CN101914589A - 利用微生物生产低聚木糖的新方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种利用微生物生产低聚木糖的新方法，该方法以玉米芯为原料，经粉碎、加水后进行酸化和高温裂解处理得到原料混合液，直接接种黑曲霉(Aspergillus niger U8-7)的发酵培养物，进行微生物诱导产酶酶解，再经分离、除杂、脱色、脱盐、过滤、浓缩、喷雾干燥，获得低聚木糖成品。本发明省去了生产木聚糖酶的生产环节，降低了生产成本，低聚木糖的产出率明显提高。

Description

利用微生物生产低聚木糖的新方法

技术领域

本发明属于微生物酶工程技术应用领域，用于以玉米芯为原料生产低聚木糖，特别涉及利用微生物生产低聚木糖的新方法。

背景技术

低聚木糖，又称木寡糖，是由2-7个木糖分子以β-1，4糖苷键连接而成的低聚糖，以木二糖和木三糖为主。低聚木糖天然存在于竹根、水果、蔬菜、牛乳和蜂蜜中，但含量都非常少。用于生产低聚木糖的主要原料有硬木、玉米芯、锯屑、蔗渣、甜菜渣、谷壳、麸皮等。低聚木糖的甜度约为蔗糖的40％，甜味纯正，干品呈浅褐色或淡黄色粉末状，在PH 0.8-1.5时不降解，酸稳定性极高，不吸湿返潮，流动性颇佳，并具有优良的生理活性和良好的热稳定性，是目前所有低聚糖中增殖双歧杆菌效价比最高的益菌因子，被称为“超强双歧因子”，其功效是大豆低聚糖、低聚果糖、低聚异麦芽糖等其他聚合糖类的10-20倍。低聚木糖活化益生菌的用量最小，被公认为是功能性最强、应用范围最广的功能性低聚糖之一。从20世纪60年代起，低聚木糖的制备就成为世界各国研发的热点，但在相当长一段时间内未解决其生产问题，直到1989年日本三得利(Suntory)公司取得关键性技术突破，实现了低聚木糖工业化生产，并被广泛应用于食品工业、医药保健品等行业中。低聚木糖作为饲料添加剂的研究要晚一些，相关研究结果表明，低聚木糖在动物体内表现出高选择性促进双歧杆菌增殖的显著功能，可促进动物消化道内有益菌的繁殖、抑制有害菌生长、改善微生物菌群平衡、防止病原菌定值肠道以减少其对动物机体造成的毒害；可激活或促进动物机体细胞和体液的免疫功能、减少血氨浓度、提高免疫力和抗体反应能力，从而加强疫苗的保护效能；同时，低聚木糖对大肠杆菌、沙门氏菌有较好的抑制作用，可预防和防止腹泻；双歧杆菌发酵低聚木糖产生大量的短链脂肪酸(醋酸、乳酸)，能刺激肠道蠕动，增加粪便湿润度，并保持一定的渗透压，从而防止便秘的发生；另外，低聚木糖的加入可起到改善饲料利用率、增进矿物质吸收、提高动物生产性能以及替代抗生素的多种功效。低聚木糖在饲料中综合效能的表现使其成为近几年饲料添加剂的主要研究方向之一，尤其是随着对滥用抗生素带来越来越大的副作用的研究的深入，许多国家纷纷立法禁止抗生素作为饲料添加剂使用，而具有抗生素替代作用的微生态制剂的益生菌和益生元成为各国饲料工业中的研究热点。低聚木糖属于益生元(Prebiotics)类，它为消化道已有的有益细菌直接提供可发酵底物，使有益菌-双歧杆菌大量增加，进而调节消化道的微生态平衡，对于动物健康和生产性能的促进作用可以部分或全部替代抗生素。

我国对低聚木糖的研究及生产起步较晚，在“八五”、“九五”期间立项进行研究和攻关，到2000年才首次实现低聚木糖工业化生产，成为世界上第二个可以规模生产高纯度低聚木糖的国家，此时世界主要发达国家的低聚木糖年产量已达到30多万吨。2009年我国饲料的总产量达到1.37亿吨，其中浓缩饲料达到2708万吨，预混合饲料达到595万吨，对饲料添加剂会有相当大的需求，低聚木糖饲料添加剂亦将占据很大比例，其市场需求量巨大。

工业化生产低聚木糖一般以木质纤维素类物质为原料，如富含木聚糖的玉米芯、甘蔗渣、棉子壳、燕麦、桦木等农作物，它们的组成相似，均由木质素、纤维素和半纤维素三种聚合物组成。根据对原料或中间产物木聚糖所采用的处理方式不同，低聚木糖的生产方法分为三类：

