CN101955958A - 木聚糖酶的基因、质粒、菌株及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种耐高温耐强碱、高效稳定的木聚糖酶的基因、表达载体、生产菌株及其在纸浆漂白的用途。本发明提供的木聚糖酶基因利用密码子优化、多拷贝技术实现在毕赤酵母中的高表达；表达的木聚糖酶无纤维素酶活性，具有耐高温、耐高碱性质；该木聚糖酶可应用于麦草浆漂白：应用于无元素氯(ECF)漂白工序，节省二氧化氯10％；应用于过氧化氢(OP)漂白工序，节省过氧化氢10％。

Description

木聚糖酶的基因、质粒、菌株及应用

技术领域

本发明涉及生物工程领域，具体涉及一种耐高温耐强碱的木聚糖酶的基因、生产菌株及该基因编码的木聚糖酶在纸浆漂白的应用。

背景技术

造纸工业是支撑我国国民经济的重要产业之一，但也是我国重要的工业污染源之一。这是因为目前制浆造纸工业仍主要采用硫酸盐法制浆和氯漂技术，含氯漂剂是造纸工业中普遍使用的漂白剂。长期以来，人们一直认为氯是纸浆漂白中最经济有效的漂白剂。但在传统的氯漂工艺中，漂白废水中含有大量对人体有害的物质，其中以二噁英为代表的有机氯化物对环境的危害尤为严重，它们具有强致癌作用，带来了严重的环境污染。随着全世界范围内对纸和纸板不断增加的需求和越来越严的造纸废液排放的要求，加剧了漂白工艺向少氯和无氯漂白的方向发展。

在1986年国际纸浆造纸工业生物技术研讨会上，芬兰科学家Viikari等首次报道应用木聚糖酶处理浆料能改善其漂白性能，减少氯气使用用量，提高纸浆白度的。随后多项实验证实木聚糖酶用于纸浆预漂能有效降低漂白化学用品的消耗量，提高纸浆强度。为了获得最佳助漂效果，从微生物中提取的木聚糖酶要求无或低纤维素酶活活性，因为纤维素酶活性会造成纸浆中纤维素的损失，降低纸浆的质量和增加排放物的处理成本。

制浆之后及在用木聚糖酶处理纸浆之前，纸浆处于大约高温(55-70℃)及在高碱性pH下(pH9-11)。高温和碱性状态对木聚糖酶制剂提出了严格的要求。许多可商购的野生型木聚糖酶的缺点是这些酶呈现酸性的最佳pH及大约55℃的最佳温度。如用这些木聚糖酶进行漂白，纸浆必须酸化为使用的特异性木聚糖酶最佳pH相近的pH。另外，热纸浆必须冷却至接近选择的木聚糖酶的酶活性的最佳温度。针对木聚糖酶处理而降低纸浆温度降低了随后化学漂白的效力，而酸化纸浆也需要使用大量酸。另外，加入酸产生侵蚀，对反应塔提出了新的要求。因此在接近纸浆原漂白条件的温度和pH条件下活性最佳的木聚糖酶在纸浆生产中最为理想。

200610037416.6号中国专利申请公开了一种高效表达木聚糖酶基因的方法及在纸浆漂白工艺中的应用。该专利申请中的木聚糖酶的酶活为526IU/mL，在75℃、pH9.0时的半衰期为45分钟。该木聚糖酶虽然在一定程度上能耐高温和耐碱，但高温高碱的条件下半衰期短，不能满足纸浆漂白工艺中处理时间1-1.5小时的要求。

发明内容

本发明的目的之一在于解决现有技术的不足之处而提供一种能够编码耐高温、耐碱、高效稳定的木聚糖酶的基因。

本发明目的可以通过以下技术措施实现：一种木聚糖酶的基因，所述的木聚糖酶基因xyn的核苷酸编码序列如SEQ ID NO 1所示。

Gashaw Mamo等在2006年首次克隆了嗜盐芽孢杆菌(Bcillus halodurans S7)的木聚糖酶A(xyn)基因，并将其在大肠杆菌中成功表达；同年他们报道了其主要的酶学性质，发现该木聚糖酶具有耐热性、耐碱性，且不含纤维素酶活，可能具有应用于造纸工业的理想特性。但此后并没有看到关于该酶应用于生产的报道。其原因可能在于，其一，在原始菌株的表达量低；其二，尽管Gashaw Mamo等将其基因在大肠杆菌中表达，但表达的酶活相对较低，分泌的酶活为5.1U/mL，该酶不能完全分泌，有部分分布在在胞内及周质空间而且表达量不高，提取酶时必须进行破壁处理，因而限制了其作为工业用酶制剂的进一步开发。

