CN103865949A - 一种基因敲除选育纤维素酶高产菌株的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基因敲除选育纤维素酶高产菌株的方法，属于酶工程领域。本发明基因敲除选育纤维素酶高产菌株的方法为敲除纤维素酶生产菌株的淀粉酶基因。其中，一种纤维素酶高产菌株为敲除淀粉酶基因的黑曲霉，通过将重组片段淀粉酶基因的前半部分-潮霉素B抗性基因表达单元-淀粉酶基因的后半部分连接到pCAMBIA1300质粒上得到淀粉酶基因敲除质粒，再将该质粒转化农杆菌，通过农杆介导转化黑曲霉敲除淀粉酶基因。本发明利用基因敲除技术，敲掉黑曲霉的淀粉酶基因，敲出淀粉酶基因后，细胞负荷减少，从而有利于产生大量的纤维素酶，得到的纤维素酶高产菌株纤维素酶活性达到21U/g。

Description

一种基因敲除选育纤维素酶高产菌株的方法

 

技术领域

    本发明属于酶工程领域，具体涉及一种基因敲除选育纤维素酶高产菌株的方法。

背景技术

纤维素是地球上最丰富的可再生资源，地球上每年因光合作用产生的纤维素达到100亿吨左右，利用纤维素生产生物能源，是缓解能源危机，实现人类可持续发展的关键。

纤维素利用的关键是把纤维素降解为可发酵性的糖类-葡萄糖。纤维素的降解需要外切酶、内切酶、葡聚糖苷酶的共同作用。其中内切酶降解长片段的纤维素成为二聚体，是纤维素降解的关键步骤。用纤维素酶降解纤维素具有绿色，条件温和，转化率高的特点，但是纤维素酶较高的生产成本成为纤维素酶降解纤维素的瓶颈。

获得高产纤维素酶的菌株，降低纤维素酶的生产成本成为纤维素酶工业化利用的必由之路。纤维素酶的生产菌株主要有黑曲霉和里氏木霉。黑曲霉由于其较高的安全性，被认为是生产纤维素酶最有应用前景的菌株之一，但是纤维素酶的酶活相对于工业化应用的需求而言优势较低，构建高产纤维素酶的菌株，成为黑曲霉产生的纤维素酶工业化利用的途径之一。构建纤维素酶高产菌株有用物理诱变、化学诱变、基因工程构建基因工程菌株等。用物理诱变和化学诱变的方法具有快捷有效的有点，但是诱变是一个随机的过程，缺乏方向性。基因工程构建菌株就有可操控的方向性，已经成为构建高产菌株的主要手段。基因敲除，能打破已有的代谢网络，代谢网络的改变，有利于获得更高产量的菌株。

黑曲霉在生产纤维素酶的同时，还会产生大量的其它酶类，这些酶类的翻译和分泌对大量生产纤维素酶不利。因为这些酶类的翻译和分泌一方面要消耗大量的营养物质，另外一方面其合成和分泌消耗细胞的大量能源，加重了细胞负荷。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种基因敲除选育纤维素酶高产菌株的方法。本发明的目的还在于提供一种纤维素酶高产菌株。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种基因敲除选育纤维素酶高产菌株的方法，为敲除纤维素酶生产菌株的淀粉酶基因。

所述的纤维素酶生产菌株优选为黑曲霉和里氏木霉。

一种纤维素酶高产菌株，为敲除淀粉酶基因的黑曲霉。

优选的，所述的敲除淀粉酶基因的黑曲霉通过包含如下步骤的方法制备得到：

（1）合成淀粉酶基因的前半部分-潮霉素B抗性基因表达单元-淀粉酶基因的后半部分的重组片段；将该重组片段连接到pCAMBIA1300质粒上得到淀粉酶基因敲除质粒；

（2）用淀粉酶基因敲除质粒转化农杆菌；

（3）将含有淀粉酶基因敲除质粒的农杆菌和黑曲霉混合培养，通过潮霉素B抗性筛选得到敲除淀粉酶基因的黑曲霉。

更优选的，步骤（1）为：合成如SEQ ID NO.1所示的重组片段（淀粉酶基因的前半部分-潮霉素B抗性基因表达单元-淀粉酶基因的后半部分），用NcoI酶切；将pCAMBIA1300质粒用NcoI酶切；将酶切后的重组片段和质粒通过DNA连接酶连接，并转化DH5α得到淀粉酶基因敲除质粒pCAMBIA1300-gh。

