CN105087519B

CN105087519B - 基因工程菊粉酶及其以菊芋为原料制备结晶果糖的方法

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Publication number: CN105087519B
Application number: CN201510618315.7A
Authority: CN
Inventors: 田康明; 王君; 王正祥
Original assignee: Tianjin University of Science and Technology
Current assignee: Senda Tianjin Biotechnology Co ltd
Priority date: 2015-09-24
Filing date: 2015-09-24
Publication date: 2018-11-02
Anticipated expiration: 2035-09-24
Also published as: CN105087519A

Abstract

本发明涉及酶的基因工程技术领域，具体涉及由基因工程重组菊粉酶I和菊粉酶II复配获得的复合酶制剂，及其用于以菊芋为原料制造高品质结晶果糖的技术。本发明通过将菊粉酶I和菊粉酶II以三种方式串联表达，再通过将三种重组酶合理的复配获得复合酶制剂。同时，建立了菊芋为原料生产高品质结晶果糖的酶解工艺，克服了单一菊粉酶作用时间长，效率低，或不能最终形成高含量的单一果糖的缺点，迅速高效的形成含量高达96％以上的果糖，再通过葡萄糖氧化酶和Ca²⁺将葡萄糖去除，得到100％结晶果糖。该工艺简单，节约经济成本，是一种生产结晶果糖的新工艺。采用本发明方法得到的结晶果糖产品，可广泛应用于医药、食品、饲料等重要领域。

Description

基因工程菊粉酶及其以菊芋为原料制备结晶果糖的方法

技术领域

本发明属于酶的基因工程技术领域，具体涉及一种基因工程菊粉酶的复合酶制剂的高效制备方法及其用于以菊芋为原料制造高品质结晶果糖的技术。

背景技术

果糖是葡萄糖的同分异构体，是糖类中化学活性最高的糖，但其甜度为蔗糖的1.8倍(葡萄糖甜度为蔗糖的0.8倍左右)，在人体内的代谢比葡萄糖快，容易被机体吸收，且不依赖胰岛素，对血糖影响很小，适用于葡萄糖代谢及肝功能不全的患者补充能量，同时它还具有促进益生菌繁殖，改善肠功能和代谢，不致龋齿等特性。因其具有低热量性，不引起血糖升高，不刺激胰岛素分泌，与脂肪同食，可抑制人体脂肪的过量储存，以及抑制龋齿，促进钙的吸收等特性成果了高端食用糖产品，可广泛应用于各类食品及医药保健品中。尤其是结晶果糖，是糖尿病、心血管和肝脏病人良好的营养甜味品。

目前国内市场上的果糖产品，主要以果葡糖浆等形式存在，高纯度的结晶果糖由于技术限制，价格较高，产量相对较少。近年来，大量的临床科学研究的证实，高纯度的结晶果糖在人体代谢上有着独特的功效。但结晶果糖作为一种重要的营养甜味剂，难以用于各种食品配方中，原因是价格昂贵。其原因是我国果糖工业化生产技术尤其是结晶果糖生产技术较落后，生产规模不大，在我国才刚刚起步。

菊粉(Inulin)又称菊糖，主要来源于菊芋、菊苣等植物，是由D-呋喃果糖分子经β-2,1糖苷键脱水聚合而成的线性直链多糖，其还原端含有一个葡萄糖残基，呈直链结构，聚合度通常在2～60，分子量为3000～5000碳单位，是一种功能性果聚糖和水溶性膳食纤维。菊粉作为一种纯天然的功能性食品配料，已被世界20多个国家批准为营养增补剂，广泛运用于乳制品、饮料、低脂低热量食品、焙烤食品、保健食品等。2009年，中国卫生部批准菊粉为新资源食品。

目前报道产菊粉酶的微生物包括鲁维酵母属、海洋酵母属、青霉属、曲霉属、芽孢杆菌属、梭状芽孢杆菌属、节杆菌属、放线菌属等，其中产菊粉酶的微生物主要集中在酵母菌属、青霉属和曲霉属。但是通过野生型筛选、理化诱变和工艺条件优化的手段得到的菊粉酶普遍活力不高。基因工程手段是提高菊粉酶活性的有效途径之一。利用生物信息学技术获得菊粉酶基因inuI和inuII的结构和氨基酸序列，将其高效表达于基因工程酵母菌中，实现菊粉酶的高效表达。

