CN105462864A - 一种产α-葡萄糖苷酶的黑曲霉突变菌株 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的是提供一种高产α-葡萄糖苷酶的黑曲霉菌株，该黑曲霉菌株是首先将来外源的α-葡萄糖苷酶基因在黑曲霉宿主菌中过表达，构建得到表达α-葡萄糖苷酶的黑曲霉工程菌，然后通过基因敲除手段敲除宿主菌自身的糖化酶基因，筛选获得的。本发明的突变菌黑曲霉Su-A2，其保藏编号为CCTCC？NO：M2015681。本发明提供的α-葡萄糖苷酶活力达到20.45u/ml，蛋白表达量为4.13g/L，比突变前分别提高了39.3％和18％，可以进行广泛应用。

Description

一种产α-葡萄糖苷酶的黑曲霉突变菌株
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种产α-葡萄糖苷酶的黑曲霉突变菌株。
技术背景
葡萄糖苷酶是糖苷水解酶大家族中的一大类酶，主要功能为水解葡萄糖苷键，释放出葡萄糖作为产物，是生物体糖代谢途径中不可或缺的一类酶。葡萄糖苷酶来源广泛，几乎所有以碳水化合物为能源的具有细胞结构的生物体内都有所存在。根据具有糖类活性的酶数据库(Carbohydrate-ActiveenZYmesDatabase，CAZy)依据蛋白质晶体结构的同源性与功能的相似性所进行的归类[2]，可将现已发现的糖苷水解酶分为133个糖苷水解酶家族(GH1～GH133)，其中，葡萄糖苷酶主要分布在GH1、GH3、GH4、GH5、GH9、GH13、GH17、GH30、GH31、GH63、GH97、GH116与GH122等糖苷水解酶家族中。
由于葡萄糖苷键的成键方式分为α-型与β-型两种，因此，其所对应的葡萄糖苷酶分别被称为α-葡萄糖苷酶与β-葡萄糖苷酶。根据CAZy的具体分类，α-葡萄糖苷酶主要分布于GH4、GH13、GH31、GH63、GH97以及GH122五个家族中；而β-葡萄糖苷酶主要分布于GH1、GH3、GH5、GH9、GH17、GH30、GH116等七个家族中。
生产α-葡萄糖苷酶的微生物种类有细菌、曲霉、古细菌等。现在工业上生产环糊精所使用的α-葡萄糖苷酶主要来自黑曲霉(Aspergillusniger)。由于能分泌α-葡萄糖苷酶的野生菌株的生产能力普遍较低，因此如何进一步筛选出高产α-葡萄糖苷酶的生产菌株成为当前国内外研究的热点。
发明内容
本发明的目的是提供一种高产α-葡萄糖苷酶的黑曲霉菌株。申请人首先将来外源的α-葡萄糖苷酶基因在黑曲霉宿主菌中过表达，构建得到表达α-葡萄糖苷酶的黑曲霉工程菌，然后通过基因敲除手段敲除宿主菌自身的糖化酶基因，筛选获得α-葡萄糖苷酶产量明显提高的突变菌株，为该酶的广泛应用奠定了基础。
本发明一方面提供了一种黑曲霉工程菌，其携带有表达α-葡萄糖苷酶基因的重组质粒。
所述的α-葡萄糖苷酶，其氨基酸序列为SEQIDNO:1；其编码基因的序列为SEQIDNO:2。
本发明一方面提供了一株突变菌黑曲霉Su-A2(AspergillusnigerSu-A2)，已于2015年11月18日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M2015681。
本发明所述黑曲霉Su-A2在生产α-葡萄糖苷酶中的应用。
本发明构建的黑曲霉工程菌Su-A1，在30L发酵罐发酵条件下其α-葡萄糖苷酶活力达到14.68u/ml，蛋白表达量为3.5g/L。为了进一步提高其产酶能力，本发明通过基因敲除手段敲除宿主菌自身的糖化酶基因，筛选获得的突变菌株黑曲霉Su-A2，其α-葡萄糖苷酶活力达到20.45u/ml，蛋白表达量为4.13g/L，比突变前分别提高了39.3％和18％，可以进行广泛应用。