1、化学法生产低聚木糖。用富含木聚糖的原料经化学溶剂处理制取低聚木糖，最常见的原料处理是碱法和酸法：碱法制取低聚木糖的不足是使用大量的碱造成设备腐蚀和环境污染；酸法制取低聚木糖的提取液中木糖比例很高，不能满足低聚木糖的生产要求，提取过程会产生许多副反应，生成一些可能致癌物质，从而影响到产品的安全性。

2、酶法生产低聚木糖。即利用酶发酵富含木聚糖的木质纤维素原料生产低聚木糖。酶法生产低聚木糖，以棉子壳、甘蔗渣、玉米芯、稻草、燕麦壳和花生壳等天然纤维物质为原料，采用木聚糖酶分解木聚糖，使之产生低聚木糖，再经脱色、脱盐、浓缩精制等处理，得到低聚木糖糖浆状产品，若在糖浆中添加糊精等赋形剂，再经喷雾干燥，可制成粉状产品。本法由于底物不溶于水，因此反应在固液相上进行，酶促反应比较困难，而且木聚糖酶的基质亲和性会产生吸附现象，造成酶回收十分困难。

3、化学-酶联合法生产低聚木糖。由于水溶性木聚糖比不溶性木聚糖更容易酶解，先采用蒸煮或热水抽取、酸抽取、碱抽取、蒸汽喷爆等方法，从植物原料中提取木聚糖，精制得到水溶性木聚糖，然后经木聚糖酶水解得到低聚木糖粗液，再经脱色、脱盐、浓缩后得到低聚木糖产品。此法目前工业化生产低聚木糖比较常用。

工业化生产低聚木糖的主要原料是玉米芯、棉子壳、甘蔗渣等，其中玉米芯木糖含量最高，达30-40％，从化学组成上看，玉米芯含有丰富的半纤维素，是世界公认的制备低聚木糖的理想原料。我国年产玉米约1.2亿吨，按3kg玉米产1公斤玉米芯计算，每年可产出玉米芯0.4亿吨左右，用来做制备低聚木糖的原料其数量极其可观。目前国内外公开报道的以玉米芯为原料生产低聚木糖的方法主要是化学-酶联合法，从制造工艺来讲，用玉米芯制备低聚木糖的难点是对酶的要求很高，需要酶的高度专一性，另一方面是分离提纯技术难度大，现有的技术与急剧增加的市场需求存在不小的差距。近几年有报道用黑曲霉固体发酵生产木聚糖酶，再用木聚糖酶水解木聚糖制备低聚木糖，但是，此方法需要28℃培养72小时，才能获得酶活大于2500IU/g(培养基干重)木聚糖酶，不仅时间较长，生产过程中周期变压操作的环节也增加了生产工艺的难度，且酶活较低无法满足工业化生产的需要。使用微生物发酵培养物直接与原料液反应制备低聚木糖的方法还未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种使用黑曲霉发酵培养物直接与玉米芯原料液反应制备低聚木糖的新方法。

本发明以玉米芯为原料，经粉碎、加水后采用稀硫酸液预处理技术，进行酸化和高温裂解处理得到原料混合液，直接接种优良菌株-黑曲霉菌株Aspergillus niger U8-7(简称为：黑曲霉U8-7，下同)的发酵培养物，进行微生物诱导产酶酶解，再经分离、除杂、脱色、脱盐、过滤、浓缩、喷雾干燥，获得20％-99％的低聚木糖成品。

实现本发明的具体技术路线是：

1.黑曲霉U8-7的分离筛选

(1)菌株的分离纯化

从野外腐烂的玉米芯中获取黑曲霉菌株，取其样品1g，装入有100ml无菌水和玻璃珠的三角瓶中，振荡打散，制成玉米芯悬液，接入PDA培养基(组成为：土豆200g，葡萄糖20g，琼脂20g，水1000ml，pH自然)培养，温度30℃，培养72小时，进行分离纯化，同时产生孢子。其中对照菌株采用黑曲霉Aspergillus niger AS3.4309，购自中科院微生物菌种保藏中心。

(2)菌株增殖培养

用接种环刮取纯化的黑曲霉孢子于装有100ml无菌水和玻璃珠的三角瓶中，振荡，4层纱布过滤并稀释计数，制成每毫升含3-5个孢子的孢子悬液，取1ml孢子悬液注入查氏培养基(组成为：硝酸钠2g，磷酸氢二钾1g，氯化钾0.5g，硫酸镁0.5g，硫酸亚铁0.01g，蔗糖30g，琼脂20g，水1000ml，pH自然)平板中涂布，30℃培养3d后，选取每个平板最大菌落接种发酵玉米芯，检测发酵玉米芯中木聚糖酶的酶活力高低，筛选出优良黑曲霉U8-7。