本发明相对于现有技术具有如下优点和效果：

本发明利用基因敲除技术，敲掉黑曲霉的淀粉酶基因，敲出淀粉酶基因后，细胞负荷减少，从而有利于产生大量的纤维素酶。

本发明通过基因工程的基因敲除技术得到纤维素酶活性达到21 U/g的高产菌株，酶活提高了近2倍。

具体实施方式

    下面结合实施例对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

A、淀粉酶基因敲除质粒的构建

（1）重组片段的合成

重组片段由淀粉酶基因的前半部分（SEQ ID NO.2），潮霉素B抗性基因表达单元（SEQ ID NO.3），淀粉酶基因的后半部分（SEQ ID NO.4）组成，合成的重组片段（SEQ ID NO.1）用NcoI酶液2 μL（TakaRa购买），30 ℃酶切16 h。

（2）pCAMBIA1300提取及酶切

含有pCAMBIA1300质粒的大肠杆菌E.coli DH5α于37 ℃振荡培养12 h。取1.5 mL菌体于EP管，以4000 rpm离心3 min，弃上清液。加0.l mL溶液I（1%葡萄糖，50 mM EDTA pH 8.0，25 mM Tris-HCl pH 8.0）充分混合。加入0.2 mL溶液II（0.2 mM NaOH，1% SDS），轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min。加入0.15 mL预冷溶液III（5 mol/L KAc，pH4.8），轻轻翻转混匀，冰浴5 min。以10000 rpm离心20 min，取上清液于另一新EP管。加入等体积的异戊醇，混匀后静置10 min。再以10000 rpm离心20 min，弃上清。用70%乙醇0.5 mL洗涤一次，抽干所有液体。待沉淀干燥后，溶于0.05 mL TE缓冲液中。

提取的pCAMBIA1300质粒50 μL加入NcoI酶液2 μL（TakaRa购买），30 ℃酶切16 h，酶切后65 ℃水浴10 min。

（3）连接

酶切的合成片段100 μL和酶切的质粒20 μL用5 μL T4 DNA ligase（TakaRa购买）16 ℃连接24 h。

B、感受态细胞制备

（1）将E.coli DH5α置于LB培养基上，在37 ℃下过夜培养。

（2）高温灭菌大的离心瓶（250-500mL）以备第二天摇瓶用。

（3）准备几瓶灭菌水（总量约1.5升），保存于冷冻室中以备第二天重悬浮细胞用。

（4）转移0.2-1 mL过夜培养物至装有20 mL LB（或其他营养丰富的培养基）的100 mL摇瓶。

（5）37 ℃下剧烈振荡培养6小时。

（6）监控O.D.600值（培养1小时后每半小时测定一次）。

（7）当O.D.600值达到0.5-1.0时，从摇床中取出摇瓶，置于冰上冷却15分钟。

（8）细胞在4 ℃ 5000g下离心15分钟，弃上清液。

（9）用灭菌的冰水重悬浮细胞。先用涡旋仪或吸液管重悬浮细胞于少量体积中（几毫升），然后加水稀释至离心管的2/3体积。

（10）照上面步骤重复离心，小心弃去上清液。

（11）照上面步骤用灭菌的冰水重悬浮细胞。

（12）离心，弃上清液。

（13）用20 mL灭菌的、冰冷后的10%甘油重悬浮细胞。

（14）照上面步骤离心，小心弃去上清液（沉淀可能会很松散）。

（15）用10%甘油重悬浮细胞至最终体积为2-3 mL。

（16）将细胞按150 μL等份装入微量离心管，于-80 ℃保存。

C、转化大肠杆菌

（1）在冰上解冻B步骤制得的感受态细胞。

（2）每100 μL感受态细胞添加10 μL连接的质粒，冰上培育约5分钟。

（3）转移DNA/细胞混合物至冷却后的2 mm电穿孔容器中。

（4）加载电转化仪，准备好300 μL LB培养基。

（5）对电穿孔容器进行脉冲（200 欧姆，25 μFd，2.5 千伏）（检查时间常数，应该在3以上）。

（6）立即添加300 μL的LB至电穿孔容器中。

（7）37 ℃下培养细胞40分钟至1小时以复原。

（8）转移细胞至含有卡那霉素（100 μg/mL）选择培养基上培养。长出为含有质粒pCAMBIA1300-gh的转化子。

D、淀粉酶基因敲除质粒的提取

C步骤得到的转化子37 ℃振荡培养12 h。取1.5 mL菌体于EP管，以4000 rpm离心3 min，弃上清液。加0.l mL溶液I（1%葡萄糖，50 mM EDTA pH 8.0，25 mM Tris-HCl pH 8.0）充分混合。加入0.2 mL溶液II（0.2 mM NaOH，1% SDS），轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min。加入0.15 mL预冷溶液III（5 mol/L KAc，pH4.8），轻轻翻转混匀，冰浴5 min。以10000 rpm离心20 min，取上清液于另一新EP管。加入等体积的异戊醇，混匀后静置10 min。再以10000 rpm离心20 min，弃上清。用70%乙醇0.5 mL洗涤一次，抽干所有液体。待沉淀干燥后，溶于0.05 mL TE缓冲液中。

