CN104328096A - 一种α-葡萄糖苷酶及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种α-葡萄糖苷酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO：1。本发明的α-葡萄糖苷酶的最适作用温度为60℃，且在50-65℃范围内能保持80％以上的酶活力；最适作用pH为4.5，且在pH3.0-6.0范围内能保持80％以上的酶活力。该α-葡萄糖苷酶能高效转化麦芽糖，转化产物中异麦芽糖、潘糖和异麦芽三糖的含量最高，分别达到44.1％、23.0％和21.2％，三糖总含量为88.3％。因此，本发明所述α-葡萄糖苷酶可广泛应用于低聚异麦芽糖浆的生产，市场前景广阔。

Description

一种α-葡萄糖苷酶及其应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种α-葡萄糖苷酶及其应用。
背景技术
α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase，简称AGLU酶，EC 3.2.1.20)，又名α-D-葡萄糖苷水解酶，它可以从低聚糖类底物的非还原末端切开α-1,4糖苷键，释放出葡萄糖；或将游离出的葡萄糖残基转移到另一糖类底物上形成α-1,6糖苷键，从而形成具有非发酵性的功能性低聚糖——低聚异麦芽糖(简称IMOs，主要包括异麦芽糖，潘糖，异麦芽三糖等)。工业上α-葡萄糖苷酶主要应用于低聚异麦芽糖的大量生产。低聚异麦芽糖是一类含有至少一个α-(1,6)糖苷键的低聚糖，主要是异麦芽糖，潘糖，异麦芽三糖，天然少量存在于酱油，蜂蜜中，它己经慢慢被用来替代传统的蔗糖作为食品添加剂。它被摄入人体后不会被消化道吸收，也不能被有害菌利用，但可以被肠道的益生菌如双歧杆菌作为碳源利用，故其具有良好的双歧因子作用，可以改善人体肠道的功能。此外，由于低聚异麦芽糖的甜度只有普通糖的一半，可以有效防止儿童龋齿，适宜糖尿病人食用，可以作为饮料糖果和保健品的添加剂。在饲料工业中，低聚异麦芽糖被认为可以在提高家禽存活率的同时，又不会存在合成饲料带来对人体的副作用，据报道，日本50％左右的饲料中都含有低聚异麦芽糖。目前，低聚异麦芽糖已经在食品、医药和饲料加工行业有了很广泛的应用。
生产AGLU酶的微生物种类有细菌、曲霉、古细菌等。现在工业上生产环糊精所使用的AGLU酶主要来自黑曲霉。由于能分泌AGLU酶的野生菌株的生产能力普遍较低，为了克服野生菌株的低生产能力，国内外研究者通过构建基因工程菌生产重组AGLU酶。在国内，对α-葡萄糖苷酶的研究还主要在α-葡萄糖苷酶的生产菌种选育和酶学性质方面，虽然有通过RT-PCR方法扩增得到A.nigerα-葡萄糖苷酶cDNA，构建重组质粒并尝试在大肠杆菌中表达，但酶表达量偏低，而且重组蛋白是胞内酶，分离纯化的成本相对高。
迄今为止，国内生产低聚异麦芽糖用α-葡萄糖苷酶主要依赖日本进口，为了降低低聚异麦芽糖的商业成本，首先必须降低α-葡萄糖苷酶的生产成本。因此，进一步筛选出性能优良的α-葡萄糖苷酶基因并实现其在宿主菌中的高效表达成为当前研究的热点。
发明内容
本发明为解决现有技术问题，提供了一种新型α-葡萄糖苷酶及其应用。本发明通过将来源于黑葡萄穗霉(Stachybotrys chartarum)的α-葡萄糖苷酶基因转化入黑曲霉(Aspergillus niger)中，构建得到重组工程菌株，实现了该酶在体外的高效表达，为其商业化应用奠定了基础。
本发明一方面提供了一种α-葡萄糖苷酶，其特征在于：
1)其氨基酸序列为SEQ ID NO：1的α-葡萄糖苷酶；
2)在1)中的氨基酸上发生取代、缺失或添加一个或数个氨基酸得到的，具有1)中α-葡萄糖苷酶活性的酶。
本发明另一方面提供了编码上述α-葡萄糖苷酶的基因，其一种核苷酸序列为SEQ ID NO:2。
本发明提供了一种表达载体，其包含上述编码α-葡萄糖苷酶的核苷酸序列。
本发明还提供了一种表达宿主细胞，其携带有表达上述α-葡萄糖苷酶基因的表达载体。
上述表达宿主细胞为黑曲霉(Aspergillus niger)。
本发明提供了一种新型α-葡萄糖苷酶，并构建得到了表达该酶的黑曲霉重组菌株。本发明的α-葡萄糖苷酶的最适作用温度为60℃，且在50-65℃范围内能保持80％以上的酶活力；最适作用pH为4.5，且在pH3.0-6.0范围内能保持80％以上的酶活力。该α-葡萄糖苷酶能高效转化麦芽糖，转化产物中异麦芽糖、潘糖和异麦芽三糖的含量最高，分别达到44.1％、23.0％和21.2％，三糖总含量为88.3％。因此，本发明所述α-葡萄糖苷酶可广泛应用于低聚异麦芽糖浆的生产，市场前景广阔。
附图说明