本发明采用密码子优化、基因全合成等方法，实现对S7-xyn(嗜盐芽孢杆菌S7的木聚糖酶A)基因的分子改造和人工组建，得到一种能够高效表达木聚糖酶的基因。发明人根据美国国立生物技术信息中心(NCBI，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上公布的S7-xyn基因序列，对序列进行优化，替换成毕赤酵母偏好的密码子，再将优化后的基因序列用DNAWORKS软件(http://mcll.ncifcrf.gov/lukowski.html)，设计全基因合成的引物，设计了34条引物，采用两步法(PCR-base two-step DNA synthesis PTDS)合成S7-xyn基因序列，得到的木聚糖酶基因的核苷酸编码序列如SEQ ID NO 1所示。

本发明的另一目的在于提供一个携带3个拷贝S7-xyn的毕赤酵母分泌表达重组载体pPICZαA-(XYN)₃。通过在商用毕赤酵母分泌表达载体pPICZαA中连续三次连入S7-xyn的表达盒，构成重组质粒pPICZαA-(XYN)₃。携带该木聚糖酶基因的菌株Escherichia coli TOP10/pPICZαA-(XYN)₃已于2010年7月26日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为：CCTCC NO：M 2010186。保藏地址为湖北省武汉市武汉大学(430072)。

重组质粒pPICZαA-(XYN)₃可以通过以下技术措施实现：

(1)采用第一个发明目的所述方法全基因合成S7-xyn时，在上游和下游已分别引入了限制性内切酶EcoRI和NotI酶切位点。因此将全基因PCR产物和毕赤酵母分泌表达载体pPICZαA质粒(invitrogen)都用EcoRI和NotI双酶切，体外连接构建重组质粒pPICZαA-XYN。

(2)外源基因的拷贝数的增加有可能提高木聚糖酶基因S7-xyn在毕赤巴斯德酵母中的表达，因此通过分子克隆，在体外以多个表达盒串联的形式构建得到多拷贝的载体。根据pPICZαA载体特点设计了引物克隆含成熟S7木聚糖酶基因及表达调控元件完整的表达盒(Cassette)，上游引物F1：5‘-GGAAGATCTAACATCCAAAGACGAAAGG-3’，含Bgl II酶切位点(以下划线示出)以及保护碱基；下游引物R1：5-‘GTATAGGATCCGCACAAACGAAGGTCTC-3’，含BamH I酶切位点(以下划线示出)以及保护碱基。Bgl II与BamH I是同尾酶，酶切后产生相同的粘性末端。

以质粒pPICZαA-XYN为模板，F1和R1为引物进行PCR扩增。PCR扩增程序：94℃预变性3min；94℃变性60s，55℃退火60s，68℃延伸3min，共30个循环；第30个循环68℃延伸10min。将PCR产物用BglII和BamH I双酶切，质粒pPICZαA-XYN用BamH I单酶切，16℃下T4连接酶作用下连接过夜。连接产物转化大肠杆菌宿主菌(TOP10或DH5α)经Zecoin抗性平板筛选阳性转化子。转化子提取质粒经双酶切鉴定后得到构建重组质粒pPICZαA-(XYN)₂。再将重组质粒pPICZαA-(XYN)₂用BamH I单酶切，与经Bgl II和BamH I双酶切后的表达盒再次进行体外连接，可得到重组质粒pPICZαA-(XYN)₃。

本发明的又一目的在于解决现有技术的不足之处而提供一种能高效表达木聚糖酶的毕赤酵母基因工程菌株Pichia Pastoris X33/pPICZαA-(XYN)₃。

毕赤酵母是甲醇营养型酵母中的一类酵母菌，可以利用甲醇作为唯一碳源和能源。作为真核表达系统，具有许多其它蛋白表达系统所不具备的优点：具有强有力的乙醇氧化酶(AOX1)基因启动子，可严格调控外源蛋白的表达；酵母生长繁殖速度快、营养要求低、培养基廉价；外源基因能通过质粒整合到巴斯德毕赤酵母基因组上，外源基因不会发生随生长繁殖而丢失；表达量高，许多蛋白可达到每升克级以上；同时，毕赤酵母自身分泌的蛋白(背景蛋白)非常少，有利于纯化。