2.黑曲霉U8-7发酵培养物组成及产酶条件

通过对黑曲霉U8-7产酶条件和酶学特性的研究，使用单因素和中心组合设计实验，确定了黑曲霉U8-7的发酵培养物的组成为(重量百分比)：玉米芯粉30～40％、麸皮10～20％、玉米5～15％、硝酸铵2％、氯化钠1％、水35％、黑曲霉U8-7接种量1～2％。黑曲霉U8-7产木聚糖酶的产酶条件为：温度30℃～38℃，pH值3～6，培养周期48～72h。黑曲霉U8-7最终达到产酶稳定且酶活力高，在生产过程中产酶活力达到100,000IU/g。

3.玉米芯酸化处理和高温裂解

将玉米芯粉碎与水按重量1∶5～1∶10混合搅拌均匀，加入玉米芯重量0.1％～1％的稀硫酸进行酸化处理，控制pH值在3～5之间，酸化处理2～3小时。将经过酸化处理的混合液加热至120℃～160℃，蒸煮1～2个小时，进行裂解，经过裂解的混合液，玉米芯所含的木聚糖得到充分溶出。

4.酶解反应

将裂解后的玉米芯混合液降温至60℃以下，调节pH值为3～6，在30℃～60℃直接接种黑曲霉U8-7发酵培养物，进行微生物诱导产木聚糖酶酶解5～12小时，然后升温到100℃～120℃处理30分钟，过滤混合液，得到含木聚糖溶液，此液的可溶性总糖达到26％～35％(按木聚糖含量为35％的玉米芯计)，木二糖与木三糖含量较高。

5.分离、除杂、脱色、脱盐、过滤、

将过滤后的混合液以0～30％的乙醇溶液进行梯度洗脱，使木糖、木二糖、木三糖、木四糖和木五糖得到分离。用活性炭作为吸附剂，进行除杂、脱色、脱盐，纯化含低聚木糖的液体。对低聚木糖溶液进行纳滤膜过滤，除去不在需要的DP(低聚木糖聚合度)范围内低聚木糖和非糖组分，得到特定DP范围(2～7个木糖分子)内的低聚木糖。

6.产品后处理

对分离、除杂、脱色、脱盐、过滤后的木聚糖溶液进行真空浓缩，成为浅黄色粘稠状低聚木糖糖浆。真空浓缩后的低聚木糖糖浆的纯度为55％～75％，若以麦芽糊精和玉米淀粉为赋形剂，可以制成20％～50％的低聚木糖的粉剂；若进行喷雾干燥，即可生产成70％～99％的高纯度的低聚木糖粉剂。

本发明采用直接接种黑曲霉U8-7发酵培养物，进行微生物诱导产木聚糖酶酶解的工艺，省去了生产木聚糖酶所需要的设备、减少了生产环节、缩短了生产周期、降低了生产成本，黑曲霉U8-7菌株在生产过程中产酶活力达到100,000IU/g，是现有技术的40倍，明显提高了低聚木糖的产出率。

本发明采用稀硫酸液预处理技术，使得预处理酸液用量比国内现有技术减少40％，大大降低了生产环节对环境的污染。

采用纳滤膜过滤技术，可以得到特定DP范围内的低聚木糖，膜的使用效率和低聚木糖的总回收率均高。活性炭具有分离容量大，适用范围广，其分离、除杂、脱色、脱盐效果好，成本低，活性炭还可以重复使用。

本发明所产的低聚木糖作为饲料添加剂可提高养殖综合效益15％～35％，提高动物生产性能10％以上，降低抗生素药物用量80％以上，降低畜禽发病60％～80％。

利用玉米芯为原料生产低聚木糖，是提高农副产品开发利用附加值的一条很好的出路，其生产和应用完全符合绿色饲料添加剂的要求和国家大力发展生态农业和绿色食品的产业化政策，顺应了以非药物添加剂替代抗生素作为畜禽防病、促进生长的发展趋势，有着很好的经济、社会和环保效益。

具体实施方式

1.黑曲霉U8-7的分离筛选

(1)菌株的分离纯化

从野外腐烂的玉米芯中获取黑曲霉菌株，取其样品1g，装入有100ml无菌水和玻璃珠的三角瓶中，振荡打散，制成玉米芯悬液，接入PDA培养基(土豆200g，葡萄糖20g，琼脂20g，水1000ml，pH自然)培养，温度30℃，培养72小时，进行分离纯化，同时产生孢子。其中对照菌株采用黑曲霉Aspergillus niger AS3.4309，购自中科院微生物菌种保藏中心。