附图说明
图1为质粒pGAU图谱；
图2为质粒pMD18T-pyrG图谱。
具体实施方式
本发明用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如MOLECULARCLONING:ALABORATORYMANUAL,3ndEd.(Sambrook,2001)和CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY(Ausubel,2003)中所记载的方法。这些一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是，本领域的技术人员可以在本发明所记载的技术方案的基础上，采用本领域常规的方法、实验方案和试剂，而不限于本发明具体实施例的限定。
下面结合具体实施方式对本发明进行详细描述。
实施例1α-葡萄糖苷酶基因的获得
根据公共基因数据库中的基因序列，设计引物从黑曲霉基因组中PCR扩增获得α-葡萄糖苷酶基因AglU1(核苷酸序列为SEQIDNO：1)，其编码的氨基酸序列为SEQIDNO：2。
PCR引物和反应条件如下：
引物1(F)：ATGGTGAAGTTGACCGATCTC
引物2(R)：CTACCATTCTAGCACCCAGTT
反应条件为：94℃变性5min；然后94℃变性30s，56℃复性30s，72℃延伸3min，30个循环后，72℃保温10min。琼脂糖电泳结果显示，AglU1基因大小为3127bp。
实施例2重组载体构建
PCR扩增α-葡萄糖苷酶基因，引物两端引入XbaI位点。引物序列如下：
引物3(F)：GCTCTAGAATGGTGAAGTTGACCGATCTC
引物4(R)：GCTCTAGACTACCATTCTAGCACCCAGTT
PCR反应条件为：94℃变性5min；然后94℃变性30s，56℃复性30s，72℃延伸3min，30个循环后，72℃保温10min。琼脂糖凝胶电泳结果显示，AglU1基因为大小3127bp的片段。
将上述获得的α-葡萄糖苷酶AglU1片段与表达载体pGAU分别进行限制性内切酶XbaI单酶切，酶切条件如下：
37℃水浴酶切处理2h，电泳后分别回收两个目的片段，溶于20ulddH2O。用T4DNA连接酶进行连接，连接体系如下：
22℃连接1h，转化大肠杆菌DH5a感受态，涂布LB+AMP平板，37℃培养过夜后长出单菌落，菌落PCR验证连接正确的转化子提取质粒送测序，测序正确后，即得到含有α-葡萄糖苷酶基因AglU1的重组载体pGAU-AglU1。
实施例3α-葡萄糖苷酶AglU1的重组表达
原生质体制备：接种黑曲霉宿主菌Su2-1于PDA+U平板，30℃培养5-7d。割取2cm×2cm大小的菌块，接种100ml液体PDA+U培养基中，30℃培养24h生长菌丝体，用于转化。将长好的菌丝体过滤后，用20ml1.2M硫酸镁溶液重悬，加入0.2g溶菌酶。30℃、100rpm培养2-3h。将裂解好的菌丝用2层擦镜纸过滤，3000rpm离心10min获得原生质体。
转化：原生质体用1.2M山梨醇溶液清洗2遍，再用适量的山梨醇溶液重悬，使原生质体浓度达到108。200ul原生质体中加入10ul准备好的质粒，加入50ul25％的PEG6000，冰浴20min，再加入2ml25％的PEG6000室温放置5min，加入4ml山梨醇溶液颠倒混匀。倒入50ml转化上层培养基后，倾倒入4个转化下层平板中，待上层培养基凝固后，于30℃培养箱中倒置培养5d。