目前结晶果糖在工业上的生产方法按原料来源有三种：(1)以蔗糖为原料，经过水解得到果葡糖液(其中果糖含量为46％～50％)，经色谱分离，将果糖和葡萄糖分开，得到高纯度的果糖液(果糖含量90％以上)，将高纯果糖经过离子交换和浓缩结晶，得到结晶果糖。(2)以玉米淀粉生成葡萄糖为原料，通过葡萄糖异构酶进行异构化反应，得到果葡糖液(其中果糖含量为42％左右)，经色谱分离，将果糖和葡萄糖分开，得到高纯度的果糖液(果糖含量90％以上)，再将高纯度果糖液经过离子交换和浓缩结晶，得到结晶果糖。(3)以菊糖为原料，将菊糖经过水解得到100％果糖液，将果糖液经过离子交换浓缩结晶，得到结晶果糖。前两种生产方法实质上很相似，但是结晶果糖产率都很低，一般为葡萄糖或蔗糖投料量的20％～26％，生产结晶果糖后的大量葡萄糖组分及果糖母液无法得到有效的利用，造成生产成本高。故采用第三种方法可以提高高价值结晶果糖产品的产率，从而大幅提高经济效益，是目前果糖生产工艺研究、开发和改革的主要内容，对促进我国结晶果糖研究和国民经济发展具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种复合酶制剂的高效制备方法及其用于以菊芋为原料制备高品质结晶果糖的技术。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

首先本发明提供一种重组基因工程菌，所述重组菌包含核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的菊粉酶基因inuI和核苷酸序列如所示SEQ ID NO:2所示的菊粉酶基因inuII，以及上述基因在同一宿主细胞中的串联表达。

进一步地，本发明所用的宿主细胞可以是毕赤酵母、枯草芽胞杆菌、谷氨酸棒杆菌、大肠杆菌、地衣芽胞杆菌、酿酒酵母或黑曲霉中的一种，优选毕赤酵母或酿酒酵母。

进一步地，本发明提供一种以毕赤酵母菌为宿主细胞的a：优先表达菊粉酶I的重组酵母菌，或b：优先表达菊粉酶II的重组酵母菌，或c：无序表达菊粉酶I和菊粉酶II的重组酵母菌。

更进一步地，本发明提供一种以毕赤酵母菌GS115为宿主细胞，以质粒pPIC9K为表达载体的a：优先表达菊粉酶I的重组酵母菌P.pastoris GS115/pPIC9K-inuI-inuII，或b：优先表达菊粉酶II的重组酵母菌P.pastoris GS115/pPIC9K-inuII-inuI，或c：无序表达菊粉酶I和菊粉酶II的重组酵母菌P.pastoris GS115/pPIC9K-inuI/inuII。

进一步地，本发明还提供由上述重组酵母菌发酵生产的重组菊粉酶及其发酵制备方法。

进一步地，本发明提供一种复合酶制剂及其高效制备方法，由上述重组酵母菌分别发酵生产的重组菊粉酶中至少两种进行合理复配而成。

更进一步地，复合酶由上述a、b、c三种重组菌中至少两种菌所生产的重组菊粉酶按照酶活比为1-10:10-1或1-10:1-10:1-10复配而成。

进一步地，本发明提供一种利用上述重组菊粉酶或复合酶制剂以菊芋为原料生产高品质结晶果糖的方法，包括菊粉酶的酶解催化方法、葡萄糖的高效分离方法和高效分解或代谢方法。具体包括步骤如下：将菊芋经过干燥粉碎、打浆、水浴浸提、除杂脱色得到浸提液，调节pH 3.8～7.9，按每kg菊芋添加权利要求7所述复配酶总酶活650000～2000000U，控制温度在20～80℃，搅拌速度在150～200r/min的条件下反应4～12h，当寡聚糖全部酶解为单糖时，停止反应，进一步按水解液中的每kg葡萄糖添加1000～9000U的葡萄糖氧化酶，再加入葡萄糖当量的Ca²⁺，沉淀去除葡萄糖，再将水解物进行浓缩结晶。利用上述方法可以制备出100％含量的结晶果糖产品。

