ml；以黑曲霉Su4为宿主细胞构建得到的重组表达果胶甲酯酶PME的工程菌株黑曲霉Su4-PME，其发酵上清液中果胶甲酯酶活力高达58u/ml，比黑曲霉Su-PME提高了75.8%，20L罐发酵上清液中果胶甲酯酶酶活高达421u/ml，比黑曲霉Su-PME提高了64.5%。从而说明本发明通过敲除宿主菌黑曲霉Su中的EG、PL、PG1和PG2四个基因，能显著提高果胶甲酯酶基因的表达效率，使果胶甲酯酶的表达量提高60%以上，取得了意料不到的技术效果。所述黑曲霉重组菌株可广泛应用于果胶甲酯酶的生产，从而有利于降低果胶甲酯酶的生产成本，促进其在果汁加工领域中的推广与应用。

附图说明

图1为质粒pGAU图谱；

图2为黑曲霉菌株发酵液SDS-PAGE蛋白电泳图：其中：M为蛋白分子量Marker，泳道1、2分别为黑曲霉Su-PME、Su4-PME发酵上清液；

图3为黑曲霉菌株Su-PME、Su4-PME 20L罐发酵曲线。

具体实施方式

本发明用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 3nd Ed. (Sambrook, 2001)和CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (Ausubel, 2003)中所记载的方法。这些一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是，本领域的技术人员可以在本发明所记载的技术方案的基础上，采用本领域其它常规的方法、实验方案和试剂，而不限于本发明具体实施例的限定。

本发明实施例中所选用的宿主细胞黑曲霉Su（Aspergillus niger Su），是发明人徐晓东于2015年3月在野生型黑曲霉的基础上敲除了糖化酶（glucoamylase）、α淀粉酶（α-amylase）、高峰淀粉酶（TAKA-amylase）3个基因得到的菌株，所述三个基因的编码核苷酸序列分别为SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:5。

下面结合具体实施方式对本发明进行详细描述。

实施例1 葡聚糖酶（endoglucanase，简称EG）基因敲除

以黑曲霉Su（Aspergillus niger Su）基因组为模板，利用引物EGU-F、EGU-R扩增葡聚糖酶基因上游序列，利用引物EGD-F、EGD-R扩增葡聚糖酶基因下游序列。葡聚糖酶基因的编码核苷酸序列为SEQ ID NO:6。

PCR引物和反应条件如下：

引物EGU-F：TCAAAATCTCGGAAGGAC

引物EGU-R：GGACGAAGTAAGCCAACTA

引物EGD-F：TTAAATTCCGAGCCAGTC

引物EGD-R：AACAAGAAATACGCACCC

扩增条件为：94℃变性5min；然后94℃变性30s，56℃复性30s，72℃延伸90s，30个循环后，72℃保温10min。琼脂糖电泳结果显示，上游序列EGU大小为1434bp，下游序列EGD大小为1506bp。

将上述获得的上下游序列EGU、EGD片段分别通过KpnI、SphI与敲除载体pMD18T-pyrE连接，构建敲除载体pQC-EG，其中上下游序列EGU、EGD分别位于筛选标记pyrE两侧。

原生质体制备：接种宿主菌黑曲霉Su于PDA+U（马铃薯200g/L，煮沸20-30min后过滤除渣；葡萄糖2%；Uridine 1%；琼脂粉1.5%）平板，30℃培养5-7d；割取2cm×2cm大小的菌块，接种100ml液体PDA+U（马铃薯200g/L，煮沸20-30min后过滤除渣；葡萄糖2%；Uridine1%）培养基中，30℃培养24h生长菌丝体用于转化；将长好的菌丝体过滤后，用20ml 1.2M硫酸镁溶液重悬；加入0.2g溶菌酶，30℃、100rpm培养2-3h；将裂解好的菌丝用2层擦镜纸过滤，3000rpm离心10min获得原生质体；将裂解好的菌丝用擦镜纸过滤，离心获得原生质体；再用适量的山梨醇溶液重悬。

转化：将上述获得的黑曲霉原生质体用1.2M山梨醇溶液清洗2遍，再用适量的山梨醇溶液重悬，使原生质体浓度达到10⁸个/ ml；每200ul原生质体中加入10ul准备好的敲除载体pQC-EG，加入50ul 25%的PEG6000，冰浴20min，再加入2ml 25%的PEG6000，室温放置5min；加入4ml 山梨醇溶液颠倒混匀，倒入50ml转化上层培养基后，倾倒入4个转化下层平板中，待上层培养基凝固后，于30℃培养箱中倒置培养5d。

转化子筛选：培养5d后，挑取长出的菌落，点种到转化下层平板进行复筛，30℃培养2d。扣取少量菌丝体，提取基因组，通过引物EGYZ-F1、EGYZ-R1、EGYZ-F2、EGYZ-R2进行PCR验证。引物EGYZ-F1、EGYZ-R1为葡聚糖酶基因内部引物，如果葡聚糖酶基因被敲除掉则PCR扩增无条带，如果基因未被敲除掉则PCR扩增出大小为441bp的条带；引物EGYZ-F2、EGYZ-R2为上下游两端的验证引物，如果基因被敲除掉则PCR扩增出大小为2421bp的条带，如果基因未被敲除掉则PCR扩增出大小为1311bp的条带。

引物EGYZ-F1：GAGGGAACAGTGAAAAGC

引物EGYZ-R1：CTGGGTGAGATAGTTGAAGA

引物EGYZ-F2：ATGGCGCAACCTGCTATAGC

引物EGYZ-R2：GGATTACCTTTCAAGGAAAG

通过上述PCR验证，申请人筛选到葡聚糖酶（EG）基因被敲除的黑曲霉菌株，并将其命名为黑曲霉Su1（Aspergillus niger Su1）。

实施例2黑曲霉Su1尿嘧啶营养缺陷型筛选

2.1原理：

5-氟乳清酸可以诱导菌体缺失尿嘧啶核苷酸合成途径中的乳清核苷酸转移酶或乳清苷单磷酸脱羧酶，从而使5-氟乳清酸无法形成有毒的物质 5-氟尿嘧啶核苷酸，从而产生了对5-氟乳清酸的抗性，其嘧啶核苷酸营养可以通过向培养基中添加尿嘧啶进行补充，因此利用5-氟乳清酸诱导形成的尿嘧啶营养缺陷型菌株可以在含有5-氟乳清酸和尿嘧啶的培养基中生长；而野生型菌株因不具备对5-氟乳清酸的抗性，无法在含有5-氟乳清酸的培养条件下生长。因此常用5-氟乳清酸来筛选尿嘧啶缺陷型的突变株。

筛选方法

分别将实施例1筛选到的黑曲霉Su1的孢子用浓度为0.1%的吐温-20溶液稀释至约1×10⁷个/mL；然后将孢子悬液均匀涂布于含有1.5g/mL 5-氟乳清酸和1.87g/mL尿嘧啶核苷（Uridine）的基本固体培养基（2%葡萄糖，0.5%(NH₄)₂SO₄, 1.5%KH₂PO₄, 0.06%MgSO₄,0.06%CaCl₂，1.5%琼脂）平板上，避光30℃培养7d以上。结果显示，平板上都有一定数量的菌落长出，说明这些菌落有可能是黑曲霉Su1的尿嘧啶缺陷型菌株。