转化子筛选：培养5d后，挑取长出的菌落，点种到转化下层平板进行复筛，30℃培养2d。将正常生长的转化子分别接种到新鲜的PDA平板，30℃培养5-7d。每个转化子割取2cm×2cm大小的菌块，分别接种至50ml液体摇瓶培养基中发酵，32℃培养5d，每天加入适量氨水，控制pH在4.5左右。培养5d后，离心菌体获得上清液即为粗酶液，进行蛋白电泳检测，筛选出有明显蛋白条带表达的重组菌株，即为阳性转化子。
申请人将其中一个阳性转化子命名为黑曲霉Su-A1(AspergillusnigerSu-A1)。
实施例4U缺陷型菌株筛选
将上述黑曲霉Su-A1接种至PDA平板，30℃培养7d，吸取1ml无菌水洗脱孢子，稀释一定倍数使孢子浓度在1×105个/ml。涂布BT平板(PDA中添加终浓度1.5g/L的5-氟乳清酸，1g/L的尿苷)，30℃培养3-5d，挑取长出的菌落接种PDA+U平板(PDA中添加终浓度1g/L的尿苷)，30℃培养3-5d，即获得U缺陷型的菌株。
实施例5敲除宿主菌的糖化酶基因
设计引物从黑曲霉宿主Su2-1基因组中PCR扩增获得糖化酶基因的上下游同源臂GU(序列为SEQIDNO：3)，GD(序列为SEQIDNO：4)。
PCR引物和反应条件如下：
引物5(GUF)：TCCGCTAACTTAGGTCTAC
引物6(GUR)：ACTTTCAACCCCTCACTG
引物7(GDF)：TCATCTTAGATCCAAGCACGTA
引物8(GDR)：CAGACGCTGGCGATAGAG
反应条件为：94℃变性5min；然后94℃变性30s，56℃复性30s，72℃延伸90s，30个循环后，72℃保温10min。琼脂糖电泳结果显示，同源臂GU大小为1687bp，同源臂GD大小为1616bp。
将同源臂GU、GD通过SphI、KpnI连接到敲除载体pMD18T-pyrG中pyrG标记的两端，构建敲除载体pΔGA。
根据实施例3中方法，将敲除载体pΔGA转化黑曲霉Su-A1的U缺陷型菌株，筛选获得转化子，通过引物9、10验证。敲除糖化酶基因的菌株扩增不出目的条带，未敲除糖化酶基因的菌株扩增出941bp片段。
引物9(GAF)：GGCGTGTCTTTTGATGAT
引物10(GAR)：GGTTGCCGTTGTAGTAGC
从糖化酶基因敲除的菌株中筛选出一株α-葡萄糖苷酶产量明显提高的菌株，命名为黑曲霉(Aspergillusniger)Su-A2。
实施例6α-葡萄糖苷酶酶活力测定
(1)α-葡萄糖苷酶酶活单位的定义
在50℃、pH值为4.8的条件下，每分钟从浓度为4mmol/L的对硝基苯酚-α-D-葡萄糖苷溶液中释放1μmol对硝基苯酚所需要的酶量即为一个酶活力单位U。
(2)标准曲线绘制
5mmol/L对硝基苯酚-α-D-葡萄糖苷底物溶液：秤取0.0753g对硝基苯酚-α-D-葡萄糖苷，精确到0.0001g，缓慢加入0.05mol/LpH＝4.8的柠檬酸缓冲液至接近50ml，磁力搅拌约10min，用2mol/L的柠檬酸或者氢氧化钠调相应的pH值，最后定容至50ml，现用现配。
秤取对硝基苯酚0.0696g，用0.05mol/LpH＝4.8的柠檬酸缓冲液定容至100ml棕色容量瓶中，磁力搅拌30min至完全溶解即得5mmol/L对硝基苯酚溶液。
将5mmol/L对硝基苯酚溶液精确稀释10倍即得对硝基苯酚标准液。将对硝基苯酚标准液分别稀释2、4、6、8、10、12、16倍。
取0.5ml上述对硝基苯酚稀释液(空白对照取缓冲液)，加入2ml碳酸钠溶液，加入0.5ml5mmol/L对硝基苯酚-α-D-葡萄糖苷底物溶液，混合均匀，以空白对照调零，以在410nm测定吸光值。以体系中对硝基苯酚含量为横坐标X，吸光值为纵坐标Y，绘制标准曲线Y＝kX+b。