毕赤酵母基因工程菌株Pichia Pastoris X33/pPICZαA-(XYN)₃可以通过以下技术措施实现：以LiCl法将Sac I线性化的重组质粒pPICZαA-(XYN)₃转化毕赤巴斯德酵母宿主菌GS115或X33，转化物涂布于MD平板，培养2-3天。将MD平板上的转化子分别接种于含不同浓度的Zeocin(博莱霉素)抗性YPD平板上，培养3-5天。将高浓度Zeocin-YPD平板上出现的转化子挑取其对应的单克隆，按Invitrogen操作指南提取酵母基因组DNA作为模板，进行酵母基因组PCR鉴定，获得重组转化子。

重组转化子先接种于200mL的YPD培养基中，培养至OD600到8-12作为种子液。培养种子液8-10瓶，然后以5-10％的接种量(体积比)转接至含20-35L BSM培养基的50L发酵罐中培养。用25％氨水控制pH为5.0，通气约1.5m³/h(25L/min)，培养温度为28℃。甘油耗完后再补加5-8L 50％(体积比，1∶1)的甘油，至二次甘油消耗完，OD₆₀₀达280-320左右，饥饿0.5-1h后，补料甲醇，甲醇流加速度为30g/L h-60g/L·h，溶氧控制在5-10％，氨水自动流加，发酵120-140h后结束，发酵液中木聚糖酶酶活为1200U/mL左右。

本发明的再一目的在于解决现有技术的不足之处而提供一种木聚糖酶在纸浆漂白的应用。

本发明一种毕赤酵母基因工程菌株Pichia Pastoris X33/pPICZαA-(XYN)₃，由质粒pPICZαA-(XYN)₃转化毕赤酵母宿主菌X33后得到，所述的基因工程酵母菌Pichia Pastoris X33/pPICZαA-(XYN)₃产的木聚糖酶可应用在纸浆漂白。

具体实施方式

为使本发明更加容易理解，下面将进一步阐述本发明的具体实施例。

本发明的具体实验方法可以参照分子克隆实验指南(第三版，冷泉港出版社出版)以及Pichia Fermentation Process Guidelines(Invitrogen)。

实施例1合成木聚糖酶基因(S7-xyn)

嗜盐芽孢杆菌(B.halodurans S7)内切木聚糖酶的基因S7-xyn的基因序列及蛋白结构信息来源于美国国立生物技术信息中心(NCBI，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)和蛋白数据库(PDB，http://www.rcsb.org/pdb/search/advSearch.do)。

根据NCBI上公布的S7-xyn基因序列，对序列进行优化，全部替换成毕赤酵母偏好的密码子，再将优化后的基因序列用DNAWORKS软件(http://mcll.ncifcrf.gov/lukowski.html)，设计全基因合成的引物，设计了34条引物(即依次对应于SEQ ID NO 2～SEQ ID NO 35)，其中第1条引物S7-1和第34条引物分别引入了EcoRI和NotI酶切位点以及酶切保护碱基，见表1。

表1全基因合成S7-xyn基因的引物

本发明采用两步法(PCR-base two-step DNA synthesis PTDS)合成S7-xyn基因序列.

1.第一步PCR反应：

将34条引物分3组，其中合成片段1的引物为(S7-1-S7-12)、合成片段2的引物为(S7-13-S7-24)、片段3的引物为(S7-25-S7-34)进行无模板PCR扩增反应。

PCR扩增反应程序为：94℃预变性2min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min，共30个循环；第30个循环72℃延伸10min，PCR产物用凝胶电泳鉴定后存于-20℃备用。

2.第二步PCR反应：

以第一步PCR反应得到的三段片段为模板，以S7-1和S7-34引物进行第二轮PCR反应，PCR扩增反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性45s，55℃退火min，72℃延伸2min，共30个循环；第30个循环72℃延伸10min，PCR产物用凝胶电泳鉴定后存于-20℃备用。将PCR产物测序确认得到所需DNA，如SEQ ID NO 1所示：