分别挑取平板上长出的菌落，将每个菌落分别涂布于基本培养基平板和含有1.87g/mL Uridine的基本培养基平板进行验证。真正的尿嘧啶缺陷型菌株只能在含有Uridine的基本培养基平板上生长，而在缺少Uridine的基本培养基平板上无法生长。最终，申请人筛选到1株生长状态相对最好的尿嘧啶缺陷型菌株，命名为黑曲霉Su1-1（Aspergillus niger Su1-1）。

实施例3 果胶裂解酶（pectate lyase，简称PL）基因敲除

以尿嘧啶缺陷型菌株黑曲霉Su1-1（Aspergillus niger Su1-1）基因组为模板，利用引物PLU-F、PLU-R扩增果胶裂解酶基因上游序列，利用引物PLD-F、PLD-R扩增果胶裂解酶基因下游序列。果胶裂解酶基因的编码核苷酸序列为SEQ ID NO:7。

PCR引物和反应条件如下：

引物PLU-F：ATGATTGCTCCCACCCTC

引物PLU-R：AACCGTTGATTCTTCTCG

引物PLD-F：GGATGTAATCAGGGGACG

引物PLD-R：GGATAAGGCGTAGGCACT

反应条件为：94℃变性5min；然后94℃变性30s，56℃复性30s，72℃延伸90s，30个循环后，72℃保温10min。琼脂糖电泳结果显示，上游序列PLU大小为1568bp，下游序列PLD大小为1457bp。

将上述获得的上下游序列PLU、PLD片段分别通过KpnI、SphI与敲除载体pMD18T-pyrE连接，构建敲除载体pQC-PL，其中上下游序列PLU、PLD分别位于筛选标记pyrE两侧。

原生质体制备：接种黑曲霉Su1-1（Aspergillus niger Su1-1）于PDA+U（马铃薯200g/L，煮沸20-30min后过滤除渣；葡萄糖2%；Uridine 1%；琼脂粉1.5%）平板，30℃培养5-7d；割取2cm×2cm大小的菌块，接种100ml液体PDA+U（马铃薯200g/L，煮沸20-30min后过滤除渣；葡萄糖2%；Uridine 1%）培养基中，30℃培养24h生长菌丝体用于转化；将长好的菌丝体过滤后，用20ml 1.2M硫酸镁溶液重悬；加入0.2g溶菌酶，30℃、100rpm培养2-3h；将裂解好的菌丝用2层擦镜纸过滤，3000rpm离心10min获得原生质体；将裂解好的菌丝用擦镜纸过滤，离心获得原生质体；再用适量的山梨醇溶液重悬。

转化：将上述获得的黑曲霉原生质体用1.2M山梨醇溶液清洗2遍，再用适量的山梨醇溶液重悬，使原生质体浓度达到10⁸个/ ml；每200ul原生质体中加入10ul准备好的敲除载体pQC-PL，加入50ul 25%的PEG6000，冰浴20min，再加入2ml 25%的PEG6000，室温放置5min；加入4ml 山梨醇溶液颠倒混匀，倒入50ml转化上层培养基后，倾倒入4个转化下层平板中，待上层培养基凝固后，于30℃培养箱中倒置培养5d。

转化子筛选：培养5d后，挑取长出的菌落，点种到转化下层平板进行复筛，30℃培养2d。扣取少量菌丝体，提取基因组，通过引物PLYZ-F1、PLYZ-R1、PLYZ-F2、PLYZ-R2进行PCR验证。引物PLYZ-F1、PLYZ-R1为果胶裂解酶基因内部引物，如果果胶裂解酶基因被敲除掉则PCR扩增无条带，如果基因未被敲除掉则PCR扩增出大小为423bp的条带；引物PLYZ-F2、PLYZ-R2为上下游两端的验证引物，如果基因被敲除掉则PCR扩增出大小为2421bp的条带，如果基因未被敲除掉则PCR扩增出大小为1746bp的条带。

引物PLYZ-F1：CGTCTACCCCGACACTAT

引物PLYZ-R1：AATGACACCGAGTATAACCTA

引物PLYZ-F2：ATGGCGCAACCTGCTATAGC

引物PLYZ-R2：GGATTACCTTTCAAGGAAAG

通过上述PCR验证，申请人筛选到果胶裂解酶（PL）基因被敲除的黑曲霉菌株，并将其命名为黑曲霉Su2（Aspergillus niger Su2）。

实施例4 聚半乳糖醛酸酶1（polygalacturonase，简称PG1）基因敲除

采用实施例2所述方法将黑曲霉Su2菌株通过5-氟乳清酸筛选，获得尿嘧啶缺陷型菌株，命名为黑曲霉Su2-2（Aspergillus niger Su2-2）。

以尿嘧啶缺陷型菌株黑曲霉Su2-2基因组为模板，利用引物PG1U-F、PG1U-R扩增聚半乳糖醛酸酶1基因上游序列，利用引物PG1D-F、PG1D-R扩增聚半乳糖醛酸酶1基因下游序列。聚半乳糖醛酸酶1基因的编码核苷酸序列为SEQ ID NO:8。

PCR引物和反应条件如下：

引物PG1U-F：AGTCGTGACATTAGGTGGGT

引物PG1U-R：TTCTTGGCTGGCAGTAGG

引物PG1D-F：ACATAGGACGATGCTGG

引物PG1D-R：GTTCTGGCGTGGTGAC

反应条件为：94℃变性5min；然后94℃变性30s，56℃复性30s，72℃延伸90s，30个循环后，72℃保温10min。琼脂糖电泳结果显示，上游序列PG1U大小为1696bp，下游序列PG1D大小为1495bp。

将上述获得的上下游序列PG1U、PG1D片段分别通过KpnI、SphI与敲除载体pMD18T-pyrE连接，构建敲除载体pQC-PG1，其中上下游序列PG1U、PG1D分别位于筛选标记pyrE两侧。

原生质体制备：接种黑曲霉Su2-2于PDA+U（马铃薯200g/L，煮沸20-30min后过滤除渣；葡萄糖2%；Uridine 1%；琼脂粉1.5%）平板，30℃培养5-7d；割取2cm×2cm大小的菌块，接种100ml液体PDA+U（马铃薯200g/L，煮沸20-30min后过滤除渣；葡萄糖2%；Uridine 1%）培养基中，30℃培养24h生长菌丝体用于转化；将长好的菌丝体过滤后，用20ml 1.2M硫酸镁溶液重悬；加入0.2g溶菌酶，30℃、100rpm培养2-3h；将裂解好的菌丝用2层擦镜纸过滤，3000rpm离心10min获得原生质体；将裂解好的菌丝用擦镜纸过滤，离心获得原生质体；再用适量的山梨醇溶液重悬。

