CN109321471A - 一种米曲霉及其在低聚异麦芽糖生产中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种米曲霉（Aspergillus oryzae）ZT65，还涉及所述米曲霉在低聚异麦芽糖生产中的应用。该米曲霉（Aspergillus oryzae）ZT65菌株所产α‑葡萄糖苷酶为胞内酶，可在55～65℃高温条件下生产有效三糖（IG+P+IG3）含量达65%以上的低聚异麦芽糖，而制备有效三糖（IG+P+IG3）含量为35%的IMO‑500型低聚异麦芽糖，所需反应时间仅为制备有效三糖（IG+P+IG3）含量达65%以上的低聚异麦芽糖反应时间的一半。本发明菌株所产α‑葡萄糖苷酶具有优良的温度特性、转苷时间短、产物有效三糖（IG+P+IG3）含量高等优点。

Description

一种米曲霉及其在低聚异麦芽糖生产中的应用
技术领域
本发明属于发酵工程技术领域，特别涉及一种高产α-葡萄糖苷酶的米曲霉（Aspergillus oryzae），以及将它用于转化淀粉糖化液或麦芽糖浆制备低聚异麦芽糖的方法。
背景技术
低聚异麦芽糖（Isomaltooligosaccharides, IMO），是目前应用最广泛、需求量最大的低聚糖类功能性甜味剂，具有低热量、抗龋齿、促进机体肠道双歧杆菌增殖等特殊生理功能，现已广泛应用于食品、医药及保健品、饲料等行业。它是由一系列聚合度为2-10的葡聚糖组成的混合物，它们的分子中均至少带有1个α-(1,6)糖苷键，其中含量较多的成分为异麦芽糖（Isomaltose，IG）、潘糖（Panose，P）和异麦芽三糖（Isomaltotriose，IG3），这三种组分称之为有效三糖，其含量高低是评价低聚异麦芽糖产品质量的主要指标，也是影响产品应用范畴和市场价格的关键因素。
α-葡萄糖苷酶（α-glucosidase，EC 3.2.1.20）是一种广泛存在于动、植物及微生物体内的外切型糖苷酶。它能识别并水解糖类、糖脂、糖肽等糖类衍生物或糖类类似物的非还原性端的α-(1,4)糖苷键，释放出D-葡萄糖；除了水解活力外，某些α-葡萄糖苷酶还在不同程度上具备催化转苷反应的能力，能将游离的葡萄糖残基转移到其它的糖类物质、糖类衍生物或糖类类似物受体底物上，形成新的糖类、糖脂或糖肽等。由黑曲霉等丝状真菌产生的α-葡萄糖苷酶能够通过其自身的转苷活力催化发酵性的糊精及低聚麦芽糖转化成非发酵性的低聚异麦芽糖，是目前低聚异麦芽糖工业生产中的关键酶。
目前，低聚异麦芽糖工业化生产采用的工艺是先将淀粉原料经液化、糖化制成麦芽糖浆后，再用α-葡萄糖苷酶进行转化制取。在这个过程中，来源于微生物菌种的α-葡萄糖苷酶，其酶活力和转化效率的高低是决定低聚异麦芽糖生产工艺复杂度和生产成本的关键因素。自然界中已发现多种微生物产生的α-葡萄糖苷酶能够用于制备低聚异麦芽糖。国内人许多学者在α-葡萄糖苷酶高产菌株选育方面做了大量工作。如华南理工大学的毕金峰等人通过测定对于麦芽糖的水解酶活的方法并结合产物的纸层析分析，从自然界中筛选α-葡萄糖苷酶高产菌株并进行了诱变育种。如中国科学院的陈必成等人通过采用层析法对α-葡萄糖苷酶反应产物进行定性定量的手段对α-葡萄糖苷酶产生菌进行筛选及诱变育种；江南大学的柯雪琴等人从霉菌中筛选出产α-葡萄糖苷酶活力较高的菌株并进行了产酶条件优化。
上述研究人员选育获得的菌株大多集中在黑曲霉种，也有少量米曲霉，所产生的α-葡萄糖苷酶多为胞外酶，生产低聚异麦芽糖的转化率较低，反应时间较长，产物中低聚异麦芽糖含量较低，只有50%左右，其中有效三糖含量也仅为35%左右，称为IMO-500型产品。为获得纯度更高的低聚异麦芽糖产品，需要在此基础上采用色谱分离等方法进行二次分离，将葡萄糖和麦芽糖从IMO-500糖浆中去除，形成IMO-900型产品，其总低聚异麦芽糖含量为90%左右，其中有效三糖含量仅为45%左右，仍无法满足高端市场的需求，此外色谱分离操作也导致生产工艺复杂化，生产成本大幅提升。