ATGATTACTT TGTTTAAGAA GCCATTTGTT GCTGGTTTGG CTATTTCTTT GTTGGTTGGT      60

GGTGGTTTGG GTAACGTTGC TGCTGCTCAA GGTGGTCCAC CAAAGTCTGG TGTTTTTGGT     120

GAAAACCAAA AGAGAAACGA TCAACCATTT GCTTGGCAAG TTGCTTCTTT GTCTGAAAGA     180

TACCAAGAAC AATTTGATAT TGGTGCTGCT GTTGAACCAT ACCAATTGGA AGGTAGACAA     240

GCTCAAATTT TGAAGCATCA TTACAACTCT TTGGTTGCTG AAAACGCTAT GAAGCCAGTT     300

TCTTTGCAAC CAAGAGAAGG TGAATGGAAC TGGGAAGGTG CTGATAAGAT TGTTGAATTT     360

GCTAGAAAGC ATAACATGGA ATTGAGATTT CATACTTTGG TTTGGCATTC TCAAGTTCCA     420

GAATGGTTTT TTATTGATGA AAACGGTAAC AGAATGGTTG ATGAAACTGA TCCAGAAAAG     480

AGAAAGGCTA ACAAGCAATT GTTGTTGGAA AGAATGGAAA ACCATATTAA GACTGTTGTT     540

GAAAGATACA AGGATGATGT TACTTCTTGG GATGTTGTTA ACGAAGTTAT TGATGATGGT     600

GGTGGTTTGA GAGAATCTGA ATGGTACCAA ATTACTGGTA CTGATTACAT TAAGGTTGCT     660

TTTGAAACTG CTAGAAAGTA CGGTGGTGAA GAAGCTAAGT TGTACATTAA CGATTACAAC     720

ACTGAAGTTC CATCTAAGAG AGATGATTTG TACAACTTGG TTAAGGATTT GTTGGAACAA     780

GGTGTTCCAA TTGATGGTGT TGGTCATCAA TCTCATATTC AAATTGGTTG GCCATCTATT     840

GAAGATACTA GAGCTTCTTT TGAAAAGTTT ACTTCTTTGG GTTTGGATAA CCAAGTTACT     900

GAATTGGATA TGTCTTTGTA CGGTTGGCCA CCAACTGGTG CTTACACTTC TTACGATGAT     960

ATTCCAGAAG AATTGTTTCA AGCTCAAGCT GATAGATACG ATCAATTGTT TGAATTGTAC    1020

GAAGAATTGT CTGCTACTAT TTCTTCTGTT ACTTTTTGGG GTATTGCTGA TAACCATACT    1080

TGGTTGGATG ATAGAGCTAG AGAATACAAC AACGGTGTTG GTGTTGATGC TCCATTTGTT    1140

TTTGATCATA ACTACAGAGT TAAGCCAGCT TACTGGAGAA TTATTGATTA A             1191

结果表明合成的基因片段全长1191bp，与拟合成的S7-xyn优化后的序列一致，且读码框正确。采用两步PCR方法可以快速地合成目的基因，且错误率低。根据测序结果，将优化后的基因序列与原始序列在NCBI上进行比对，同源性是80％。

本发明提供的基因序列也可以通过专门的生物技术公司或机构使用全自动合成仪合成。

实施例2制备含3拷贝的S7-xyn基因的质粒

将实施例1得到的PCR产物电泳，切胶回收约1200bp处的目的条带，回收产物经EcoRI和NotI双酶切处理，与同样经EcoRI和NotI双酶切、胶回收的表达载体pPICZαA用T4DNA连接酶连接。10μL体积反应体系如下：pPICZαA1μL(50ng)，加入全合成基因产物6μL，含ATP的10×Buffer 1μL，T4DNA连接酶1μL，用ddH₂O补足至10μL。稍加离心，16℃水浴连接过夜，并转化E.coli Top10中，在含有Zeocin(博莱霉素，25μg/mL)的LB平板上筛选阳性转化子。随机挑取一定量的转化子，小量制备质粒，经限制性内切酶EcoRI和NotI双酶切处理后，进行电泳分析。成功连接目的基因的质粒经酶切后，预计可得到1200bp，和3.5kb两个片段，质粒酶切鉴定正确。将重组质粒测序，证实木聚糖酶S7-xyn基因编码框完全正确。将重组质粒命名为pPICZαA-XYN重组质粒。