E、转化农杆菌

农杆菌感受态的制备：液体保存的农杆菌涂布于LB培养基上，28 ℃培养，等到单菌落长出后，挑取单菌落，接种于5 mL的液体培养基，28 ℃、150 r/m培养24 h，按照1:10的接种比例接种于5 mL新鲜的液体培养基中，28 ℃、150 r/m培养24 h。培养的菌体冰浴40 min，5000 r/m离心5 min，用10 mL的0.02 mol/L CaCl₂菌体重悬菌体。再次5000 r/m离心5 min，菌体悬浮于1 mL的0.02 mol/L CaCl₂溶液，放置于冰上保藏。

取提取的质粒pCAMBIA1300-gh 1 μL与40 μL的农杆菌感受态悬液混合，轻轻摇动混合5 min后，在液氮上迅速冰冻5 min，37 ℃水浴5 min。加入 1 mL液体LB培养基，28 ℃轻轻震荡4 h。菌体5000 r/m离心5 min，弃去上清液，加入LB培养基50 μL，震荡重新悬浮液体。液体涂布于含有100 μg/mL卡那霉素的LB平板上，长出的菌落接种于含有100 μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中28 ℃、150 r/m培养24 h。

F、农杆介导转化黑曲霉敲除淀粉酶基因

黑曲霉（从ATCC购买，菌株编号ATCC10582，Aspergillus niger）接种于PDA培养基斜面上，37 ℃培养 72 h，用灭菌的蒸馏水冲洗下孢子，孢子用蒸馏水稀释到10⁸个孢子/mL。孢子与等体积的含有质粒pCAMBIA1300-gh的农杆菌混合均匀，加入乙酰丁香酮至200 μmol/L，30 ℃避光培养24 h。然后把孢子涂布在平板上（200 g土豆用1 L自来水煮沸30min，纱布过滤，滤液中加入20 g葡萄糖、20 g可溶性淀粉、20 g琼脂、200 μmol头孢噻肟、200 mg潮霉素B），30 ℃培养到长出菌落。菌落周围无透明圈的为基因敲除的菌株，筛选得到不产淀粉酶的菌株，酶活达到21.0 U/g。出发菌株在相同条件下的酶活为10.7 U/g。

纤维素酶酶活测定：以滤纸为底物，在50 ℃进行酶降解反应。在25 mL试管中加入10 mL pH 5.0的0.05 M柠檬酸缓冲液，加入滤纸条2 g（1 cm×5 cm），加入发酵液离心后上清液2 mL，在水浴锅中50 ℃保温30 min，然后用沸水煮沸5 min。用DNS法测定还原糖的含量。酶活定义为：每分钟释放出1 μmol还原糖所需要的酶量。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

 

<110>  湖北工业大学

 

<120>  一种基因敲除选育纤维素酶高产菌株的方法

 

<130>  1

 

<160>  4    

 

<170>  PatentIn version 3.5

 

<210>  1

<211>  2662

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 

<220>

<223>  重组片段

 

<400>  1

cccatggatg tcgttccgat ctctactcgc cctgagcggc ctcgtctgca cagggttggc       60

 

aaatgtgatt tccaagcgcg cgaccttgga ttcatggttg agcaacgaag cgaccgtggc      120

 

tcgtactgcc atcctgaata acatcggggc ggacggtgct tgggtgtcgg gcgcggactc      180

 

tggcattgtc gttgctagtc ccagcacgga taacccggac tgtatgtttc gagctcagat      240

 

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gggtatcagt aacccctctg gtgatctgtc cagcggcgct ggtctcggtg aacccaagtt      480

 

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tctgagagca actgctatga tcggcttcgg gcagtggctg cttgtatgtt ctccaccccc      600

 

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ggtatgtcac tgtgaccatg gg                                              2662

 

 

<210>  2

<211>  638

<212>  DNA

<213>  Aspergillus niger

 