转化：将上述获得的黑曲霉原生质体用1.2M山梨醇溶液清洗2遍，再用适量的山梨醇溶液重悬，使原生质体浓度达到10⁸个/ ml；每200ul原生质体中加入10ul准备好的敲除载体pQC-PG1，加入50ul 25%的PEG6000，冰浴20min，再加入2ml 25%的PEG6000，室温放置5min；加入4ml 山梨醇溶液颠倒混匀，倒入50ml转化上层培养基后，倾倒入4个转化下层平板中，待上层培养基凝固后，于30℃培养箱中倒置培养5d。

转化子筛选：培养5d后，挑取长出的菌落，点种到转化下层平板进行复筛，30℃培养2d。扣取少量菌丝体，提取基因组，通过引物PG1YZ-F1、PG1YZ-R1、PG1YZ-F2、PG1YZ-R2进行PCR验证。引物PG1YZ-F1、PG1YZ-R1为聚半乳糖醛酸酶1基因内部引物，如果基因被敲除掉则PCR扩增无条带，如果基因未被敲除掉则PCR扩增出大小为459bp的条带；引物PG1YZ-F2、PG1YZ-R2为上下游两端的验证引物，如果基因被敲除掉则PCR扩增出大小为2421bp的条带，如果基因未被敲除掉则PCR扩增出大小为1492bp的条带。

引物PG1YZ-F1：ATCCTAACGCTCTGG

引物PG1YZ-R1：GAACTTGGGCTTCGTC

引物PG1YZ-F2：CAAGGAGTATAAAATGAGCA

引物PG1YZ-R2：TTTATGTTTGCAGCTCAAGT

通过上述PCR验证，申请人筛选到聚半乳糖醛酸酶1基因被敲除的黑曲霉菌株，并将其命名为黑曲霉Su3（Aspergillus niger Su3）。

实施例5 聚半乳糖醛酸酶2（polygalacturonase，简称PG2）基因敲除

采用实施例2所述方法将黑曲霉Su3通过5-氟乳清酸筛选，获得尿嘧啶缺陷型菌株，命名为黑曲霉Su3-3（Aspergillus niger Su3-3）。

以尿嘧啶缺陷型菌株黑曲霉Su3-3基因组为模板，利用引物PG2U-F、PG2U-R扩增聚半乳糖醛酸酶2基因上游序列，利用引物PG2D-F、PG2D-R扩增聚半乳糖醛酸酶2基因下游序列。聚半乳糖醛酸酶2基因的编码核苷酸序列为SEQ ID NO:9。

PCR引物和反应条件如下：

引物PG2U-F：GTTCCCCAGCAACTCA

引物PG2U-R：GGATAGAGCATCTCAACG

引物PG2D-F：ACTGCCATAGTGTTAGTGAA

引物PG2D-R：GCGGCGACAAATAGAC

反应条件为：94℃变性5min；然后94℃变性30s，56℃复性30s，72℃延伸90s，30个循环后，72℃保温10min。琼脂糖电泳结果显示，上游序列PG2U大小为1434bp，下游序列PG2D大小为1691bp。

将上述获得的上下游序列PG2U、PG2D片段分别通过KpnI、SphI与敲除载体pMD18T-pyrE连接，构建敲除载体pQC-PG2，其中上下游序列PG2U、PG2D分别位于筛选标记pyrE两侧。

原生质体制备：接种黑曲霉Su3-3于PDA+U（马铃薯200g/L，煮沸20-30min后过滤除渣；葡萄糖2%；Uridine 1%；琼脂粉1.5%）平板，30℃培养5-7d；割取2cm×2cm大小的菌块，接种100ml液体PDA+U（马铃薯200g/L，煮沸20-30min后过滤除渣；葡萄糖2%；Uridine 1%）培养基中，30℃培养24h生长菌丝体用于转化；将长好的菌丝体过滤后，用20ml 1.2M硫酸镁溶液重悬；加入0.2g溶菌酶，30℃、100rpm培养2-3h；将裂解好的菌丝用2层擦镜纸过滤，3000rpm离心10min获得原生质体；将裂解好的菌丝用擦镜纸过滤，离心获得原生质体；再用适量的山梨醇溶液重悬。

转化：将上述获得的黑曲霉原生质体用1.2M山梨醇溶液清洗2遍，再用适量的山梨醇溶液重悬，使原生质体浓度达到10⁸个/ ml；每200ul原生质体中加入10ul准备好的敲除载体pQC-PG2，加入50ul 25%的PEG6000，冰浴20min，再加入2ml 25%的PEG6000，室温放置5min；加入4ml 山梨醇溶液颠倒混匀，倒入50ml转化上层培养基后，倾倒入4个转化下层平板中，待上层培养基凝固后，于30℃培养箱中倒置培养5d。

转化子筛选：培养5d后，挑取长出的菌落，点种到转化下层平板进行复筛，30℃培养2d。扣取少量菌丝体，提取基因组，通过引物PG2YZ-F1、PG2YZ-R1、PG2YZ-F2、PG2YZ-R2进行PCR验证。引物PG2YZ-F1、PG2YZ-R1为聚半乳糖醛酸酶2基因内部引物，如果基因被敲除掉则PCR扩增无条带，如果基因未被敲除掉则PCR扩增出大小为402bp的条带；引物PG2YZ-F2、PG2YZ-R2为上下游两端的验证引物，如果基因被敲除掉则PCR扩增出大小为2421bp的条带，如果基因未被敲除掉则PCR扩增出大小为1502bp的条带。

引物PG2YZ-F1：CTGTCGGCTCCCTCGTCT

引物PG2YZ-R1：CCGTTGGTGCCCTTGC

引物PG2YZ-F2：AAACTCTCCAGGACTTCCGT

引物PG2YZ-R2：TATCGAGCAAAGCTCCATTA

通过上述PCR验证，申请人筛选到聚半乳糖醛酸酶2基因被敲除的黑曲霉菌株，并将其命名为黑曲霉Su4（Aspergillus niger Su4）。

实施例6 果胶甲酯酶（Pectin methyl esterase，简称PME）基因的克隆

以黑曲霉Su基因组为模板，利用引物1和引物2扩增出果胶甲酯酶基因片段，其核苷酸序列为SEQ ID NO：2，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO：1。

PCR引物和反应条件如下：

引物1（F）：ATGGTTAAGTCAATTCTT

引物2（R）：TTAGTTGATGTAGCTAGT

反应条件为：94℃变性5min；然后94℃变性30s，56℃复性30s，72℃延伸70s，30个循环后，72℃保温10min。琼脂糖电泳结果显示，扩增得到的PME基因大小为1322bp。

实施例7 重组载体的构建

PCR扩增上述果胶甲酯酶基因，引物两端引入XbaI位点。引物序列如下：

引物3（F）：GCTCTAGA ATGGTTAAGTCAATTCTT

引物4（R）：GCTCTAGA TTAGTTGATGTAGCTAGT

PCR反应条件为：94℃变性5min；然后94℃变性30s，56℃复性30s，72℃延伸70s，30个循环后，72℃保温10min。琼脂糖凝胶电泳结果显示，PME基因为大小1322bp的片段。