根据pPICZαA载体特点设计了引物克隆含成熟S7木聚糖酶基因及表达调控元件完整的表达盒(Cassette)，上游引物F1：5‘-GGAAGATCTAACATCCAAAGACGAAAGG-3’，含BglⅡ酶切位点(以下划线示出)以及保护碱基；下游引物R1：5-GTATAGGATCCGCACAAACGAAGGTCTC-3’，含BamHⅠ酶切位点(以下划线示出)以及保护碱基。

以质粒pPICZαA-XYN为模板，F1和R1为引物进行PCR扩增。PCR扩增程序：94℃预变性3min；94℃变性60s，55℃退火60s，68℃延伸3min，共30个循环；第30个循环68℃延伸10min。将PCR产物用BglⅡ和BamHⅠ双酶切，质粒pPICZαA-XYN用BamHⅠ单酶切，16℃下T4连接酶作用下连接过夜。连接产物转化大肠杆菌宿主菌(TOP10或DH5α)经Zecoin抗性平板筛选阳性转化子。转化子提取质粒经双酶切鉴定后得到构建重组质粒pPICZαA-(XYN)₂。再将重组质粒pPICZαA-(XYN)₂用BamHⅠ单酶切，与经BglⅡ和BamHⅠ双酶切后的表达盒再次进行体外连接，可得到重组质粒pPICZαA-(XYN)₃。

实施例3木聚糖酶S7-xyn在毕赤酵母中的高效表达

通过LiCl法将经SacⅠ酶线性化完全的实施例2的pPICZαA-(XYN)₃转化Pichia pastoris X33。转化物涂布MD平板，30℃培养2天。将MD平板上的转化子分别接种于含Zeocin 100μg/mL，200μg/mL，300μg/mL，400μg/mL，500μg/mL的YPD平板上，30℃培养3天。将较高浓度Zeocin-YPD平板上出现的转化子挑取单克隆。按Invitrogen操作指南提取酵母基因组DNA作为模板，利用目的基因序列的PCR引物进行酵母基因组PCR鉴定，总反应体积为20μL，Taq酶量为2U，取2μLPCR产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳鉴定。

鉴定正确的重组转化子X33/pPICZαA-(XYN)₃先接种于200mL的YPD培养基中，培养至OD₆₀₀到10作为种子液。培养种子液8瓶，然后以5％的接种量(体积比)转接至含30L BSM培养基的50L发酵罐中培养，甘油耗完后再补加6L 50％(质量体积比)的甘油，至二次甘油消耗完，OD₆₀₀达300，饥饿半小时后，补料甲醇，甲醇流加速度为50g/L·h，溶氧控制在5-10％，氨水自动流加，发酵120h后结束。发酵液经3000rpm离心后收集上清，上清测定木聚糖酶酶活为1200U/L。该上清可直接作为木聚糖酶液应用于后续的麦草浆漂白预处理。

酶活的测定原理：木聚糖酶在一定条件下水解底物木聚糖，生成木糖等醛糖，醛糖与3，5-二硝基水杨酸共热产生棕红色的氨基化合物，在一定范围内还原糖的量和含有呈色氨基化合物的反应液颜色深浅成正比，在540nm下测其吸光度，从而计算出木聚糖酶酶活。

酶活的测定方法：酶液加蒸馏水稀释至适当的稀释倍数，取0.5mL于25mL比色管，加入1mL 1％桦木木聚糖，pH7.0，50℃下准确反应30min，立即拿出流水冷却后，加入3.0mL DNS，沸水浴5分钟后定容至25mL，在540nm下测定其吸光度，根据被测液的吸光度，由木糖标准曲线计算样品中的总还原糖的浓度，计算木聚糖酶活。

DNS试剂配置方法：

用400mL蒸馏水溶解6.3g 3，5-二硝基水杨酸，逐步加入21g氢氧化钠，再加入185g四水合酒石酸钾钠、5.0g苯酚、5.0g无水亚硫酸钠，温水浴(不超过48℃)，不断搅拌，直至溶液清澈透明。用蒸馏水定容至1000mL，保存在棕色瓶中，与二氧化碳隔绝，静置5～7天后使用，贮存期为6个月

酶活力的定义为：在50℃、pH7.5的条件下，每分钟从1％的木聚糖溶液中降解释放1μmol还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位。