(3)酶活测定
取适量底物，50℃预热5min；
取4支15*150试管(1支空白管，3支样品管)，分别向4支管中准确加入已稀释好的酶液0.5ml；
将4支试管同时置于50℃水浴中，预热2min；
准确向样品试管中加入0.5ml5mmol/L对硝基苯酚-α-D-葡萄糖苷底物溶液底物溶液，准确计时15min；
迅速向各管中加入2ml碳酸钠溶液，于空白管中加入底物溶液0.5ml，摇匀；
以空白管调零，在分光光度计波长410nm下，用10mm比色杯分别测量。
3样品管中的吸光值取平均值，通过查标准曲线求出对硝基苯酚的含量。
酶活力计算公式：A＝X×1/0.5×n/15
A——α-葡萄糖苷酶酶活力，u/ml；
X——吸光值在标准曲线上查得的对硝基苯酚含量，μmol；
1/0.5——换算成酶液1ml；
n——酶样的稀释倍数；
15——时间换算系数。
实施例730L发酵罐发酵
在30升发酵罐上进行上述黑曲霉Su-A1及其突变菌黑曲霉Su-A2的发酵，发酵使用的培养基配方为：麦芽糖2.5g/L、硫酸铵0.9％、磷酸氢二钠0.15g/L、氯化钙0.1g/L、硫酸钾0.5g/L、硫酸镁16.4g/L、柠檬酸钠0.2g/L、磷酸二氢钾0.25％、豆粉0.5％、消泡剂0.05％。补料培养基：麦芽糖浓度为400g/L，pH调至4.0-5.0之间。
发酵生产工艺：pH值4.0、温度30℃、搅拌速率300-700rpm、通风量1.0-1.5(v/v)、溶氧控制在20％以上。
整个发酵过程分为三个阶段：第一阶段为菌体培养阶段，按7％比例接入种子，30℃培养15-25h，以溶氧回升为标志；第二阶段为饥饿阶段，当底糖耗完之后，不流加任何碳源，溶氧上升至60％以上表明该阶段结束，为期约30-120min；第三阶段为产酶阶段，流加补料培养基进行产酶培养，期间保持溶氧在20％以上且维持发酵液中还原糖浓度不低于1g/L，发酵周期在140-170h之间。发酵结束后，将发酵液通过板框过滤机处理后获得粗酶液，对粗酶液进行α-葡萄糖苷酶活力检测。
检测结果显示：在30L发酵罐发酵条件下，黑曲霉Su-A1发酵液中α-葡萄糖苷酶活力为14.68u/ml，蛋白表达量为3.5g/L；而黑曲霉Su-A2发酵液中α-葡萄糖苷酶活力高达20.45u/ml，蛋白表达量达4.13g/L，比突变前分别提高了39.3％和18％。
申请人已于2015年11月18日将突变菌株黑曲霉Su-A2(AspergillusnigerSu-A2)保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M2015681。

Claims (6)

1.一种黑曲霉工程菌，其特征在于，所述的黑曲霉工程菌携带有表达α-葡萄糖苷酶基因的重组质粒。
2.如权利要求1所述的黑曲霉工程菌，其特征在于，所述的α-葡萄糖苷酶，其氨基酸序列为SEQIDNO:1。
3.如权利要求2所述的黑曲霉工程菌，其特征在于，所述α-葡萄糖苷酶的编码基因的序列为SEQIDNO:2。
4.一种权利要求1所述的黑曲霉工程菌的突变菌株，其特征在于，所述的突变菌株是敲除了权利要求1所述的黑曲霉工程菌的内源糖化酶基因获得的。
5.如权利要求4所述的突变菌株，其特征在于，所述的突变菌株为黑曲霉(Aspergillusniger)Su-A2，其保藏编号为CCTCCNO：M2015681。
6.权利要求5所述的突变菌株在生产α-葡萄糖苷酶中的应用。
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