本发明的有益效果主要体现在：

本发明中所使用的复合酶制剂具备高效酶解菊芋直接形成果糖的特点，且所使用的复合酶制剂的制备方法可以获得催化活性显著的复合酶。

本发明复合酶制剂的制备方法，特别是两个或两个以上关键酶的串联表达方法可以充分利用两种酶共同作用时的高效性弥补单一酶作用时催化活性不高的不足。

本发明复合酶制剂的制备方法，特别是两个或多个关键酶的合理复配可以充分利用酶促反应的动力学特性，大幅度提升菊芋作为原料直接水解为果糖的效率。

本发明所涉及的菊芋为原料制备结晶果糖的技术包括了副产物葡萄糖的有效去除方法，保证了结晶果糖的高品质。

本发明形成的结晶果糖的酶解工艺是一种新工艺，采用该工艺制备结晶果糖具有一次性加酶、工艺简单等特点，可以大大降低操作难度，节约经济成本。

本发明高品质结晶果糖的制备工艺，可以实现10吨到30吨及更大规模的高品质结晶果糖的高效制备过程。

附图说明

图1：菊粉酶I和菊粉酶II的串联表达方式；

图2.：结晶果糖产品的成分分析；

图3.：结晶果糖的制备工艺流程图。

具体实施方式

下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。

实施例中涉及到的培养基配方(单位为w/v)如下：

(1)LB液体培养基：蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，NaCl 1％，其余为水，pH 7.0。

(2)PDA培养基：马铃薯200g切小块，煮沸后再煮30min，纱布过滤后定容1L使用。使用时按葡萄糖20g/L，琼脂20g/L加入。

(3)YPD培养基：酵母提取物1％,蛋白胨2％,葡萄糖2％，其余为水，制作平板时加入2％的琼脂粉。121℃高压灭菌20min。用于筛选G418抗性时加入G418至终浓度为0.25mg/mL～2.0mg/mL，即YPD-G418平板。

(4)MD培养基：YNB 1.34％，生物素4×10^-5％，葡萄糖2％，琼脂2％，其余为水。

(5)BMGY培养基：酵母提取物1％，蛋白胨2％，YNB 1.34％，生物素4×10^-5％，甘油1％，磷酸钾溶液100mmol/L，其余为水。

(6)BMMY培养基：酵母提取物1％，蛋白胨2％，YNB 1.34％，生物素4×10^-5％，甲醇0.5％，磷酸钾溶液100mmol/L，其余为水。

(7)BSM培养基组成(g/L)：磷酸(85％)2.67mL/L，硫酸钙1.18，硫酸钾18.2，硫酸镁7.27，氢氧化钾4.13，甘油(50％)40.0，其余为水。

实施例中涉及到的百分号“％”，若未特别说明，指质量百分比，溶液的百分比指100ml中含有溶质的克数，液体之间的百分比，是指在25℃时溶液的体积比例。

首先通过五种表达方式获得五种重组酶(I，II，III，IV，V)。然后两两组合获得最佳复配比，并获得一种复合酶InuXX。最后形成酶的制备工艺及制糖工艺。实施方案概述如下：

1)从黑曲霉中克隆两个菊粉酶基因inuI和inuII。

2)通过在毕赤酵母中的单独表达和串联表达获得五种产酶菌株P.pastorisGS115/pPIC9K-inuI，P.pastoris GS115/pPIC9K-inuII，P.pastoris GS115/pPIC9K-inuI-inuII，P.pastoris GS115/pPIC9K-inuII-inuI，P.pastoris GS115/pPIC9K-inuI/inuII。

3)制备上述五个菌株对应的重组酶酶液并进行两两复配形成复配酶，将菊粉用磷酸盐缓冲液配制成浓度为70～90％的pH 5～7的菊粉溶液，按每kg菊粉添加总酶活为8000～24000U的一种或复配后的菊粉酶，60～80℃反应水解，通过检测产物中果糖转化率获得一种最优方式复配的复合酶InuXX。