本发明人研究小组之前研究了一种黑曲霉及其在低聚异麦芽糖生产中的应用，并对此项研究申请了专利CN201510073052.6，该专利已经获得授权。但是仅靠这种黑曲霉产α-葡萄糖苷酶（胞内酶），数量太少，局限较大，不能完全满足生产低聚异麦芽糖的需求量。因此本研究的小组又继续对其他可以产生α-葡萄糖苷酶的菌株进行了研究，通过研究发现筛选出的一种米曲霉也能产α-葡萄糖苷酶（胞内酶）。
发明内容
鉴于上述菌种和生产技术的不足，本发明提供了一种高产α-葡萄糖苷酶的米曲霉（Aspergillus oryzae）并利用其制备低聚异麦芽糖的方法，使用该方法生产的低聚异麦芽糖的有效三糖含量为35～70%，适用性广，生产工艺简单，生产成本低，具有极大的应用潜力。
为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明的米曲霉，分类命名为米曲霉（Aspergillus oryzae）ZT65，保藏编号CCTCC NO:M 2014422，保藏日期为2014年9月17日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国.武汉.武汉大学。
米曲霉ZT65菌株具有下述特性：
(1)菌落形态学特征：
在PDA培养基（马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水定容至1L，自然pH）平板上32℃培养，菌落初始为白色、黄色，继而变为黄褐色、淡黄绿色，背面无色；培养至48h，菌落直径达2.5～3.0cm。光学显微镜观察，分生孢子头呈放射形，分生孢子梗顶端膨大成球形顶囊，顶囊表面长满一层或两层的初生小梗和次生小梗，分生孢子呈洋梨形。
(2)生理与生化特性：
菌株ZT65可在28～37℃下快速生长，最适培养温度为33℃；可在pH4.0～6.0范围生长，最适pH为4.5；培养基中不需要添加生长因子；可广泛利用有机碳氮源和无机碳氮源生长，营养要求简单。
(3)ITS序列分析：
利用通用扩增引物ITS1（5’-TCC GTA GGT GAA CCT GCG C-3’）和ITS4（5’-TCC TCCGCT TAT TGA TAT GC-3’）对菌株ITS序列进行扩增测序，测得序列长度548 bp。将所得序列提交至GenBank数据库，获得序列编号GenBank ID: KF879926，与GenBank所提供的基因序列进行Blast比对分析，结果表明菌株ZT65与米曲霉（Aspergillus oryzae）同源性为99%。结合菌落形态特征、生理生化特性和ITS序列分析，可以将菌株ZT65分类鉴定为米曲霉，具体为米曲霉（Aspergillus oryzae）ZT65。
本发明另外还提供了利用上述米曲霉（Aspergillus oryzae）ZT65制备低聚异麦芽糖的方法，将菌株米曲霉（Aspergillus oryzae）ZT65接种于包含碳源、氮源、无机盐和水的无菌培养基中进行培养，经离心或膜分离技术收集含α-葡萄糖苷酶的细胞，进而采用游离的或经过固定化的含α-葡萄糖苷酶的细胞转化淀粉糖化液或麦芽糖浆生产低聚异麦芽糖。
所述的培养基中各组分用量为：碳源20～100g/L，氮源10～50g/L，无机盐0～5g/L，其余为水。
所述的培养基中，所述碳源为葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、糊精、薯类淀粉和谷类淀粉中的任意一种或其组合；薯类淀粉或谷类淀粉可以是木薯淀粉、马铃薯淀粉、红薯淀粉、玉米淀粉、小麦淀粉和大米淀粉中的任意一种或两种以上组合；所述氮源为玉米浆干粉、麸皮浸汁、麦芽汁、豆粕粉、花生麸、酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、尿素、NH4Cl、(NH4)2SO4和NaNO3中的任意一种或两种以上组合；所述无机盐为钠盐、钾盐、磷酸氢盐和磷酸二氢盐中任意一种或两种以上组合。
所述米曲霉（Aspergillus oryzae）ZT65的培养条件为：初始pH值4.0～6.0，培养基装液量5～70%，接种量5～20%，搅拌速度100～600 rpm，培养温度28～37℃，培养时间12～60h。