图1：本发明构建的pGm-aglu重组表达载体质粒图谱。
图2：黑曲霉aglu发酵上清液SDS-PAGE电泳分析图，其中M所示为蛋白标准分子量标记，由上至下为116.0kD，66.2kD，45.0kD，35.0kD，25.0kD；泳道1所示为宿主菌黑曲霉G1分泌蛋白表达情况；泳道2、3、4所示为重组菌株黑曲霉aglu分泌蛋白表达情况，箭头所指90kDa处为本发明所述来源于的黑葡萄穗霉的α-葡萄糖苷酶。
图3：本发明α-葡萄糖苷酶相对酶活-温度曲线图。
图4：本发明α-葡萄糖苷酶相对酶活-pH曲线图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的α-葡萄糖苷酶进行详细的描述。
实施例1：α-葡萄糖苷酶基因的克隆
使用真菌基因组DNA提取试剂盒(Omega)从黑葡萄穗霉过夜培养物中提取基因组DNA。
以黑葡萄穗霉基因组DNA为扩增模板扩增黑葡萄穗霉中的α-葡萄糖苷酶基因，其中所用到的正向引物aGluS6480-F序列为(下划线所示序列为SnaBI酶切位点)；5′-CCATTACGTAAGA ATGAGACTTGGGCTCGCCATCCTG-3′，
反向引物aGluS6480-R序列为(下划线所示序列为XbaI酶切位点)：
5′-TGCTCTAGA TTAGAGCTCGTCCGAGCCCAACGCTTCCT-3′
将该基因用Phusion DNA聚合酶(Thermo scientific)从黑葡萄穗霉基因组DNA中扩增出来。
使用凝胶纯化试剂盒(Fermentas)将上述PCR产物纯化。用限制性内切酶SnaBI和XbaI(Fermentas)对纯化后的PCR产物进行酶切；同时，用限制性内切酶SnaBI和XbaI对质粒pGm进行酶切。使用凝胶纯化试剂盒将酶切产物纯化，并用T4DNA连接酶(Fermentas)将上述两个酶切产物连接。将连接产物转化进Trans5α大肠杆菌(Transgen)，用氨苄青霉素进行选择。为确保准确，对若干克隆进行测序(Invitrogen)。测序结果显示，黑葡萄穗霉中α-葡萄糖苷酶的基因序列为SEQ ID NO:2，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:1；多个克隆的测序结果都一致。
通过NCBI中的BLAST进行蛋白质序列比对发现，SEQ ID NO:1与现有序列有明显的区别，相似性最高仅为87％，为一新的等位基因，。
使用质粒中量制备试剂盒(Axygen)从测序结果正确的大肠杆菌克隆中纯化质粒。所得1个重组质粒命名为pGm-aglu，质粒图谱见图1。
实施例2：PEG介导的原生质体融合转化黑曲霉及验证
吸取宿主菌黑曲霉G1(Aspergillus niger G1)的孢子悬浮液于CMA平板中心(9cm培养皿)，待菌落长满整个培养皿，切1/4大小的培养基于200mL CMA液体培养基中，在30℃、200rpm的条件培养14～16h。
用无菌Miracloth滤布收集菌丝体，并用溶液A清洗一次，在无菌条件下将清洗过的菌丝体转移到40mL原生质体化溶液，在30℃、200rpm的条件下温浴1～2h，用显微镜观察检测原生质体转化进展。
用无菌Miracloth滤布过滤上述温浴液体，所得滤液即为原生质体溶液。将原生质体溶液分装于两个50mL无菌的一次性离心管中，并将每管的体积用溶液B定容至45mL，在4000rpm条件下离心8min以获得沉淀并弃去上清液。用20mL溶液B再清洗沉淀两次。将沉淀重悬浮于10mL溶液B中，并用血球计数板对原生质体计数。将原生质体再次离心并弃去上清液，根据血球计数板计数结果，加入适量溶液B重悬沉淀，使得原生质体数目在1×107个/mL左右。
在冰上，将100μL上述原生质体溶液加入预冷的无菌15mL离心管中，每个转化反应用1管，加入10μg重组质粒pGm-aglu，加入12.5μL溶液C，温和混匀后再冰上放置20min。
将MMSA顶层琼脂试管熔化并保持在55℃。从冰中移出上述15mL离心管，并向管中加入1mL溶液C和2mL溶液B，温和混匀各管，所得混合物即为原生质体混合物。向3个顶层琼脂试管中的每一个中加入1mL上述原生质体混合物，并立即倾倒与MMSA平板上，并将平板在30℃下培养7～10d至有转化子长出。
按照实施例1中的方法提取转化子基因组DNA，以此为模板，利用实施例1中引物进行PCR扩增目的基因。PCR扩增条件为98℃30s；98℃10s，53℃30s，72℃120s，30个循环；72℃10min。利用凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物并进行测序分析，经过PCR反应选育和测序验证出阳性转化子。将其中一个阳性转化子命名为黑曲霉aglu(Aspergillus niger aglu)。