4)通过大规模发酵体系下制备对应的重组酶，并按照上述复合酶InuXX的复配比例进行复配。

5)使用上述制备的复合酶InuXX，建立水解菊芋制备果糖的方法。

6)对上述制备的果糖进行葡萄糖及其他杂质的去除，建立高品质结晶果糖的制备工艺。

实施例1：菊粉酶I和菊粉酶II的单独表达

(1)菊粉酶I的单独表达

表达载体的构建与鉴定：将黑曲霉在PDA固体培养基上划线活化，培养5d。挑取孢子接种到YPD培养基中，在28℃的摇床上培养20～24h，收集菌体。采用TRNzol总RNA提取试剂提取黑曲霉的总RNA。以总RNA为模板，参照RT-PCR试剂盒说明书，以oligo(dT)为引物逆转录合成第一链cDNA，然后分别以第一链cDNA为模板，使用引物F1(SEQ ID NO:3)和R1(SEQID NO:4)进行PCR扩增出菊粉酶I的基因(即菊粉酶基因inuI，核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示)。PCR反应条件如下：94℃预变性5min；94℃30s，61℃30s，72℃2min，30个循环；72℃延伸10min。将PCR产物与质粒pPIC9K分别用SnaB I和Avr II进行酶切、纯化，再进行连接，转化Escherichia coli JM109感受态细胞。用含有卡那霉素的LB固体培养基筛选阳性转化子，并提取其质粒，用限制性内切酶酶切进行验证。

毕赤酵母的遗传转化及筛选：将构建成功的重组质粒pPIC9K-inuI用Sal I进行单酶切线性化。酶切产物经纯化回收后电转化转化毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115，均匀涂布于MD平板，30℃恒温培养至单菌落形成。挑取多个单克隆重组酵母分别接种于终浓度为0.5、2mg/mL的YPD/G418平板上进行筛选，30℃培养箱培养至长出单菌落，挑取生长情况好的重组酵母菌株保存，命名为P.pastoris GS115/pPIC9K-inuI，其所产重组酶命名为菊粉酶I。

(2)菊粉酶II的单独表达

按照上述方法，以第一链cDNA为模板，使用引物F2(SEQ ID NO:5)和R2(SEQ IDNO:6)扩增菊粉酶II的基因(即菊粉酶基因inuII，核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示)，并将其克隆入表达载体pPIC9K的SnaB I和Avr II两个位点，构建重组质粒pPIC9K-inuII。重组质粒pPIC9K-inuII用Sal I进行单酶切线性化，酶切产物经纯化回收后电击转化P.pastorisGS115，筛选获得的重组菌命名为P.pastoris GS115/pPIC9K-inuII，其所产菊粉酶命名为菊粉酶II。

实施例2：菊粉酶I和菊粉酶II的串联表达

分别按照图1所示的三种方式构建菊粉酶I和菊粉酶II串联表达的重组菌。具体构建方式如下：

(1)构建优先表达菊粉酶I的重组菌。

按照图1a的方式，以重组质粒pPIC9K-inuII为模板，以F3(SEQ ID NO:7)和R3(SEQID NO:8)为引物进行PCR扩增。扩增得到的DNA片段用Avr II和Not I进行双酶切、纯化，再与经过相应酶切的重组质粒pPIC9K-inuI连接，转化大肠杆菌JM109感受态细胞，构建重组质粒pPIC9K-inuI-inuII。重组质粒pPIC9K-inuI-inuII用Sal I进行单酶切线性化，酶切产物经纯化回收后电击转化P.pastoris GS115，按照实施例1的方式进行转化和筛选，获得重组毕赤酵母P.pastoris GS115/pPIC9K-inuI-inuII，其所产的重组酶命名为菊粉酶III。

(2)构建优先表达菊粉酶II的重组菌。

按照图1b的方式，以重组质粒pPIC9K-inuI为模板，以F3(SEQ ID NO:7)和R4(SEQID NO:9)为引物进行PCR扩增。扩增得到的DNA片段用Avr II和Not I进行双酶切、纯化，再与经过相应酶切的重组质粒pPIC9K-inuII连接，转化大肠杆菌JM109感受态细胞，构建重组质粒pPIC9K-inuII-inuI。重组质粒pPIC9K-inuII-inuI用Sal I进行单酶切线性化，酶切产物经纯化回收后电击转化P.pastoris GS115，按照实施例1的方式进行转化和筛选，获得重组毕赤酵母P.pastoris GS115/pPIC9K-inuII-inuI，其所产的重组酶命名为菊粉酶IV。