所述膜分离技术收集含α-葡萄糖苷酶的细胞，所述膜分离技术为真空抽滤、板框过滤或超滤中的任意一种。
所述的含α-葡萄糖苷酶的细胞，其α-葡萄糖苷酶为胞内酶。
所述的含α-葡萄糖苷酶的细胞转化淀粉糖化液或麦芽糖浆高效生产低聚异麦芽糖的方法为：将游离细胞或固定化的含α-葡萄糖苷酶的细胞置于反应器中，加入固形物质量百分含量10～50%的淀粉糖化液或麦芽糖浆，反应温度45～65℃，反应时间3～24h后制得低聚异麦芽糖。
所述的淀粉糖化液是利用薯类淀粉或谷类淀粉经过α-淀粉酶或真菌淀粉酶液化，然后用β-糖化酶或真菌淀粉酶糖化制取。
所述的麦芽糖浆为市售麦芽糖浆。
所述的固定化的含α-葡萄糖苷酶的细胞是采用海藻酸钙、壳聚糖或卡拉胶的任意一种或两种以上组合作为固定化载体，以戊二醛作为交联剂制备。
利用含α-葡萄糖苷酶的细胞转化淀粉糖化液或麦芽糖浆制得的低聚异麦芽糖，有效三糖：异麦芽糖、潘糖和异麦芽三糖，即IG+P+IG3，含量为35～70%。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、本发明得到的米曲霉（Aspergillus oryzae）ZT65，其所产α-葡萄糖苷酶为胞内酶，可直接利用菌体细胞转化淀粉糖化液或麦芽糖浆高效生产低聚异麦芽糖，菌株营养要求简单、培养方法简便易行，这些优良特性为工业化生产提供了有利条件。
2、本发明提供的米曲霉（Aspergillus oryzae）ZT65，其所产α-葡萄糖苷酶可在55～65℃条件下转化底物高效合成有效三糖（IG+P+IG3）含量达65%以上的低聚异麦芽糖；而制备有效三糖（IG+P+IG3）含量为35%的 IMO-500型低聚异麦芽糖，所需反应时间仅为制备有效三糖（IG+P+IG3）含量达65%以上的低聚异麦芽糖反应时间的一半。与现有报道菌株所产α-葡萄糖苷酶，米曲霉（Aspergillus oryzae）ZT65具有独特的温度特性、转化反应时间大大缩短、产物有效三糖（IG+P+IG3）含量大幅度提高。本发明提供的米曲霉（Aspergillus oryzae）ZT65及利用其制备低聚异麦芽糖的方法，工艺简便可行、生产成本低廉，可满足工业化大规模生产，具备显著的经济效益。
3、比较于本发明人研究小组之前申请专利（一种黑曲霉及其在低聚异麦芽糖生产中的应用，CN201510073052.6）中报道的黑曲霉（Aspergillus niger）M1，本发明提供的米曲霉（Aspergillus oryzae）ZT65在相同培养条件下，其所产α-葡萄糖苷酶的酶量是黑曲霉（Aspergillus niger）M1所产酶量的2倍左右。因此，在利用米曲霉（Aspergillus oryzae）ZT65制备低聚异麦芽糖过程中，所需添加游离的或经过固定化的含α-葡萄糖苷酶的细胞量可减半，从而能够显著降低生产成本。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式并不局限于实施例表示的范围。
实施例1：米曲霉培养及其应用1
（1）菌种培养
种子培养基：玉米淀粉50g/L，玉米浆干粉20g/L，pH 4.5。
发酵培养基：玉米淀粉60g/L，玉米浆干粉30g/L，pH 4.5。
以米曲霉（Aspergillus oryzae）ZT65为发酵菌种，在32℃条件下进行摇瓶种子培养，培养基装液量10%，摇床转速200rpm，种龄12h；按接种量10%（v/v）将种子接种于发酵培养基，摇瓶培养，培养基装液量20%，摇床转速200rpm，32℃发酵36h后，发酵液经真空抽滤收集菌丝体。
（2）菌种应用
应用游离菌丝体进行转化生产低聚异麦芽糖，将固形物质量百分含量20%的木薯淀粉液化液置于反应器中，按菌体湿重10%（w/v）加入游离菌丝体，在50℃条件下，转化5h后，即得低聚异麦芽糖浆；经高效液相色谱仪测定，有效三糖（IG+P+IG3）含量为35.52%。
实施例2：米曲霉培养及其应用2
（1）菌种培养