(2)菌株增殖培养

用接种环刮取纯化的黑曲霉孢子于装有100ml无菌水和玻璃珠的三角瓶中，振荡，4层纱布过滤并稀释计数，制成每毫升含3-5个孢子的孢子悬液，取1ml孢子悬液注入查氏培养基(硝酸钠2g，磷酸氢二钾1g，氯化钾0.5g，硫酸镁0.5g，硫酸亚铁0.01g，蔗糖30g，琼脂20g，水1000ml，pH自然)平板中涂布，30℃培养3d后，选取每个平板最大菌落接种发酵玉米芯，检测其酶活力高低，筛选出优良黑曲霉U8-7。

2.黑曲霉U8-7发酵培养物组成及产酶条件

通过对黑曲霉U8-7产酶条件和酶学特性的研究，使用单因素和中心组合设计实验，确定了黑曲霉U8-7的发酵培养物的组成为(重量百分比)：玉米芯粉35％、麸皮15％、玉米10％、硝酸铵2％、氯化钠1％、水35％、黑曲霉U8-7接种量2％。黑曲霉U8-7产木聚糖酶的产酶条件为：温度30℃，pH值5，培养周期72h。黑曲霉U8-7最终达到产酶稳定且酶活力高，在生产过程中产酶活力达到100,000IU/g。

3、玉米芯加水加酸处理

将玉米芯粉100公斤与水600公斤进行混合，加入1公斤稀硫酸进行酸化处理，控制pH值为4，处理3小时，然后160℃蒸煮2个小时，进行玉米芯裂解，促进玉米芯所含木聚糖溶出。

4、酶解反应

调节玉米芯混合液的pH值为5，在35℃直接接种黑曲霉U8-7发酵培养物，进行微生物诱导产木聚糖酶酶解7小时，然后升温到120℃处理30分钟，得到含木聚糖的混合溶液。

5、分离、除杂、脱色、脱盐、过滤

将木聚糖混合液以0～30％的乙醇溶液进行梯度洗脱，使木糖、木二糖、木三糖、木四糖和木五糖得到分离。用活性炭作为吸附剂，进行除杂、脱色、脱盐，纯化含低聚木糖的液体。对低聚木糖溶液进行纳滤膜过滤，除去不在需要的DP范围内低聚木糖和非糖组分，得到特定DP范围(2～7个木糖分子)内的低聚木糖。

6、产品后处理工艺

对纳滤膜过滤后的木聚糖溶液进行加工，经过真空浓缩成为浅黄色粘稠状低聚木糖糖浆，纯度为50％～75％，以麦芽糊精和玉米淀粉为赋形剂，可以制成20％～50％的低聚木糖的粉剂；经喷雾干燥能生产成70％～99％的高纯度的低聚木糖产品。

Claims (6)

1.利用微生物生产低聚木糖的新方法，其特征在于，以玉米芯为原料，经粉碎、加水后进行酸化和高温裂解处理得到原料混合液，直接接种黑曲霉菌株Aspergillus niger U8-7的发酵培养物，进行微生物诱导产酶酶解，再经分离、除杂、脱色、脱盐、过滤、浓缩、喷雾干燥，获得低聚木糖成品。

2.如权利要求1所述的利用微生物生产低聚木糖的新方法，其特征在于，所述的黑曲霉菌株Aspergillus niger U8-7的获得方法如下：从野外腐烂的玉米芯中分离得到黑曲霉菌株，进行分离纯化，通过增殖培养，筛选出黑曲霉菌株Aspergillus niger U8-7。

3.如权利要求2所述的利用微生物生产低聚木糖的新方法，其特征在于，黑曲霉菌株Aspergillus niger U8-7的分离纯化步骤如下：将从野外腐烂的玉米芯中获取的黑曲霉菌株加入无菌水，制成混悬液，接入PDA培养基培养，温度30℃，培养72小时，进行分离纯化。

4.如权利要求2所述的利用微生物生产低聚木糖的新方法，其特征在于，黑曲霉菌株Aspergillus niger U8-7增殖培养步骤如下：取分离纯化后的黑曲霉制成每毫升含3-5个孢子的孢子悬液，取1ml孢子悬液注入查氏培养基平板中涂布，30℃培养3d后，选取每个平板最大菌落接种发酵玉米芯，检测发酵玉米芯中木聚糖酶的酶活力高低。

5.如权利要求1～4任一所述的利用微生物生产低聚木糖的新方法，其特征在于，黑曲霉菌株Aspergillus niger U8-7的发酵培养物的组成为：玉米芯粉30～40％、麸皮10～20％、玉米5～15％、硝酸铵2％、氯化钠1％、水35％、黑曲霉菌株Aspergillus niger U8-7接种量1～2％。

6.如权利要求5所述的利用微生物生产低聚木糖的新方法，其特征在于，黑曲霉菌株Aspergillus niger U8-7产木聚糖酶的产酶条件为：温度30℃～38℃，pH值3～6，培养周期48～72h。