(3)构建菊粉酶I和菊粉酶II无序表达的重组菌。

按照图1c的方式，以重组质粒pPIC9K-inuII为模板，以F4(SEQ ID NO:10)和R3(SEQ ID NO:8)为引物进行PCR扩增。扩增得到的DNA片段用Avr II和Not I进行双酶切、纯化，再与经过相应酶切的重组质粒pPIC9K-inuI连接，转化大肠杆菌JM109感受态细胞，构建重组质粒pPIC9K-inuI/inuII。重组质粒pPIC9K-inuI/inuII用Sal I进行单酶切线性化，酶切产物经纯化回收后电击转化P.pastoris GS115，按照实施例1的方式进行转化和筛选，获得重组毕赤酵母P.pastoris GS115/pPIC9K-inuI/inuII，其所产的重组酶命名为菊粉酶V。

实施例3：摇瓶条件下五种重组菌发酵产重组酶

挑取获得的重组菌五种产酶菌株P.pastoris GS115/pPIC9K-inuI，P.pastorisGS115/pPIC9K-inuII，P.pastoris GS115/pPIC9K-inuI-inuII，P.pastoris GS115/pPIC9K-inuII-inuI，P.pastoris GS115/pPIC9K-inuI/inuII的单菌落分别接种到50mL含有50μg/mL卡那霉素的YPD液体培养基中培养过夜。按1％～5％的接种量接入50mL BMGY液体培养基中培养至OD₆₀₀＝2～6(约16～18h)，然后以相同的接种量接种于1/5～1/10体积的BMMY培养基中进行诱导表达，具体参照Invitrogen公司提供的操作手册。同时接种转化空载体的酵母菌株为对照。摇瓶培养条件为30℃、200r/min，每隔24h添加0.5％的甲醇，并取样分别进行酶活测定和酶样制备。

菊粉酶活力的测定方法为HPLC法：取酶液1mL加9mL 2％菊粉(购买于Sigma-Aldrich公司)溶液，在37℃、pH＝5.0的条件下，反应10min，取反应液0.5mL沸水浴加热10min灭活，用流动相进行适当稀释，用HPLC测定果糖和葡萄糖的生成量。查对果糖和葡萄糖的标准曲线并计算，获得菊粉酶的酶活。

酶活力单位定义：在37℃、pH＝5.0的条件下，1mL酶液在1h内水解菊芋果聚糖产生1μmol的还原糖(含果糖和葡萄糖)定义为一个酶活力单位(U)。

实施例4：筛选最优的重组酶复配比例获得复合酶InuXX。

将菊粉酶III、IV、V按照酶活比为1～10:10～1的比例进行复配催化底物。然后将菊粉用10～50mM、pH 5.0～7.0的磷酸盐缓冲液配制成浓度为70～90％(w/v)的pH 5～7的菊粉溶液；按每kg菊粉添加总酶活为24000U的一种或复配后的菊粉酶。控制温度在65±1℃，搅拌速度在150～200r/min的条件下反应4～12h，通过HPLC检测全部寡聚糖酶解为单糖，二糖以上的糖成分消失作为反应终点。进一步按水解液中的每kg葡萄糖添加9000U的葡萄糖氧化酶(购买于诺维信公司)，再加入葡萄糖当量的Ca²⁺，沉淀去除葡萄糖，再将水解物进行浓缩，按照实施例3中的方法检测产物中果糖含量，其中一个样品的HPLC检测结果如图2所示。另外，单酶和一部分复配方式下产物中果糖的含量(产物果糖占投料菊粉的质量百分比)如表1所示：

表1：不同复配方式下产物中果糖的含量

其中，重组酶III和重组酶V按照1：1的配比组合的复合酶方式即可制备最优的复合酶InuXX。其催化菊芋制备果糖的比例高达96.6％。

实施例5：重组菌25L发酵系统发酵工艺的建立

菌株P.pastoris GS115/pPIC9K-inuI-inuII、P.pastoris GS115/pPIC9K-inuII-inuI和P.pastoris GS115/pPIC9K-inuI/inuII甘油管接种YPD平板，30℃培养40h；单菌落接种YPD液体培养基，250mL三角瓶装液量30mL，30℃培养温度下200r/min摇床培养40h，菌悬液为一级种子；5mL上述菌悬液接种二级种子培养基(液体YPD)，500mL三角瓶装液量100mL，30℃培养温度下200r/min摇床培养16h，OD₆₀₀测定为10时，600mL用于发酵罐接种。