溶液A：2.5mL 1M K2HPO4，2.5mL 1M KH2PO4，48.156g MgSO4，加入dlH2O至终体积500mL，用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌。
溶液B：5mL 1M Tris(pH 7.5)，2.77g CaCl2，109.32g山梨醇，加入dlH2O至终体积500mL，用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌。
溶液C：250g PEG 4000，2.77g CaCl2，5mL 1M Tris(pH 7.5)，加入dlH2O至终体积500mL，用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌。
原生质体化溶液：将0.6g裂解酶(Lysing Enzyme from Trichodermaharzianum，Sigma)溶解于40mL溶液A中，用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌。
MMSA平板：0.59g乙酰胺(Sigma)，3.4g CsCl(Sigma)，0.52g KCl，1.52gKH2PO4，218.5g山梨醇，1ml微量元素(见下)，20g琼脂，加入dlH2O至终体积972.5mL，高压蒸汽灭菌后加入用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌的25mL 40％葡萄糖和2.5mL 20％MgSO4。
MMSA顶层琼脂试管：0.59g乙酰胺(Sigma)，3.4g CsCl(Sigma)，0.52g KCl，1.52g KH2PO4，218.5g山梨醇，1ml微量元素(见下)，10g低熔点琼脂糖，加入dlH2O至终体积972.5mL，高压蒸汽灭菌后，在培养基未凝固时，加入用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌的25mL 40％葡萄糖和2.5mL 20％MgSO4，之后立即分装于无菌试管中，每管10mL。
微量元素：在250mL dlH2O中加入1g FeSO4·7H2O，8.8g ZnSO4·7H2O，0.4g CuSO4·5H2O，0.15g MnSO4·4H2O，0.1g Na2B4O7·10H2O，50mg(NH4)6Mo7O24·4H2O，0.2mL浓HCl，完全溶解后用dlH2O定容至1L，用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌。
CMA平板：20g葡萄糖，20g麦芽浸出物，1g蛋白胨，15g琼脂，加入dlH2O至终体积1000mL，高压蒸气灭菌。
CMA液体培养基：20g葡萄糖，20g麦芽浸出物，1g蛋白胨，加入dlH2O至终体积1000mL，高压蒸气灭菌。
实施例3：黑曲霉aglu的发酵和α-葡萄糖苷酶的表达
挑取实施例2获得的阳性转化子黑曲霉aglu，接种于30mL TSB发酵培养基中，在30℃，200rpm的条件下培养5d；同时，以未转化入外源基因的宿主菌黑曲霉G1为对照组，按上述相同的发酵条件进行培养；所得黑曲霉aglu和宿主菌黑曲霉G1的发酵液各用8层纱布过滤，滤液在14000g条件下离心10min，收集上清液；将上述上清液在浓度为12％的SDS-PAGE胶上进行电泳。
结果如图2所示，泳道1所示为宿主菌黑曲霉G1分泌蛋白表达情况，泳道2-4所示为重组菌株黑曲霉aglu分泌蛋白表达情况，在箭头所指90kDa处，泳道1无明显蛋白条带，而泳道2-4有一明显的蛋白条带，该蛋白条带的分子量大小与黑葡萄穗霉的α-葡萄糖苷酶的分子量预期相符，从而说明本发明构建的重组菌株黑曲霉aglu能成功表达来源于黑葡萄穗霉的α-葡萄糖苷酶。利用BCA蛋白浓度测定试剂盒(Solarbio)测定显示黑曲霉aglu的蛋白表达量约为2g/L。
TSB发酵培养基：12g NaNO3，0.5g KCl，1.5g KH2PO4，2.05g MgSO4·7H2O，3.5g NaH2PO4·H2O，45g胰蛋白大豆肉汤，70g柠檬酸钠，1g吐温80，1mL微量元素(见下)，加入dlH2O至终体积700mL，高压蒸气灭菌后加入300mL用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌的40％麦芽糖。