实施例4 S7-xyn木聚糖酶的酶学性质

本实施例采用的S7-xyn木聚糖酶为实施例3的发酵后上清液。

1、S7-xyn木聚糖酶的最适pH值和最适温度

使用不同pH缓冲液(3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0)(pH≤8.0用磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，pH＞8.0用甘氨酸氢氧化钠溶液)分别配制1％桦木木聚糖底物溶液及稀释S7-xyn木聚糖酶液，测定木聚糖酶在各种不同pH值下的相对酶活。S7-xyn木聚糖酶最适作用pH值为9.0，pH6.0～10.0范围内相对酶活维持在90％以上；当pH＜5.0或＞10.0后，S7-xyn木聚糖酶的酶活降到60％以下。

在45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃，pH9.0或pH10.0的条件下测定S7-xyn木聚糖酶的相对酶活。在pH10.0下，最适作用温度为70℃，pH9.0下，最适作用温度为75℃。在60℃～80℃范围内，酶活均能维持在85％以上的，即使pH10.0条件，温度为80℃时，相对酶活仍保持在60％以上。

2、S7-xyn木聚糖酶的耐热性及耐碱性

将S7-xyn木聚糖酶分别在60℃、65℃及70℃的水浴锅中保温，每隔30min时间取样，在最适温度75℃和最适pH9.0下测定S7-xyn木聚糖酶活的热稳定性。S7-xyn木聚糖酶在60℃、65及70℃保温1h后，木聚糖酶活性都可以维持在80％以上；60℃及65℃时、S7-xyn半衰期为6h以上(6h时，活力仍保留60％)，70℃条件下，S7-xyn半衰期长达2.5h(3h时，酶活力保持在40％)。

S7-xyn木聚糖酶分别被不同pH缓冲液(pH3.0、pH4.0、pH5.0、pH6.0、pH7.0、pH8.0、pH9.0、pH10.0、pH11.0、pH12.0)处理12h后，然后在最适温度75℃和最适pH9.0条件下测定相对酶活变化。经上述处理后，相对酶活均能维持75％以上，而pH9.0～pH12.0时，相对酶活为最大酶活80％以上，S7-xyn木聚糖酶适合在碱性条件下作用。

3、木聚糖酶的底物专一性

S7-xyn木聚糖酶对不同来源的木聚糖表现不同的酶活性，对燕麦木聚糖的水解能力比桦木木聚糖强，特别是对sigma木聚糖的水解酶活比桦木木聚糖高35％。对不同来源的燕麦木聚糖也表现出不同的水解酶活，对sigma木聚糖的水解酶活比Fluka木聚糖高15.1％。S7-xyn木聚糖酶对羧甲基纤维素、蔗糖和淀粉作用时没有酶活性，说明S7-xyn无纤维素酶活性

实施例5 S7-xyn木聚糖酶在麦草浆ECF和TCF漂白中的应用

本实施例采用的S7-xyn木聚糖酶为实施例3的发酵后上清液。

在传统的氯漂工艺中，漂白废水中含有大量对人体有害的物质，其中以二噁英为代表的有机氯化物对环境的危害尤为严重，它们具有强致癌作用，造成了严重的环境污染。用ClO₂取代氯气漂白会大大降低漂白废水中的氯化有机化合物含量，这就是通常所说的无元素氯(ECF)漂白技术。全无氯漂白(TCF)是指不用任何含氯漂剂而用H₂O₂、臭氧及过醋酸等含氧化学药品对浆样进行漂白，在整个过程造成的污染小。以氧脱木素和过氧化氢漂白为主的全无氯漂白(TCF)技术和以二氧化氯漂白为主的无元素氯漂白技术(ECF)，是近期我国纸浆清洁漂白技术研发和推广的重点技术。

使用木聚糖酶对麦草浆预处理，可以使浆样中的发色基团、木聚糖、木素碳水化合物复合体结构等可以发生一定程度的变化，从而使纸浆中残余木素或发色物质在后续的ECF和TCF漂白工序中更容易除去，以达提高纸浆白度和物理性能、节约后续漂白剂的用量，降低成本以及减轻漂白废水对环境的污染负荷等目的。本实施例考察了重组S7-xyn木聚糖酶在麦草浆ECF和TCF漂白中的应用。