种子培养基：玉米淀粉50g/L，玉米浆干粉20g/L，pH 4.5。
发酵培养基：玉米淀粉60g/L，玉米浆干粉30g/L，pH 4.5。
以米曲霉（Aspergillus oryzae）ZT65为发酵菌种，在32℃条件下进行摇瓶种子培养，培养基装液量10%，摇床转速200rpm，种龄12h；按接种量10%（v/v）将种子接种于发酵培养基，摇瓶培养，培养基装液量20%，摇床转速200rpm，32℃发酵36h后，发酵液经真空抽滤收集菌丝体。
（2）菌种应用
应用游离菌丝体进行转化生产低聚异麦芽糖，将固形物质量百分含量30%的市售麦芽糖浆置于反应器中，按菌体湿重15%（w/v）加入游离菌丝体，在60℃条件下，转化8h后，即得低聚异麦芽糖浆；经高效液相色谱仪测定，有效三糖（IG+P+IG3）含量为67.53%。
实施例3：米曲霉培养及其应用3
（1）菌种培养
种子培养基：玉米淀粉50g/L，玉米浆干粉20g/L，pH 4.5。
发酵培养基：玉米淀粉60g/L，玉米浆干粉30g/L，pH 4.5。
以米曲霉（Aspergillus oryzae）ZT65为发酵菌种，在32℃条件下进行摇瓶种子培养，培养基装液量10%，摇床转速200rpm，种龄12h；按接种量10%（v/v）将种子接种于发酵培养基，摇瓶培养，培养基装液量20%，摇床转速200rpm，32℃发酵36h后，发酵液经真空抽滤收集菌丝体。
(1)（2）菌种应用
应用固定化细胞进行转化生产低聚异麦芽糖，以质量浓度为3%的海藻酸钙将米曲霉（Aspergillus oryzae）ZT65游离菌丝体进行固定化。将固形物质量百分含量30%的木薯淀粉液化液置于反应器中，按20%（w/v）加入固定化细胞，在50℃条件下，转化6h后，即得低聚异麦芽糖浆；经高效液相色谱仪测定，有效三糖（IG+P+IG3）含量为42.72%。
实施例4：米曲霉培养及其应用4
（1）菌种培养
种子培养基：玉米淀粉50g/L，玉米浆干粉20g/L，pH 4.5。
发酵培养基：玉米淀粉60g/L，玉米浆干粉30g/L，pH 4.5。
以米曲霉（Aspergillus oryzae）ZT65为发酵菌种，在32℃条件下进行摇瓶种子培养，培养基装液量10%，摇床转速200rpm，种龄12h；按接种量10%（v/v）将种子接种于发酵培养基，摇瓶培养，培养基装液量20%，摇床转速200rpm，32℃发酵36h后，发酵液经真空抽滤收集菌丝体。
（2）菌种应用
应用固定化细胞进行转化生产低聚异麦芽糖，以质量浓度为3%的海藻酸钙将米曲霉（Aspergillus oryzae）ZT65游离菌丝体进行固定化。将固形物质量百分含量30%的市售麦芽糖浆置于反应器中，按25%（w/v）加入固定化细胞，在50℃条件下，转化8h后，即得低聚异麦芽糖浆；经高效液相色谱仪测定，有效三糖（IG+P+IG3）含量为53.65%。
实施例5：米曲霉培养及其应用5
（1）菌种培养
种子培养基：玉米淀粉50g/L，玉米浆干粉20g/L， pH 4.5。
发酵培养基：玉米淀粉80g/L，玉米浆干粉50g/L， pH 4.5。
以米曲霉（Aspergillus oryzae）ZT65为发酵菌种，在35℃条件下进行种子培养，培养基装液量30%，搅拌转速400rpm，种龄16h；按接种量20%（v/v）将种子接种于发酵培养基，培养基装液量50%，搅拌转速500rpm，35℃发酵48h后，发酵液经板框过滤收集菌丝体。
（2）菌种应用
应用游离菌丝体进行转化生产低聚异麦芽糖，将固形物质量百分含量30%的玉米淀粉液化液置于反应器中，按菌体湿重20%（w/v）加入游离菌丝体，在60℃条件下，转化6h后，即得低聚异麦芽糖浆；经高效液相色谱仪测定，有效三糖（IG+P+IG3）含量为49.37%。
实施例6：米曲霉培养及其应用6
（1）菌种培养
种子培养基：玉米淀粉50g/L，玉米浆干粉20g/L， pH 4.5。
发酵培养基：玉米淀粉80g/L，玉米浆干粉50g/L， pH 4.5。