将上述获得的果胶甲酯酶PME基因片段与表达载体pGAU分别进行限制性内切酶XbaI单酶切，酶切条件如下：

PCR片段酶切体系（50ul）	质粒pGAU酶切体系（50ul）
		PCR片段20ul	pGAU质粒 20ul
10*M 5ul	10*M 5ul
		BSA 5ul	BSA 5ul
XbaI 2ul	XbaI 2ul
		ddH<sub>2</sub>O 18ul	ddH<sub>2</sub>O 18ul

37℃水浴酶切处理2h，电泳后分别回收两个目的片段，溶于20 ul ddH₂O。用T4DNA连接酶进行连接，连接体系如下：

PCR片段	2ul
		pGAU	2ul
10*Buffer	1ul
		T4 DNA ligase	1ul
ddH<sub>2</sub>O	4ul
		总体积	10ul

22℃连接1h，转化大肠杆菌DH5a感受态，涂布LB+AMP平板，37℃培养过夜后长出单菌落，菌落PCR验证连接正确的转化子提取质粒送测序，测序正确后，即得到含有果胶甲酯酶PME的重组载体pGAU-PME。

实施例8 果胶甲酯酶PME的重组表达

1、原生质体制备：

分别接种宿主菌黑曲霉Su和在黑曲霉Su基础上敲除EG、PL、PG1和PG2四个基因获得的黑曲霉Su4于PDA+U（马铃薯200g/L，煮沸20-30min后过滤除渣；葡萄糖2%；Uridine 1%；琼脂粉1.5%）平板，30℃培养5-7d；割取2cm×2cm大小的菌块，接种100ml液体PDA+U（马铃薯200g/L，煮沸20-30min后过滤除渣；葡萄糖2%；Uridine 1%）培养基中，30℃培养24h生长菌丝体用于转化；将长好的菌丝体过滤后，用20ml 1.2M硫酸镁溶液重悬；加入0.2g溶菌酶，30℃、100rpm培养2-3h；将裂解好的菌丝用2层擦镜纸过滤，3000rpm离心10min获得原生质体；将裂解好的菌丝用擦镜纸过滤，离心获得原生质体；再用适量的山梨醇溶液重悬。

、转化：

将上述获得的黑曲霉Su和Su4原生质体用1.2M山梨醇溶液清洗2遍，再用适量的山梨醇溶液重悬，使原生质体浓度达到10⁸个/ ml；每200ul原生质体中分别加入10ul准备好的重组载体pGAU-PME，加入50ul 25%的PEG6000，冰浴20min，再加入2ml 25%的PEG6000，室温放置5min；加入4ml 山梨醇溶液颠倒混匀，倒入50ml转化上层培养基后，倾倒入4个转化下层平板中，待上层培养基凝固后，于30℃培养箱中倒置培养5d。

、转化子筛选：

培养5d后，挑取长出的菌落，点种到转化下层平板进行复筛，30℃培养2d。将正常生长的转化子分别接种到新鲜的PDA平板，30℃培养5-7d。每个转化子割取2cm×2cm大小的菌块，分别接种50ml液体摇瓶培养基（麦芽糖12%；豆饼粉0.85%；玉米浆1%；硫酸铵0.5%；磷酸二氢钾0.35%；磷酸氢二钾0.75%；七水硫酸镁0.03%）中发酵，32℃培养5d，每天加入适量氨水，控制pH在4.5左右。培养5d后，离心菌体获得上清液即为粗酶液，进行SDS-PAGE蛋白电泳检测。结果如图2所示，箭头所指处的蛋白条带即为重组表达的果胶甲酯酶。

分别检测各阳性转化子发酵上清液中果胶甲酯酶酶活力，筛选出酶活最高的阳性转化子，分别命名为黑曲霉Su-PME（Aspergillus niger Su-PME）和黑曲霉Su4-PME（Aspergillus niger Su4-PME）。

（1）果胶甲酯酶酶活单位的定义

在30℃、pH值为4.8的条件下，每分钟使甲酯化果胶去甲基而产生1μmol果胶酸的酶量，定义为一个酶活力单位U。

（2）酶活测定方法

0.25%果胶底物：秤取柑橘类果胶（DE>69%，GA>65%或等同）2.50g，将约800ml的水加热到约40℃，强烈搅拌下缓慢加入秤取的柑橘类果胶溶解。将悬浊液加热到60℃，搅拌直到果胶全部溶解，保持搅拌直至溶液冷却到室温。然后用10%盐酸调节pH到4.8.将溶液转移到1000ml的容量瓶中定容备用。

酶液：用缓冲液稀释至适当倍数，控制酶活约为10~20U/ml，每分钟滴定滴定液体积为0.1-0.4ml。

（1）按照去离子水、滴定液的顺序冲洗全自动滴定仪的所有管路，校正pH电极；

校正pH电极的方法：在电位滴定仪上按下“标定”键，首先将温度电极和pH电极同时放置于pH4.0的校正液中，待数值显示稳定后按“F2”键，仪器显示“两点标定吗”，按“F2”键，仪器进入二点标定，两支电极取出并用去离子水冲洗干净，然后放置于pH6.8的校正液中，待数值显示稳定后按“F2”键，仪器显示标定结束及斜率E₀值，再按确认键结束标定。此时将两支电极放入pH6.86的校正液中，读数须在6.86±0.04范围内，如果超出此范围，需要重新标定。

（2）在滴定皿中加入50ml、30℃预热的果胶溶液及一支小转子，并在水浴锅中预热3min；

（3）将滴定皿放置在滴定仪相应位置，并将pH电极、温度电极放置于溶液中，按“搅拌”键，待显示温度30℃稳定后，用10%盐酸或10%氢氧化钠调节pH至4.8，此时按“F3”键；

（4）设定滴定程序：选择预设终点滴定，设置滴定终点（pH4.8）和延时时间（500s），按“开始”键；

（5）待pH稳定在4.8时，加入100ul稀释至适当倍数的酶液，并同时按下计时器，记录时间为0、1、2、3min时的滴定体积。

酶活计算公式：

X=(V×N×1.05×D×1000)/(W×t)

式中：

X——样品的酶活力，单位为U/ml；

V——数据记录时间1-3min之间加入滴定液的体积，ml；

N——滴定液的浓度，mol/L；

1000——mol/L到μmol/L的单位转换因子；

1.05——修正因子；

D——稀释倍数；

t——反应时间，2min；

W——样品的体积ml；

4、酶活结果分析

酶活检测结果显示，以黑曲霉Su为宿主细胞构建得到的重组表达果胶甲酯酶PME的工程菌株黑曲霉Su-PME，其发酵上清液中果胶甲酯酶活力为33u/ml，而以黑曲霉Su4为宿主细胞构建得到的重组表达果胶甲酯酶PME的工程菌株黑曲霉Su4-PME，其发酵上清液中果胶甲酯酶活力高达58u/ml，提高了75.8%。

进一步将黑曲霉Su-PME（Aspergillus niger Su-PME）和黑曲霉Su4-PME（Aspergillus niger Su4-PME）分别进行20L罐发酵，发酵曲线如图3所示，发酵180h后，黑曲霉Su-PME发酵上清液中果胶甲酯酶酶活达到256u/ml，而黑曲霉Su4-PME发酵上清液中果胶甲酯酶酶活高达421u/ml，提高了64.5%。