<400>  2

cccatggatg tcgttccgat ctctactcgc cctgagcggc ctcgtctgca cagggttggc       60

 

aaatgtgatt tccaagcgcg cgaccttgga ttcatggttg agcaacgaag cgaccgtggc      120

 

tcgtactgcc atcctgaata acatcggggc ggacggtgct tgggtgtcgg gcgcggactc      180

 

tggcattgtc gttgctagtc ccagcacgga taacccggac tgtatgtttc gagctcagat      240

 

ttagtatgag tgtgtcattg attgattgat gctgactggc gtgtcgtttg ttgtagactt      300

 

ctacacctgg actcgcgact ctggtctcgt cctcaagacc ctcgtcgatc tcttccgaaa      360

 

tggagatacc agtctcctct ccaccattga gaactacatc tccgcccagg caattgtcca      420

 

gggtatcagt aacccctctg gtgatctgtc cagcggcgct ggtctcggtg aacccaagtt      480

 

caatgtcgat gagactgcct acactggttc ttggggacgg ccgcagcgag atggtccggc      540

 

tctgagagca actgctatga tcggcttcgg gcagtggctg cttgtatgtt ctccaccccc      600

 

ttgcgtctga tctgtgacat atgtagctga ctggtcag                              638

 

 

<210>  3

<211>  1465

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 

<220>

<223>  潮霉素B抗性基因表达单元

 

<400>  3

taccacctcg tgctgtgaga gcagatgagg ttcttatagt ttctatgtca gagtcttctg       60

 

gtttcccgat aactctgaaa agttgtttcc cattatagcc ctttggagga gcctaaggta      120

 

acgggtcgat agacagtgaa gtagttttcc tgtcatcttt tccttccacc gtggatgttt      180

 

acggtagtaa cgctatttcc tttccgatag caagttctac ggagacggct gtcaccaggg      240

 

tttctacctg ggggtgggtg ctcctcgtag cacctttttc ttctgcaagg ttggtgcaga      300

 

agtttcgttc acctaactac actattgtac cacctcgtgc tgtgagagca gatgaggttc      360

 

ttatagtttc tatgtcagag tcttctggtt tcccgataac tctgaaaagt tgtttcccat      420

 

tatagccctt tggaggagcc taaggtaacg ggtcgataga cagtgaagta gttttcctgt      480

 

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gggcttcagg ccgtggagca cgtgcgccta aagccgaggt tgttacagga ctgcctgtta     1440

 

ccggcgtatt gtcgccagta actga                                           1465

 

 

<210>  4

<211>  559

<212>  DNA

<213>  Aspergillus niger

 

<400>  4

actaacagaa gtaggaaact cacgccgcaa gcaacggctc catgtccgag caatacgaca       60

 

agtctgatgg cgagcagctt tccgctcgcg acctgacctg gtcttatgct gctctgctga      120

 

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gcgtgcccgg cacctgtgcg gccacatctg ccattggtac ctacagcagt gtgactgtca      240

 

cctcgtggcc gagtatcgtg gctactggcg gcaccactac gacggctacc cccactggat      300

 

ccggcagcgt gacctcgacc agcaagacca ccgcgactgc tagcaagacc agcaccagta      360

 

cgtcatcaac ctcctgtacc actcccaccg ccgtggctgt gactttcgat ctgacagcta      420

 

ccaccaccta cggcgagaac atctacctgg tcggatcgat ctctcagctg ggtgactggg      480

 

aaaccagcga cggcatagct ctgagtgctg acaagtacac ttccagcgac ccgctctggt      540

 

atgtcactgt gaccatggg                                                   559

Claims (5)

1.一种基因敲除选育纤维素酶高产菌株的方法，其特征在于：敲除纤维素酶生产菌株的淀粉酶基因。

2.根据权利要求1所述的基因敲除选育纤维素酶高产菌株的方法，其特征在于：所述的纤维素酶生产菌株为黑曲霉和里氏木霉。

3.一种纤维素酶高产菌株，其特征在于：为敲除淀粉酶基因的黑曲霉。

4.权利要求3所述的纤维素酶高产菌株的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）合成淀粉酶基因的前半部分-潮霉素B抗性基因表达单元-淀粉酶基因的后半部分的重组片段；将该重组片段连接到pCAMBIA1300质粒上得到淀粉酶基因敲除质粒；

（2）用淀粉酶基因敲除质粒转化农杆菌；

（3）将含有淀粉酶基因敲除质粒的农杆菌和黑曲霉混合培养，通过潮霉素B抗性筛选得到敲除淀粉酶基因的黑曲霉。

5.根据权利要求4所述的纤维素酶高产菌株的制备方法，其特征在于步骤（1）为：合成如SEQ ID NO.1所示的重组片段，用NcoI酶切；将pCAMBIA1300质粒用NcoI酶切；将酶切后的重组片段和质粒通过DNA连接酶连接，并转化DH5α得到淀粉酶基因敲除质粒pCAMBIA1300-gh。