发酵罐准备：按照11L初始装液量配制发酵培养基(BSM)，氨水调节pH至5.0,搅拌充分后，121℃30min灭菌。同时准备补料瓶等。并配制50％甘油5.5L用于补料。

接种：接种时，将600mL种子悬液和131.59mL微量元素PTM1母液加入罐中并开始发酵，发酵温度为30℃，pH维持5.0。DO维持20％以上。

菌体生长阶段：发酵培养基中含4％的甘油可以用于菌体生长约20h，甘油耗尽后，DO会快速上升，随即进入补料生长阶段。

补料生长阶段：流加50％甘油(每升甘油中事先添加了12mL微量元素母液)。初始流加速度为3.0～9.0mL/min。当DO低于20％时停止流加。待甘油再次耗尽，DO快速上升后，使菌体保持饥饿状态1h，然后进入诱导产酶阶段。

诱导产酶阶段：流加甲醇(每升甲醇中事先添加了12mL微量元素母液)。初始流加速率为1.2～3.6mL/min。当DO低于20％时停止流加。待甲醇耗尽，DO快速上升后，重新开始流加，流加速率提高至3.6～7.3mL/min。2h后流加甲醇速率提高至7.3～10.9mL/min。诱导70～96h后发酵结束。菊粉酶III，菊粉酶IV和菊粉酶V发酵结束的酶活分别达到23000～26000U/mL，12000～15000U/mL和32000～35000U/mL。

实施例6：在30m³体系下菊粉酶的制备工艺

将实施例5的工艺调整为30m³发酵体系对应的比例，同步换算补料速率和甲醇流加速率。分别完成种子培养，接种一级种子罐，移种二级种子罐，主发酵罐移种等操作后，培养菌体，经补料生长阶段后，诱导产酶。诱导70～96h后发酵结束。发酵液经板框过滤除去菌体，超滤膜浓缩酶液至合适浓度，添加辅助制剂后精滤制备菊粉酶液体成品。或添加适量食品级淀粉后喷雾干燥制备粉末剂型菊粉酶成品。按照实施例3的方法测定菊粉酶成品的酶活。菊粉酶III，菊粉酶IV和菊粉酶V发酵结束的酶活分别达到27000～29000U/mL，16000～20000U/mL和36000～38000U/mL。

实施例7：利用复配酶大宗制备在30m³制糖体系下制备结晶果糖的工艺

15吨新鲜菊芋经洗涤、切片，然后用80℃以上的热水烫漂灭酶，干燥得菊芋干片。菊芋干片粉碎成粉末直接打浆或浸泡1～3h后打浆，然后15～45℃水浴浸提2～8h，板框过滤收集清液。所得清液即为粗菊芋提取液。将提取液经碱处理除杂并脱色，用于后续酶解过程，具体工艺流程见图3。

将上述制备的菊芋浸提液调节pH 5～7，按每kg菊芋添加复配菊粉酶(比例为酶III:酶V＝1:1)总酶活1900000U。控制温度在60～80℃，搅拌速度在150～200r/min的条件下反应4～12h，当寡聚糖全部酶解为单糖时，停止反应。进一步按水解液中的每kg葡萄糖添加8000U的葡萄糖氧化酶(购买于诺维信公司)，再加入葡萄糖当量的Ca²⁺，沉淀去除葡萄糖，再将水解物进行浓缩，结晶即为100％结晶果糖产品。

Claims

1.一种重组基因工程菌，其特征在于，所述重组菌包含核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的菊粉酶基因inuI和核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的菊粉酶基因inuII，以及上述基因在同一宿主细胞中的串联表达；