以米曲霉（Aspergillus oryzae）ZT65为发酵菌种，在35℃条件下进行种子培养，培养基装液量30%，搅拌转速400rpm，种龄16h；按接种量20%（v/v）将种子接种于发酵培养基，培养基装液量50%，搅拌转速500rpm，35℃发酵48h后，发酵液经板框过滤收集菌丝体。
（2）菌种应用
应用游离菌丝体进行转化生产低聚异麦芽糖，将固形物质量百分含量40%的市售麦芽糖浆置于反应器中，按菌体湿重25%（w/v）加入游离菌丝体，在55℃条件下，转化8h后，即得低聚异麦芽糖浆；经高效液相色谱仪测定，有效三糖（IG+P+IG3）含量为62.35%。
实施例7：米曲霉培养及其应用7
（1）菌种培养
种子培养基：玉米淀粉50g/L，玉米浆干粉20g/L， pH 4.5。
发酵培养基：玉米淀粉80g/L，玉米浆干粉50g/L， pH 4.5。
以米曲霉（Aspergillus oryzae）ZT65为发酵菌种，在35℃条件下进行种子培养，培养基装液量30%，搅拌转速400rpm，种龄16h；按接种量20%（v/v）将种子接种于发酵培养基，培养基装液量50%，搅拌转速500rpm，35℃发酵48h后，发酵液经板框过滤收集菌丝体。
（2）菌种应用
应用游离菌丝体进行转化生产低聚异麦芽糖，将固形物质量百分含量50%的市售麦芽糖浆置于反应器中，按菌体湿重30%（w/v）加入游离菌丝体，在55℃条件下，转化12h后，即得低聚异麦芽糖浆；经高效液相色谱仪测定，有效三糖（IG+P+IG3）含量为70.26%。
实施例8：米曲霉培养及其应用8
（1）菌种培养
种子培养基：玉米淀粉50g/L，玉米浆干粉20g/L， pH 4.5。
发酵培养基：玉米淀粉80g/L，玉米浆干粉50g/L， pH 4.5。
以米曲霉（Aspergillus oryzae）ZT65为发酵菌种，在35℃条件下进行种子培养，培养基装液量30%，搅拌转速400rpm，种龄16h；按接种量20%（v/v）将种子接种于发酵培养基，培养基装液量50%，搅拌转速500rpm，35℃发酵48h后，发酵液经板框过滤收集菌丝体。
（2）菌种应用
应用固定化细胞进行转化生产低聚异麦芽糖，以质量浓度为2%的海藻酸钙和1%的壳聚糖将米曲霉（Aspergillus oryzae）ZT65游离菌丝体进行固定化。将固形物质量百分含量30%的玉米淀粉液化液置于反应器中，按25%（w/v）加入固定化细胞，在55℃条件下，转化10h后，即得低聚异麦芽糖浆；经高效液相色谱仪测定，有效三糖（IG+P+IG3）含量为56.33%。
实施例9：米曲霉培养及其应用9
（1）菌种培养
种子培养基：玉米淀粉50g/L，玉米浆干粉20g/L， pH 4.5。
发酵培养基：玉米淀粉80g/L，玉米浆干粉50g/L， pH 4.5。
以米曲霉（Aspergillus oryzae）ZT65为发酵菌种，在35℃条件下进行种子培养，培养基装液量30%，搅拌转速400rpm，种龄16h；按接种量20%（v/v）将种子接种于发酵培养基，培养基装液量50%，搅拌转速500rpm，35℃发酵48h后，发酵液经板框过滤收集菌丝体。
（2）菌种应用
应用固定化细胞进行转化生产低聚异麦芽糖，以质量浓度为2%的海藻酸钙和1%的壳聚糖将米曲霉（Aspergillus oryzae）ZT65游离菌丝体进行固定化。将固形物质量百分含量30%的市售麦芽糖浆置于反应器中，按25%（w/v）加入固定化细胞，在60℃条件下，转化10h后，即得低聚异麦芽糖浆；经高效液相色谱仪测定，有效三糖（IG+P+IG3）含量为68.65%。
实施例10：米曲霉培养及其应用10
(1)菌种培养
种子培养基：葡萄糖40g/L，酵母膏10g/L，NH4Cl 10g/L，Na2HPO4 2g/L，KH2PO42g/L，pH5.5。
发酵培养基：葡萄糖60g/L，酵母膏20g/L，NH4Cl 10g/L，Na2HPO4 5g/L，KH2PO4 5g/L，pH 5.5。
以米曲霉（Aspergillus oryzae）ZT65为发酵菌种，在35℃条件下进行摇瓶种子培养，培养基装液量10%，摇床转速200rpm，种龄12h；按接种量12%（v/v）将种子接种于发酵培养基，摇瓶培养，培养基装液量25%，摇床转速200rpm，35℃发酵48h后，发酵液经真空抽滤收集菌丝体。