1、S7-xyn木聚糖酶处理对麦草浆DE_PP漂白的影响

在麦草浆ECF漂白中，选用DE_PP漂白工序：D(ClO₂漂白)，E_P(H₂O₂强化碱抽提)，P(H₂O₂漂白)。在ClO₂漂白前利用S7-xyn木聚糖酶对麦草浆进行预处理(X_s7DE_PP)后，有利于提高DE_PP漂白后的最终白度和物理性能：经S7-xyn木聚糖酶处理后，最终白度由处理前的79.8％ISO提高到了81.9％ISO，比未经过预处理提高了2.1％ISO；抗张指数、撕裂指数以及耐破度方面均有改善。而且加入S7-xyn木聚糖酶预处理同时减少10％ClO₂时，漂白后麦草浆的性能能达到未经酶处理的所有指标并有所提升(表2)。

表2 S7-xyn木聚糖酶处理对麦草浆DE_PP漂白的影响

这主要是减少二氧化氯的使用量，从而在一定程度上降低了二氧化氯对纤维素的氧化降解作用几率，使其充分与木质素发生选择性取代反应，使得浆样中的纤维平均长度增加，纤维之间的结合能力增强，从而导致浆样的抗张强度，撕裂强度以及耐破度提高。木聚糖酶处理麦草浆不但可以提高浆样的最终白度和物理性能，而且可以减少化学漂白剂的用量，使得漂白废液的排放量减少，从而减少其对环境的污染负荷。使用S7-xyn木聚糖酶对麦草浆处理，可以在一定程度上减少了二氧化氯的使用量(％)，对于我国当前在造纸制浆工业中推行节能减排政策的推行有积极意义。

2、S7-xyn木聚糖酶处理对麦草浆OP漂白的影响

在麦草浆TCF漂白中，选用OP漂白工序：O(氧脱木素)，P(H₂O₂漂白)。表2给出了S7-xyn木聚糖酶处理对麦草浆OP漂白的影响。麦草浆经过S7-xyn木聚糖酶处理，再进行OP漂白后浆样的白度和物理强度与对照浆相比，没有差异。而氧脱木素后加入S7-xyn木聚糖酶处理，再进行P漂白后浆样的白度和物理性能指标(抗张强度，撕裂强度及耐破度)均比对照浆高，这表明木聚糖酶的处理适合放在氧脱木素工序后(表3)。

氧脱木素后，经过S7-xyn木聚糖酶处理的麦草浆再经过P漂白后浆样的白度比未处理过的提高1.4％ISO，浆样的物理性能(抗张强度，撕裂强度及耐破度)也均有所提高。而且，麦草浆氧脱木素后经S7-xyn木聚糖酶处理后，减少10％用量的过氧化氢漂白后，所得浆样的白度跟对照浆样相差不大，而且物理性能指标(抗张强度，撕裂强度及耐破度)均比对照浆有所提高。木聚糖酶的助漂效果可能是一方面降解了氧脱木素后浆样中的一些细小组分，使得浆样纤维的平均长度提高，降解纤维间的木聚糖，使得纤维之间的结合力增强；另一方面，由于木聚糖酶处理使得纤维变得疏松，以便于后续的过氧化氢对浆样中的木素的可及度，以及降低过氧化氢用量可以减少了其对纤维的氧化降解程度，从而提高了浆样的白度和物理性能。

表3 S7-xyn木聚糖酶处理对麦草浆OP漂白的影响

近几年过氧化氢的价格出现了大幅度增长，这对于使用过氧化氢为漂白剂的造纸企业来来说成本急剧升高，而使用木聚糖可减少麦草浆TCF漂白中一些化学漂白剂(过氧化氢)的使用量，提高了浆样的物理性能的同时减少了造纸制浆工业中漂白废水的排放量，降低了对环境的污染负荷，具有明显的经济效益和社会效益。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (4)

1.一种木聚糖酶的基因，其特征在于，所述的木聚糖酶基因xyn的核苷酸编码序列如SEQ ID NO 1所示。

2.一种含有权利要求1所述的木聚糖酶基因的质粒pPICZαA-(XYN)₃，是将基因xyn串联为3个拷贝，连入毕赤酵母分泌表达载体pPICZαA中，构成重组质粒pPICZαA-(XYN)₃；携带该木聚糖酶基因的菌株Escherichia coliTOP10/pPICZαA-(XYN)₃的保藏号为：CCTCC M 2010186。

3.一种含有权利要求2所述质粒的毕赤酵母基因工程菌株Pichia PastorisX33/pPICZαA-(XYN)₃，由质粒pPICZαA-(XYN)₃转化毕赤酵母宿主菌Pichia Pastoris X33后得到。

4.权利要求3所述的基因工程酵母菌产的木聚糖酶在纸浆漂白的应用。