所述重组菌是以毕赤酵母菌GS115为宿主细胞以质粒pPIC9K为表达载体的

a：优先表达菊粉酶I的重组酵母菌P.pastoris GS115/pPIC9K-inuI-inuII，

或b：优先表达菊粉酶II的重组酵母菌P.pastoris GS115/pPIC9K-inuII-inuI，

或c：无序表达菊粉酶I和菊粉酶II的重组酵母菌P.pastoris GS115/pPIC9K-inuI/inuII。

2.权利要求1所述重组基因工程菌的构建方法，包括如下步骤：

(1)从黑曲霉中克隆得到两个菊粉酶基因inuI和inuII，分别与质粒pPIC9K进行酶切连接得到重组质粒pPIC9K-inuI和pPIC9K-inuII；

(2)以重组质粒pPIC9K-inuII为模板，以核苷酸序列如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示的引物进行PCR扩增，得到的DNA片段与重组质粒pPIC9K-inuI进行酶切、连接，构建重组质粒pPIC9K-inuI-inuII，重组质粒pPIC9K-inuI-inuII用Sal I进行单酶切线性化，酶切产物经纯化回收后电击转化入毕赤酵母获得重组菌P.pastoris GS115/pPIC9K-inuI-inuII；

(3)以重组质粒pPIC9K-inuI为模板，以核苷酸序列如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:9所示的引物进行PCR扩增，得到的DNA片段与重组质粒pPIC9K-inuII进行酶切、连接，构建重组质粒pPIC9K-inuII-inuI，重组质粒pPIC9K-inuII-inuI用Sal I进行单酶切线性化，酶切产物经纯化回收后电击转化入毕赤酵母获得重组菌P.pastoris GS115/pPIC9K-inuII-inuI；

(4)以重组质粒pPIC9K-inuII为模板，以核苷酸序列如SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:8所示的引物进行PCR扩增，得到的DNA片段与重组质粒pPIC9K-inuI进行酶切、连接，构建重组质粒pPIC9K-inuI/inuII，重组质粒pPIC9K-inuI/inuII用Sal I进行单酶切线性化，酶切产物经纯化回收后电击转化入毕赤酵母获得重组菌P.pastoris GS115/pPIC9K-inuI/inuII。

3.权利要求1所述重组菌在发酵生产菊粉酶中的应用。

4.利用权利要求1所述重组菌发酵生产菊粉酶的方法，其特征在于，发酵培养基组成：85％磷酸2.67mL/L，硫酸钙1.18g/L，硫酸钾18.2g/L，硫酸镁7.27g/L，氢氧化钾4.13g/L，50％甘油40.0g/L，其余为水；发酵温度为30℃，pH维持5.0，DO维持20％以上；甘油耗尽后，DO会快速上升，进入补料生长阶段：流加50％甘油，初始流加速度为3.0～9.0mL/min，当DO低于20％时停止流加；待甘油再次耗尽，DO快速上升后，使菌体保持饥饿状态1h，然后进入诱导产酶阶段：流加甲醇，初始流加速率为1.2～3.6mL/min，当DO低于20％时停止流加；待甲醇耗尽，DO快速上升后，重新开始流加，流加速率提高至3.6～7.3mL/min，2h后流加甲醇速率提高至7.3～10.9mL/min，诱导70～96h后发酵结束。

5.一种复合酶，由权利要求1所述a、b、c三种重组菌中的两种菌所生产的重组菊粉酶按照酶活比为1-10:10-1复配而成。

6.如权利要求5所述的复合酶，其特征在于，所述复合酶为权利要求1所述a、c两种重组菌生产的重组菊粉酶以酶活比为1:1复配而成。

7.权利要求5所述复合酶在催化菊芋生产结晶果糖中的应用。

8.利用权利要求5所述复合酶催化菊芋生产结晶果糖的方法，包括步骤如下：将菊芋经过干燥粉碎、打浆、水浴浸提、除杂脱色得到浸提液，调节pH 5～7，按每kg菊芋添加权利要求5所述复合酶总酶活1900000U，控制温度在60～80℃，搅拌速度在50～200r/min的条件下反应4～12h，当寡聚糖全部酶解为单糖时，停止反应，进一步按水解液中的每kg葡萄糖添加8000U的葡萄糖氧化酶，再加入葡萄糖当量的Ca²⁺，沉淀去除葡萄糖，再将水解物进行浓缩，结晶即为100％结晶果糖产品。