(2)菌种应用
应用游离菌丝体进行转化生产低聚异麦芽糖，将固形物质量百分含量20%的小麦淀粉液化液置于反应器中，按菌体湿重20%（w/v）加入游离菌丝体，在60℃条件下，转化8h后，即得低聚异麦芽糖浆；经高效液相色谱仪测定，有效三糖（IG+P+IG3）含量为45.32%。
实施例11：米曲霉培养及其应用11
(1)菌种培养
种子培养基：麦芽糖50g/L，蛋白胨20g/L，尿素 10g/L，Na2HPO4 2g/L，KH2PO4 2g/L，pH5.0。
发酵培养基：麦芽糖70g/L，蛋白胨30g/L，尿素 10g/L，Na2HPO4 5g/L，KH2PO4 5g/L，pH 5.0。
以米曲霉（Aspergillus oryzae）ZT65为发酵菌种，在37℃条件下进行摇瓶种子培养，培养基装液量10%，摇床转速200rpm，种龄12h；按接种量15%（v/v）将种子接种于发酵培养基，摇瓶培养，培养基装液量20%，摇床转速200rpm，37℃发酵36h后，发酵液经超滤收集菌丝体。
(2)菌种应用
应用固定化细胞进行转化生产低聚异麦芽糖，以质量浓度为3%的海藻酸钙将米曲霉（Aspergillus oryzae）ZT65游离菌丝体进行固定化。将固形物质量百分含量20%的大米淀粉糖化液置于反应器中，按20%（w/v）加入固定化细胞，在55℃条件下，转化15h后，即得低聚异麦芽糖浆；经高效液相色谱仪测定，有效三糖（IG+P+IG3）含量为52.66%。
实施例12：米曲霉培养及其应用12
(1)菌种培养
种子培养基：蔗糖30g/L，糊精20g/L，牛肉膏 20g/L，(NH4)2SO4 10g/L，NaCl 3g/L，pH5.0。
发酵培养基：蔗糖50g/L，糊精30g/L，牛肉膏 30g/L，(NH4)2SO4 20g/L，NaCl 5g/L，pH 5.0。
以米曲霉（Aspergillus oryzae）ZT65为发酵菌种，在30℃条件下进行摇瓶种子培养，培养基装液量10%，摇床转速250rpm，种龄18h；按接种量15%（v/v）将种子接种于发酵培养基，摇瓶培养，培养基装液量30%，摇床转速250rpm，37℃发酵50h后，发酵液经超滤收集菌丝体。
(2)菌种应用
应用固定化细胞进行转化生产低聚异麦芽糖，以质量浓度为2%的海藻酸钙、0.5%的壳聚糖和0.5%的卡拉胶将米曲霉（Aspergillus oryzae）ZT65游离菌丝体进行固定化。将固形物质量百分含量10%的市售麦芽糖浆置于反应器中，按30%（w/v）加入固定化细胞，在60℃条件下，转化12h后，即得低聚异麦芽糖浆；经高效液相色谱仪测定，有效三糖（IG+P+IG3）含量为38.28%。
实施例13：米曲霉培养及其应用13
(1)菌种培养
种子培养基：大米淀粉30g/L，可溶性淀粉20g/L，麦芽汁20g/L，花生麸10g/L，NaNO33g/L，KCl 2g/L，pH 5.5。
发酵培养基：大米淀粉40g/L，可溶性淀粉40g/L，麦芽汁30g/L，花生麸10g/L，NaNO3 5g/L，KCl 5g/L，pH 5.5。
以米曲霉（Aspergillus oryzae）ZT65为发酵菌种，在35℃条件下进行摇瓶种子培养，培养基装液量5%，摇床转速220rpm，种龄24h；按接种量15%（v/v）将种子接种于发酵培养基，摇瓶培养，培养基装液量25%，摇床转速220rpm，35℃发酵60h后，发酵液经真空抽滤收集菌丝体。
(2)菌种应用
应用游离菌丝体进行转化生产低聚异麦芽糖，将固形物质量百分含量20%的大米淀粉液化液置于反应器中，按菌体湿重20%（w/v）加入游离菌丝体，在65℃条件下，转化3h后，即得低聚异麦芽糖浆；经高效液相色谱仪测定，有效三糖（IG+P+IG3）含量为35.96%。
实施例14：米曲霉培养及其应用14
(1)菌种培养
种子培养基：玉米淀粉60g/L，豆粕粉30g/L，pH 6.0。