上述结果表明，本发明通过敲除宿主菌黑曲霉Su中的EG、PL、PG1和PG2四个基因，能显著提高果胶甲酯酶基因的表达效率，使果胶甲酯酶的表达量提高60%以上，取得了意料不到的技术效果。

申请人已于2016年12月22日将黑曲霉Su4-PME（Aspergillus niger Su4-PME）保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2016778。

黑曲霉Su4-PME可广泛应用于果胶甲酯酶的生产，从而有利于降低果胶甲酯酶的生产成本，促进其在果汁加工领域中的推广与应用。

SEQUENCE LISTING

<110> 青岛蔚蓝生物集团有限公司

<120> 一种高产果胶甲酯酶的黑曲霉菌株

<130>

<160> 9

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 331

<212> PRT

<213> 1

<400> 1

Met Val Lys Ser Ile Leu Ala Ser Val Leu Phe Ala Ala Thr Ala Leu

1 5 10 15

Ala Ala Ser Arg Met Thr Ala Pro Ser Gly Ala Ile Val Val Ala Lys

20 25 30

Ser Gly Gly Asp Tyr Asp Thr Ile Ser Ala Ala Val Asp Ala Leu Ser

35 40 45

Thr Thr Ser Thr Glu Thr Gln Thr Ile Phe Ile Glu Glu Gly Ser Tyr

50 55 60

Asp Glu Gln Val Tyr Ile Pro Ala Leu Ser Gly Lys Leu Ile Val Tyr

65 70 75 80

Gly Gln Thr Glu Asp Thr Thr Thr Tyr Thr Ser Asn Leu Val Asn Ile

85 90 95

Thr His Ala Ile Ala Leu Ala Asp Val Asp Asn Asp Asp Glu Thr Ala

100 105 110

Thr Leu Arg Asn Tyr Ala Glu Gly Ser Ala Ile Tyr Asn Leu Asn Ile

115 120 125

Ala Asn Thr Cys Gly Gln Ala Cys His Gln Ala Leu Ala Val Ser Ala

130 135 140

Tyr Ala Ser Glu Gln Gly Tyr Tyr Ala Cys Gln Phe Thr Gly Tyr Gln

145 150 155 160

Asp Thr Leu Leu Ala Glu Thr Gly Tyr Gln Val Tyr Ala Gly Thr Tyr

165 170 175

Ile Glu Gly Ala Val Asp Phe Ile Phe Gly Gln His Ala Arg Ala Trp

180 185 190

Phe His Glu Cys Asp Ile Arg Val Leu Glu Gly Pro Ser Ser Ala Ser

195 200 205

Ile Thr Ala Asn Gly Arg Ser Ser Glu Ser Asp Asp Ser Tyr Tyr Val

210 215 220

Ile His Lys Ser Thr Val Ala Ala Ala Asp Gly Asn Asp Val Ser Ser

225 230 235 240

Gly Thr Tyr Tyr Leu Gly Arg Pro Trp Ser Gln Tyr Ala Arg Val Cys

245 250 255

Phe Gln Lys Thr Ser Met Thr Asp Val Ile Asn His Leu Gly Trp Thr

260 265 270

Glu Trp Ser Thr Ser Thr Pro Asn Thr Glu Asn Val Thr Phe Val Glu

275 280 285

Tyr Gly Asn Thr Gly Thr Gly Ala Lys Gly Pro Arg Ala Asn Phe Ser

290 295 300

Ser Glu Leu Thr Glu Pro Ile Thr Ile Ser Trp Leu Leu Gly Ser Asp

305 310 315 320

Trp Glu Asp Trp Val Asp Thr Ser Tyr Ile Asn

325 330

<210> 2

<211> 996

<212> DNA

<213> 2

<400> 2

atggttaagt caattcttgc atccgttctc tttgcagcga ccgcgctggc cgcgagccgc 60

atgacggctc cttccggtgc gattgtcgtt gccaagtccg gaggtgacta cgacacgatc 120

agcgctgccg ttgatgctct gagcactact tcgaccgaga cccagaccat cttcattgag 180

gagggatcct acgacgagca ggtgtacatt cctgctctca gtggaaagct gattgtctac 240

ggtcagactg aggacaccac tacctacact agcaacctgg tcaacatcac ccatgccatc 300

gcgttggccg atgtcgacaa tgacgatgag actgcaaccc ttcgtaacta cgctgagggc 360

tcggccatct acaaccttaa cattgccaac acctgcggtc aggcctgcca ccaggctctc 420

gccgtgagcg cctatgccag cgagcaggga tactacgcct gccagttcac cggataccag 480

gacacccttc tggccgagac cggctaccag gtttacgccg gaacctacat cgagggtgcc 540

gttgacttca tcttcggaca gcacgcccgc gcctggttcc acgagtgcga catccgcgtc 600

ctcgagggcc ccagctccgc ctccatcacc gccaacggtc gctcctccga gtcggacgac 660

tcttactacg tgatccacaa gtccaccgtc gctgctgctg atggcaacga tgtttcctcc 720

ggcacctact acctcggccg cccctggtcc cagtacgctc gcgtctgctt ccagaagacc 780

tccatgaccg atgtgatcaa ccacctcggc tggactgagt ggtcgacctc cactcccaac 840

accgagaacg tcaccttcgt tgaatacggc aacaccggca ctggcgccaa gggtccccgt 900

gctaacttct cttctgagct gactgagccc atcactatct cttggcttct cggatctgac 960

tgggaggatt gggttgatac tagctacatc aactaa 996

<210> 3

<211> 2169

<212> DNA

<213> 3

<400> 3

atgtcgttcc gatctcttct cgccctgagc ggccttgtct gctctgggtt ggcaagtgtg 60

atttccaagc gcgcgacctt ggattcgtgg ttgagcaacg aagcgaccgt ggctcgtact 120

gcgatcctga ataacatcgg ggcggacggt gcttgggtgt cgggcgcgga ctctggcatt 180

gtcgttgcca gtcccagcac cgataacccg gactgtatgt tttgagttcg gattatgaat 240

gtgtcttggt tgattgatgc tgactggcgt gtcttttgat gattgtagac ttctacacct 300

ggactcgcga ctctggtctc gtcatcaaga ccctcgtcga cctcttccgc aatggagata 360

ctgatctcct ttccaccatt gagcactaca tctcctctca ggcaattatt cagggtgtca 420

gtaacccctc tggtgatctg tccagcggtg gtcttggtga gcccaagttc aatgtcgatg 480

agactgccta caccggttct tggggacggc cgcagcgtga tggtcctgcc ctgagagcaa 540

ctgctatgat cggctttggg cagtggctgc ttgtatgttc tccaccccct tgcgtctgat 600

ctgcaacata tgtagctgac tggtcaggac aatggctaca ccagcgctgc aacagagatt 660

gtttggcccc tcgttaggaa cgacctgtcg tatgtggctc agtactggaa ccagacggga 720

tatggtgtgt ttgattgatc ggggttcaag ggtgtttgtg catcggagct aacttcgcgg 780

tcgcagatct ctgggaagaa gttaatggct cgtccttctt cactattgcc gtgcaacacc 840

gcgccctcgt cgaaggtagt gccttcgcga cggccgtcgg ctcgtcctgc tcctggtgtg 900