微量元素：在250mL dlH2O中加入1g FeSO4·7H2O，8.8g ZnSO4·7H2O，0.4g CuSO4·5H2O，0.15g MnSO4·4H2O，0.1g Na2B4O7·10H2O，50mg(NH4)6Mo7O24·4H2O，0.2mL浓HCl，完全溶解后用dlH2O定容至1L，用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌。
实施例4：α-葡萄糖苷酶酶活测定
1.酶活测定方法
取适量底物，50℃预热5min；取四支试管(一支空白管，一支样品管)，分别向四支试管中，准确加入已稀释好的酶液0.5ml，将四支试管同时置于50℃水浴中，预热2min；准确向样品中加入0.5ml底物溶液，准确计时15min；迅速、准确的向各管中加入碳酸钠2.0ml，于空白管中准确加入底物0.5ml，摇匀。以空白管调零，在分光光度计波长410nm下，用10mm比色杯，分别测量三支样品管中样液的吸光度，取平均值。通过查标准曲线或用线性回归方程求出对硝基苯酚的含量。
酶活X＝A×1/0.5×n/15
其中：X——酶活力单位,μ/g(mL)；
A——吸光度在标准曲线上查的(或计算出)的对硝基苯酚含量，μmol；
1/0.5——换算成酶液1ml；
n——稀释倍数；
15——时间换算系数；
2.酶活测定
按照上述方法，分别取1ml上述黑曲霉aglu和宿主菌黑曲霉G1的发酵上清液进行α-葡萄糖苷酶酶活测定。结果显示，宿主菌黑曲霉G1发酵上清液的酶活仅为17U/mL，而重组菌株黑曲霉aglu的酶活为523U/mL，远远高于宿主菌，从而说明重组菌株黑曲霉aglu分泌表达α-葡萄糖苷酶的量远高于宿主菌本身表达的α-葡萄糖苷酶，进一步说明黑葡萄穗霉的α-葡萄糖苷酶基因在重组菌株黑曲霉aglu中得到高效表达。
实施例5α-葡萄糖苷酶酶学性质分析
在pH4.8条件下，分别在30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃条件下测定上述发酵上清液的酶活，以最高酶活为100％，计算相对酶活。结果如图3所示，本发明所述α-葡萄糖苷酶的最适作用温度为60℃，且在50-65℃范围内能保持80％以上的酶活力。
在50℃条件下，分别用pH为2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0的缓冲液稀释上述发酵上清液，测定酶活，以最高酶活为100％，计算相对酶活。结果如图4所示，本发明所述α-葡萄糖苷酶的最适作用pH为4.5，且在pH3.0-6.0范围内能保持80％以上的酶活力。
实施例6：α-葡萄糖苷酶的应用试验
取上述黑曲霉aglu发酵液于4℃、10000rpm离心20min除菌体；上清液中加入70％固体硫酸铵盐析过夜，4℃、10000rpm离心20min，取沉淀物用适量pH 5的醋酸缓冲液溶解，并在缓冲液中透析过夜，制成α-葡萄糖苷酶粗酶液。用pH 5的醋酸缓冲液配制10％的麦芽糖溶液，加入0.5％粗制的浓缩酶液，60℃下反应24h，然后煮沸5min，微孔过滤，HPLC检测产物。
高效液相色谱分析的条件：示差折光检测器，色谱柱(I)：钙型强碱性离子交换树脂Sugar Pakl 1300mm×6.5mm；柱温：85℃；池温(检测器)：30℃；流动相：水；流速：0.5mL/min；进样量：10μl。色谱柱(II)：Hypersil NH2，250mm×4.6mm；柱温：30℃；池温(检测器)：30℃；流动相：乙腈/水(75/25V/V)；流速：1mL/min；进样量：10μl。
检测结果显示，产物中异麦芽糖、潘糖和异麦芽三糖的含量最高，分别达到44.1％、23.0％和21.2％，三糖总含量为88.3％。从而说明本发明所述α-葡萄糖苷酶能高效转化麦芽糖，可广泛应用于低聚异麦芽糖浆的生产，市场前景广阔。

Claims (7)

1.一种α-葡萄糖苷酶，其特征在于，所述的α-葡萄糖苷酶包含有：
1)氨基酸序列为SEQ ID NO：1的α-葡萄糖苷酶；
2)在1)中的氨基酸上发生取代、缺失或添加一个或数个氨基酸得到的，具有1)中α-葡萄糖苷酶活性的酶。
2.一种基因，其特征在于，所述基因编码权利要求1所述的α-葡萄糖苷酶。
3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，所述的基因的核苷酸序列为SEQID NO:2。
4.一种表达载体，其特征在于，所述的表达载体上携带有权利要求2所述的基因。
5.一种表达宿主细胞，其特征在于，所述的表达宿主细胞携带有权利要求4所述的表达载体。
6.权利要求5所述的表达宿主细胞为黑曲霉(Aspergillus niger)。
7.权利要求1所述的α-葡萄糖苷酶在生产异麦芽糖、潘糖和异麦芽三糖中的应用。
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