发酵培养基：玉米淀粉100g/L，豆粕粉50g/L，pH 6.0。
以米曲霉（Aspergillus oryzae）ZT65为发酵菌种，在35℃条件下进行种子培养，培养基装液量50%，搅拌转速400rpm，种龄12h；按接种量20%（v/v）将种子接种于发酵培养基，培养基装液量60%，搅拌转速600rpm，35℃发酵48h后，发酵液经板框过滤收集菌丝体。
(2)菌种应用
应用游离菌丝体进行转化生产低聚异麦芽糖，将固形物质量百分含量35%的市售麦芽糖浆置于反应器中，按菌体湿重30%（w/v）加入游离菌丝体，在45℃条件下，转化12h后，即得低聚异麦芽糖浆；经高效液相色谱仪测定，有效三糖（IG+P+IG3）含量为42.19%。
实施例15：米曲霉培养及其应用15
(1)菌种培养
种子培养基：小麦淀粉50g/L，麸皮浸汁30g/L，pH 4.0。
发酵培养基：小麦淀粉80g/L，麸皮浸汁60g/L，pH 4.0。
以米曲霉（Aspergillus oryzae）ZT65为发酵菌种，在28℃条件下进行种子培养，培养基装液量50%，搅拌转速400rpm，种龄24h；按接种量20%（v/v）将种子接种于发酵培养基，培养基装液量60%，搅拌转速600rpm，35℃发酵60h后，发酵液经板框过滤收集菌丝体。
(2)菌种应用
应用固定化细胞进行转化生产低聚异麦芽糖，以质量浓度为2%的海藻酸钙、1%的壳聚糖和1%的卡拉胶将米曲霉（Aspergillus oryzae）ZT65游离菌丝体进行固定化。将固形物质量百分含量20%的市售麦芽糖浆置于反应器中，按30%（w/v）加入固定化细胞，在50℃条件下，转化24h后，即得低聚异麦芽糖浆；经高效液相色谱仪测定，有效三糖（IG+P+IG3）含量为58.62%。
序列表
<110> 广西大学
<120> 一种米曲霉及其在低聚异麦芽糖生产中的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 548
<212> DNA
<213> 米曲霉(Aspergillus oryzae)
<400> 1
tggatcatta ccgagtgtag ggttcctagc gagcccaacc tcccacccgt gtttactgta 60
ccttagttgc ttcggcgggc ccgccattca tggccgccgg gggctctcag ccccgggccc 120
gcgcccgccg gagacaccac gaactctgtc tgatctagtg aagtctgagt tgattgtatc 180
gcaatcagtt aaaactttca acaatggatc tcttggttcc ggcatcgatg aagaacgcag 240
cgaaatgcga taactagtgt gaattgcaga attccgtgaa tcatcgagtc tttgaacgca 300
cattgcgccc cctggtattc cggggggcat gcctgtccga gcgtcattgc tgcccatcaa 360
gcacggcttg tgtgttgggt cgtcgtcccc tctccggggg ggacgggccc caaaggcagc 420
ggcggcaccg cgtccgatcc tcgagcgtat ggggctttgt cacccgctct gtaggcccgg 480
ccggcgcttg ccgaacgcaa atcaatcttt ttccaggttg acctcggatc aggtagggat 540
gccccctg 548

Claims (10)

1.一种米曲霉，其特征在于，所述菌种的分类命名为米曲霉（Aspergillus oryzae）ZT65，保藏编号CCTCC NO: M 2014422，保藏日期为2014年9月17日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国.武汉.武汉大学。
2.根据权利要求1所述的米曲霉，其特征在于，所述米曲霉菌株具有下述特性：