attcgcaggc acctcagatt ctctgttact tgcagtcctt ctggaccggc agctacatcc 960

tggccaactt tgacagcagc cgttccggca aggacacaaa caccctcctg ggaagcatcc 1020

acacctttga tcctgaggct ggatgcgacg actccacctt ccagccctgc tccccgcgtg 1080

cgctcgccaa ccataaggag gttgtagact ctttccgctc gatctatact ctcaacgatg 1140

gtctcagtga cagtgaggcg gttgcggtcg gtcggtaccc tgaggatagc tactacaacg 1200

gcaacccgtg gttcctgtgc accttggctg ccgcggaaca gctgtacgat gctctgtacc 1260

agtgggacaa gcaggggtcg ttggagatca cagacgtgtc acttgacttc ttcaaggctc 1320

tgtacagtgg tgctgccacc ggcacgtact cttcgtccag ctcgacctat agcagcattg 1380

tgagtgccgt caagactttc gctgatggtt ttgtttctat tgtggtaagt ctacgctaga 1440

cgagcgctca tatttacaga gggtgcgtac taacaggatt aggaaactca cgccgcaagc 1500

aacggctctc tgtctgagca attcgacaag tctgatggcg acgagctttc tgctcgcgat 1560

ctgacctggt cttacgctgc tctgctgacc gccaacaacc gtcgtaattc tgtcgtgccc 1620

ccgtcttggg gtgagacctc tgccagcagc gtgcccggca cctgtgcggc tacctctgcc 1680

tctggtacct acagcagtgt gaccgtcacc tcgtggccga gcatcgtggc tactggtggc 1740

accactacga cggctactac cactggatcg ggcggcgtga cctcgaccag caagaccacc 1800

acaactgcta gtaagaccag caccactacg tcctcgacct cctgcaccac ccccactgcc 1860

gtagctgtga cctttgatct gacggcgacc accacctacg gcgagaacat ctacctggtc 1920

gggtcgatct ctcagctcgg tgactgggag accagcgatg gcatagctct gagcgctgac 1980

aagtacactt ccagtaaccc gctttggtat gtaactgtga ctctgccggc tggtgagtca 2040

tttgagtaca agttcatccg cgttgagagc gatgactccg tggagtggga gagcgacccg 2100

aaccgggaat acaccgttcc tcaggcgtgc ggcgagtcga ccgcgacggt gaccgacacc 2160

tggcggtag 2169

<210> 4

<211> 2361

<212> DNA

<213> 4

<400> 4

atgagagtgt cgacttcaag tattgccctt gctgtgtccc tttttgggaa gctggccctt 60

gggctgtcag ctgcagaatg gcgcactcaa tccatctact tccttttgac ggatcggttc 120

ggtaggacgg acaattcgac tacagctacg tgcaatacgg gtgaccaagt atggtattgc 180

tgtacttccg tcattcatct gctgacttgg atagatctac tgtggtggaa gttggcaagg 240

aattatcaac catgttcgta tctcacttca taccatccat gctgggcgct tctgactatt 300

gctccagctg gactatatcc agggcatggg attcacagct atctggatct cgcctatcac 360

tgagcagcta ccccaggata cttcggatgg tgaagcctac catggatact ggcagcagaa 420

gatgtatgcc ctcattgcat tcatatttta tgcttactcg cagactgcag ctgacttggc 480

agatacaatg tgaactccaa cttcggcacg gcagatgatc tgaagtccct ctccgatgct 540

cttcacgccc gcggaatgta cctcatggtc gacgtcgtcc ctaaccacat ggtaagtact 600

gctttacctc tatattagta aacccaatgc gaacaatgac tgtatcaggg ctacgcaggt 660

aacggcaacg atgtggatta cagcgtcttc gaccccttcg actcctcctc ctacttccat 720

ccatactgcc tcatcacaga ttgggacaac ttgaccatgg tccaagactg ttgggagggt 780

gacaccatcg tgtctctgcc agatctgaac accacggaaa ccgccgtgag aaccatttgg 840

tacgattggg tagccgacct ggtatccaac tactcaggtg cgaccccaac ccactaaaac 900

aagccacata ctaaaaaatt gctcagtcga cggcctccgt atcgacagtg tcgaagaagt 960

cgaacccgac ttcttcccgg gctaccaaga agcagcagga gtctactgcg tcggtgaagt 1020

cgacaacggc aaccctgctc tcgactgccc ataccaaaaa tatctagatg gtgttctcaa 1080

ctatcccatg tacatacccc cttctacctt ctcgaaccca tcactaactc aattgctgca 1140

gctactggca actcctctac gcctttgaat cctccagcgg cagcatcagc aacctctaca 1200

acatgatcaa atccgtcgcc agcgactgct ccgatccgac cctcctgggc aactttatcg 1260

aaaaccacga caacccccgc ttcgcctcgt atgtcccttc catcactgcc cccttttaaa 1320

gtaaacccca ctgacaggca aagctacaca tccgactact cccaagccaa aaacgtcctc 1380

agctacatct tcctctccga cggcatcccc atcgtctacg ccggcgaaga acagcactac 1440

tccggcggcg acgtgcccta caaccgcgaa gctacctggc tatcaggcta cgacacctcc 1500

gcggagctct acacctggat agccaccaca aacgcgatcc ggaaactagc tatctcagca 1560

gactcggact acattactta cgcggtttgc cctttccctt ccccccaccc agagctcaac 1620

ccccattcta acaaaatatt tcaatggtag aacgacccaa tctacacaga cagcaacacc 1680

atcgcgatgc gcaaaggcac ctccggctcc caaatcatca ccgtcctctc caacaaaggc 1740

tcctccggaa gcagctacac cctcaccctc agcggaagcg gctacacgtc cggcacgaag 1800

ctcatcgaag cgtacacctg cacgtccgtg acggtggact cgaacgggga tatccctgtg 1860

ccgatggctt cgggattacc tagagttctc ctccctgctt cggtggttga tagttcttcg 1920

ctttgtgggg ggagtggtaa cacaaccacg accacaactg ctgctacctc cacatccaaa 1980

gccaccacct cctcttcttc ttcttctgct gctgctacta cttcttcatc atgcaccgca 2040

acaagcacca ccctccccat caccttcgaa gaactcgtca ccactaccta cggggaagaa 2100

gtctacctca gcggatctat ctcccagctc ggagagtggg atacgagtga cgcggtgaag 2160

ttgtccgcgg atgattatac ctcgagtaac cccgagtggt ctgttactgt gtcgttgccg 2220

gtggggacga ccttcgagta taagtttatt aaggtcgatg agggtggaag tgtgacttgg 2280

gaaagtgatc cgaataggga gtatactgtg cctgaatgtg ggagtgggag tggggagacg 2340