（1）菌落形态学特征：
在PDA培养基平板上32℃培养，菌落初始为白色、黄色，继而变为黄褐色、淡黄绿色，背面无色；培养至48h，菌落直径达2.5～3.0cm；光学显微镜观察，分生孢子头呈放射形，分生孢子梗顶端膨大成球形顶囊，顶囊表面长满一层或两层的初生小梗和次生小梗，分生孢子呈洋梨形；
所述PDA培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水定容至1L，自然pH；
（2）生理与生化特性：
菌株ZT65可在28～37℃下快速生长；可在pH4.0～6.0范围生长；培养基中不需要添加生长因子；可广泛利用有机碳氮源和无机碳氮源生长，营养要求简单；
（3）ITS序列分析：
利用通用扩增引物ITS1（5’-TCC GTA GGT GAA CCT GCG C-3’）和ITS4（5’-TCC TCCGCT TAT TGA TAT GC-3’）对菌株ITS序列进行扩增测序，测得序列长度548 bp。
3.权利要求1或2所述的米曲霉菌株在低聚异麦芽糖生产中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：将菌株米曲霉（Aspergillus oryzae）ZT65接种于包含碳源、氮源、无机盐和水的无菌培养基中进行培养，经离心或膜分离技术收集含α-葡萄糖苷酶的细胞，进而采用游离的或经过固定化的含α-葡萄糖苷酶的细胞转化淀粉糖化液或麦芽糖浆生产低聚异麦芽糖；
所述米曲霉（Aspergillus oryzae）ZT65的培养条件为：初始pH值4.0～6.0，培养基装液量5～70%，接种量5～20%，搅拌速度100～600 rpm，培养温度28～37℃，培养时间12～60h；
所述的培养基中各组分用量为：碳源20～100g/L，氮源10～50g/L，无机盐0～5g/L，其余为水；
所述含α-葡萄糖苷酶的细胞，其α-葡萄糖苷酶为胞内酶。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述碳源为葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、糊精、薯类淀粉和谷类淀粉中的任意一种或两种以上组合；所述氮源为玉米浆干粉、麸皮浸汁、麦芽汁、豆粕粉、花生麸、酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、尿素、NH4Cl、(NH4)2SO4和NaNO3中的任意一种或两种以上组合；所述无机盐为钠盐、钾盐、磷酸氢盐和磷酸二氢盐中任意一种或两种以上组合。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：膜分离技术收集含α-葡萄糖苷酶的细胞，所述膜分离技术为真空抽滤、板框过滤或超滤中的任意一种。
7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述的含α-葡萄糖苷酶的细胞转化淀粉糖化液或麦芽糖浆高效生产低聚异麦芽糖的方法为：将游离细胞或固定化的含α-葡萄糖苷酶的细胞置于反应器中，加入固形物质量百分含量10～50%的淀粉糖化液或麦芽糖浆，反应温度45～65℃，反应时间3～24h后制得低聚异麦芽糖。
8.根据权利要求4或7所述的应用，其特征在于：所述的淀粉糖化液是利用薯类淀粉或谷类淀粉经过α-淀粉酶或真菌淀粉酶液化，然后用β-糖化酶或真菌淀粉酶糖化制取；所述的麦芽糖浆为市售麦芽糖浆。
9.根据权利要求4或7所述的应用，其特征在于：固定化的含α-葡萄糖苷酶的细胞是采用海藻酸钙、壳聚糖或卡拉胶的任意一种或两种以上组合作为固定化载体，以戊二醛作为交联剂制备。
10.根据权利要求4或7所述的应用，其特征在于：利用含α-葡萄糖苷酶的细胞转化淀粉糖化液或麦芽糖浆制得的低聚异麦芽糖，有效三糖：异麦芽糖、潘糖和异麦芽三糖，即IG+P+IG3，含量为35～70%。
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