gtggttgata cgtggaggta g 2361

<210> 5

<211> 2044

<212> DNA

<213> 5

<400> 5

atgatggtcg cgtggtggtc tctatttctg tacggccttc aggtcgcggc acctgctttg 60

gctgcaacgc ctgcggactg gcgatcgcaa tccatttatt tccttctcac ggatcgattt 120

gcaaggacgg atgggtcgac gactgcgact tgtaatactg cggatcaggt gtgttgttac 180

ctactagctt tcagaaagag gaatgtaaac tgacttgata tagaaatact gtggtggaac 240

atggcagggc atcatcgaca aggtaaattg cccctttatc aaaaaaaaag aaggaaaagc 300

agaagaaaaa taaaataaaa agaactctag tcctaaccat cacatagttg gactatatcc 360

agggaatggg cttcacagcc atctggatca cccccgttac agcccagctg ccccagacca 420

ccgcatatgg agatgcctac catggctact ggcagcagga tatgtaagtc gatttcttta 480

aatatctacc tgtcatcttt tacatcaata tgaactaact tgatggtttt agatactctc 540

tgaacgaaaa ctacggcact gcagatgact tgaaggcgct ctcttcggcc cttcatgaga 600

gggggatgta tcttatggtc gatgtggttg ctaaccatat ggttcgtggt cctttgcaac 660

tgacttcgcg gatatggttc atttcagtac tgacaatgag taatatcagg gctatgatgg 720

agcgggtagc tcagtcgatt acagtgtgtt taaaccgttc agttcccaag actacttcca 780

cccgttctgt ttcattcaaa actatgaaga tcagactcag gttgaggatt gctggctagg 840

agataacact gtctccttgc ctgatctcga taccaccaag gatgtggtca agaatgaatg 900

gtacgactgg gtgggatcat tggtatcgaa ctactccagt aagatatttc tccctcattc 960

tacaacttgg ctgatcgatg atacttacga aatcagttga cggcctccgt atcgacacag 1020

taaaacacgt ccagaaggac ttctggcccg ggtacaacaa agccgcaggc gtgtactgta 1080

tcggcgaggt gctcgacggt gatccggcct acacttgtcc ctaccagaac gtcatggacg 1140

gcgtactgaa ctatcccatg tatggttcct ccaaccatga gccttcttgc aagtctcatc 1200

tcctaacgaa acggctaaaa ccagttacta tccactcctc aacgccttca agtcaacctc 1260

cggcagcatg gacgacctct acaacatgat caacaccgtc aaatccgact gtccagactc 1320

aacactcctg ggcacattcg tcgagaacca cgacaaccca cggttcgctt cgtaagtctt 1380

cccttttatt ttccgttccc aatttccaca cagaacccca cctaacaaga gcaaagttac 1440

accaacgaca tagccctcgc caagaacgtc gcagcattca tcatcctcaa cgacggaatc 1500

cccatcatct acgccggcca agaacagcac tacgccggcg gaaacgaccc cgcgaaccgc 1560

gaagcaacct ggctctcggg ctacccgacc gacagcgagc tgtacaagtt aattgcctcc 1620

gcgaacgcaa tccggaacta tgccattagc aaagatacag gattcgtgac ctacaaggta 1680

agcacaacct ctaagcatac cctaatggcc tatcttcaga gtatctgaca caagagacta 1740

atcactggca atacagaact ggcccatcta caaagacgac acaacgatcg ccatgcgcaa 1800

gggcacagat gggtcgcaga tcgtgactat cttgtccaac aagggtgctt cgggtgattc 1860

gtataccctc tccttgagtg gtgcgggtta cacagccggc cagcaattga cggaggtcat 1920

tggctgcacg accgtgacgg ttggttcgga tggaaatgtg cctgttccta tggcaggtgg 1980

gctacctagg gtattgtatc cgactgagaa gttggcaggt agcaagatct gtagtagctc 2040

gtga 2044

<210> 6

<211> 834

<212> DNA

<213> 6

<400> 6

atgaagctct ccatgacact ttccctgttt gcggccaccg ccatgggcca gacgatgtgc 60

tctcagtatg acagtgcctc gagcccccca tactcggtga accagaacct ctggggcgaa 120

taccaaggca ctggcagcca gtgtgtctac gtcgacaagc ttagcagcag tggtgcctca 180

tggcatacca aatggacctg gagtggtggc gagggaacag tgaaaagcta ctctaactcc 240

ggccttacgt ttgacaagaa gctagtcagc gatgtgtcaa gcattcccac ctcggtgaca 300

tggagccagg acgacaccaa tgtccaagcc gatgtctcat atgatctgtt caccgcggcg 360

aatgcggatc atgccacttc cagcggtgac tatgagctta tgatttggta tgtggcgtcg 420

tgaacaagat agatggagga ggctaacgta accaggcttg cccgctacgg ctcagtccag 480

cctattggca agcagattgc cacggccact gtgggaggca agtcctggga ggtgtggtat 540

ggtaccagca cccaggccgg tgcggagcag aagacatata gcttcgtggc aggatctcct 600

atcaattcgt ggagtgggga catcaaggac ttcttcaact atctcaccca gaaccaaggc 660

ttcccggcta gctctcagca tttgatcagt gagttttcct gattctacta ccgagcgcca 720

caatgaaacg gtcactaaca gaaatgatca ctagccctgc aatttggaac tgagccgttc 780

accggtggcc cggcaacctt cacggttgac aactggaccg ctagtgtcaa ctaa 834

<210> 7

<211> 1349

<212> DNA

<213> 7

<400> 7

atgaagtaca ctactatctt cagcgctgct gccgctgttt tcgctggttc cgccgctgcc 60

gtcggcgtgt ccggctctgc tgagggtttc gccaagggcg tcaccggtgg tggcagtgcc 120

acccccgtct accccgacac tatcgatgag ctggtctcct acctcggaga cgatgaggcc 180

cgcgtcattg tcctgaccaa gaccttcgac ttcaccgaca gcgaaggtac caccactggc 240

actggttgcg ctccctgggg taccgcttcc gcttgccagg ttgctattga ccagaacgac 300

tggtgcgaga actacgagcc cgatgctccc tctgtcagcg ttgaatagta tgtccttgcc 360

tgctgtcatc cgcttttgat ctcgcatcta acttgaatag ctacaacgct ggtaccctcg 420

gtatcaccgt cacctccaac aagtccctca tcggtgaggg ctcctctggt gccatcaagg 480

gcaagggtct ccgcattgtc agcggtgctg agaacatcat cattcagtag gttatactcg 540

gtgtcattag gaaattgctc taacaagatc aggaacatcg ccgttaccga catcaacccc 600

aagtacgtct ggggtggtga tgctattact cttgatgact gtgacctggt ctggatcgac 660

cacgttactg tacgccttca cttcttcact tttactaaat caagagcatc aagttaacag 720

atgacagact gcccgcattg gtcgccagca ctacgtcctc ggaaccagcg ccgacaaccg 780

cgtctctctc accaacaact acattgacgg tgtctccgac tactccgcca cctgcgatgg 840

ctaccactac tgggccatct accttgacgg tgacgccgac ttggtcacca tgaagggcaa 900

ctacatctac cacacctccg gccgttcccc caaggtccag gacaacactc tcctccacgc 960

tgtaagttct atctctgccg gtcaccttcg actggaacta accacaaaca caggttaaca 1020

actactggta cgacatctcc ggccacgcct tcgagatcgg tgagggtggc tacgtcttgg 1080

ctgagggcaa cgttttccag aacgtcgaca ctgttcttga gacctacgag ggcgaggcct 1140

tcaccgtccc ctcctccacc gccggtgaag tctgctccac ctaccttggc cgtgactgtg 1200

tcatcaacgg cttcggctcc tccggcactt tctccgagga cagcacctct ttcctctccg 1260

acttcgaggg caagaacatt gcctctgctt cggcttacac ctctgttgcc tctagcgttg 1320

ctgctaacgc cggtcagggc aacctgtaa 1349

<210> 8

<211> 1223

<212> DNA

<213> 8

<400> 8

atgcactcct accagcttct tggcctggcc gctgtcggct ccctcgtctc tgccgctccc 60

gctccttctc gcgtctctga gttcgctaag aaggcctcta cctgcacttt cacctctgcc 120

tctgaggcca gcgagagcat ctccagctgc tccgatgttg tcctgagcgg aatcgaggtc 180

cccgctggcg agaccctcga cctgtccgac gctgctgatg gctccaccgt atgtgttttt 240

cagccgtctc tcaccttcgc caatacgcta acatcaccta gatcaccttc gagggtacca 300

cttctttcgg ctacaaggaa tggaagggtc ctctgatccg cttcggtggt aaggacctga 360

ccgtcaccat ggctgacggc gctgtcatcg acggtgacgg ttctcgctgg tgggacagca 420

agggcaccaa cggtggcaag accaagccca agttcatgta catccacgat gttgaggact 480

ccacctttaa gggcatcaac gtcaagaaca ctcccgtcca ggccatcagt gtccaggcta 540

ccaacgtcca cctgaatgac ttcaccatcg acaactccga cggtgatgac aacggtggcc 600

acaacaccga tggtttcgac atcagcgagt ccaccggtgt ctacatcagc ggtgctaccg 660

tcaagaacca ggacgactgc attgccatca actctggcga ggtacgatat cctcaccacc 720

gcagccatcc aattagtaca catggctaat gattatgact acagagcatc tctttcaccg 780

gcggtacctg ctccggtggc cacggtctct ccatcggatc cgtcggtggc cgtgatgaca 840

acaccgtcaa gaacgtgacc atctccgact ccaccgtcag cgactctgcc aacggtgtcc 900

gcatcaagac catctacaag gagaccggtg atgtcagcga gatcacctac tccaacatcc 960

agctctccgg tatcaccaag tacggtatcg tcatcgagca ggactacgag aacggctctc 1020

ccaccggcac cccctccact ggtatcccca tcaccgatgt caccgttgac ggtatcaccg 1080

gtactcttga ggacgatgcc acccaggtct acatcctctg cggtgacggc tcttgctccg 1140

actggacctg gtccggtgtt gacctctccg gtggaaaggc cagcgatgac tgcgagaacg 1200

ttccttccag tgcttcttgc taa 1223

<210> 9

<211> 1288

<212> DNA

<213> 9

<400> 9

atggtgactt ctagttcggt gatcatccta acgctctggg cggcactggt cagtgcgagc 60

cccgttgccg atcccctggt gactcctgcc cctaagctcg atgatctggc aaagcgcgca 120

acctcgtgca cattctccgg gtccgagggg gcctcgtcgg ccagcaagtc caagacctca 180

tgctccacca ttgtgctctc cgatgtggca gtgccctcag gtaccacttt ggatttgacc 240

gatctgaatg atgggactca cgtaagttac tgttcctcga cgcgcgattc tcacaattaa 300

cgtggacagg tcatcttcga aggcgaaacc acgtttgggt acgaggaatg gagcggaccc 360

cttgtctccg tctccggaac tgacatcact gtcaccggag ccgacggcgc gtatctcaac 420

ggtgacggca gtcgttggtg ggacggcgag ggcagcaatg gtggcaagac gaagcccaag 480

ttcttctacg cccacgatct gacctcgtcc acgatcagcg ggatttacat ccagaactcg 540

ccggtgcagg tgttcagcat cgatggatcg acctatctca ctatggagga catcaccatt 600

gacaactcgg atggcgatga tggcgaggca gcaaacactg atggtttcga tattggtgat 660

agtacgtaca tcaccatcac gggcgcaaat gtatacaacc aagacgactg tgtggcagtg 720

aactcgggcg aggtgggtat actctccttc aatctatgga tgtggcactg atggaacaga 780

acatttactt ctcgggcggc gtctgctccg gtggccacgg gctgtcgatc ggttccgttg 840

gtggtcgcag tgacaacacc gtcaagaacg tgaccttcta cgactcggag atcaagagct 900

ctcagaacgg taggttttgt attaaggttg ttgttcggtg cgatcacatg ctaagcaggg 960

tataggagtg cgcatcaaga ccatctacgg cgacactggg tcggtaagcg aggttactta 1020

caaggagata accctgtccg atatcaccga ctacggtatt gtggtggagc agaactatga 1080

cgatacgagc aaatccccga ccgatggcat taccattgag gactttgtcc ttgacaatgt 1140

gcaagggagt gtcgagagct cgggtacgaa tatctatatt gtctgcggat cggacagctg 1200

cacagactgg acttggacgg atgtggatgt cagtggaggg aagaccagct ctgattgtga 1260

gaatgtgccg gacgatatta gctgttag 1288

Claims

1.一种黑曲霉重组菌株，其特征在于，所述的重组菌株是通过将携带有果胶甲酯酶基因的表达载体转化入缺失了糖化酶、α淀粉酶、高峰淀粉酶、葡聚糖酶、果胶裂解酶、聚半乳糖醛酸酶1和聚半乳糖醛酸酶2基因的黑曲霉菌株中获得的；

所述的糖化酶基因的编码核苷酸序列为SEQ ID NO:3；

所述的α淀粉酶基因的编码核苷酸序列为SEQ ID NO:4；

所述的高峰淀粉酶基因的编码核苷酸序列为SEQ ID NO:5；

所述的葡聚糖酶基因的编码核苷酸序列为SEQ ID NO:6；

所述的果胶裂解酶基因的编码核苷酸序列为SEQ ID NO:7；

所述的聚半乳糖醛酸酶1基因的编码核苷酸序列为SEQ ID NO:8；

所述的聚半乳糖醛酸酶2基因的编码核苷酸序列为SEQ ID NO:9；

所述的果胶甲酯酶的氨基酸序列为SEQ ID NO：1，其编码核苷酸序列为SEQ ID NO：2。

2.如权利要求1所述的黑曲霉重组菌株，其特征在于，所述的重组菌株的保藏编号为CCTCC NO:M2016778。

3.权利要求1或2所述黑曲霉重组菌株在果胶甲酯酶生产中的应用。