CN108676787B - 一种比酶活提高的嗜热嗜碱木聚糖酶突变体及其在工业中的应用 - Google Patents

一种比酶活提高的嗜热嗜碱木聚糖酶突变体及其在工业中的应用 Download PDF

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    • C12Y302/01008—Endo-1,4-beta-xylanase (3.2.1.8)

Abstract

本发明公开了一种比酶活提高的嗜热嗜碱木聚糖酶突变体及其应用，属于基因工程和酶工程领域。本发明将来源于Bacillus halodurans S7的嗜热嗜碱木聚糖酶编码基因xyn10A进行倾向错误PCR进行随机诱变，筛选获得单突变体A262T；通过对蛋白底物进口处设计的4点饱和突变，得到3点突变V220N Q251S W254R；然后将两者整合在一起得到4点突变V220N Q251S W254R A262T。所得三株突变体酶表现出了较高的比酶活，分别为野生型酶的2.01、3.41、4.42倍。相比野生型嗜热嗜碱木聚糖酶，本发明的突变体酶更有利于其在工业上的应用，尤其是在低聚木糖制备和在工业造纸助漂方面具有很好的应用前景。

Description

一种比酶活提高的嗜热嗜碱木聚糖酶突变体及其在工业中的 应用
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体而言，涉及一种比酶活明显提高的嗜热嗜碱木聚糖酶突变体及其在工业中的应用。
背景技术
木聚糖酶(xylanase)是指可以降解木聚糖的一类酶总称。木聚糖是一种多聚五碳糖，结构多样，主要存在于陆生植物、海洋藻类的细胞壁中。由于木聚糖主链聚合度及侧链残基取代具有多样性，单靠某一种酶并不能完全降解木聚糖。依据木聚糖酶主链降解的方式不同，可将木聚糖酶分为三种：β-D-木糖苷酶(β-D-xylosidases)、内切-β-1,4-D木聚糖酶(endo-1,4-β-Dxylanas)和外切-β-1,4-D-木糖苷酶。另外，降解木聚糖侧链的酶主要有α-D-葡萄糖醛酸酶(α-D-glucuronidase)、乙酰木聚糖脂酶(acetylxylan esterases)、酚酸脂酶(phenol acid esterases)和α-L-呋喃阿拉伯糖苷酶(α-L-arabinofuranosidase)。总之，木聚糖首先被内切-β-1,4-D木聚糖酶水解，然后再进一步被以上这些酶相互协同水解，才可以得到彻底降解。一般而言，木聚糖酶仅指内切-β-1,4-木聚糖酶。
木聚糖酶的应用涉及到我们生活的方方面面，包括食品、饲料、造纸、能源等，一直是国内外的研究热点。对于嗜热嗜碱木聚糖酶主要是被应用在低聚木糖制备和工业造纸工艺中。最早在1986年，芬兰科学家Viikari首次报道用木聚糖酶处理纸浆，减少了后序漂白过程中含氯漂白剂的用量，从而减少了环境污染。随着木聚糖酶在造纸工业中应用的普及，木聚糖酶的应用方面得到很大的开发，主要包括：1)原材料处理；2)纸浆漂白；3)纤维改性；4)废纸脱墨。用嗜热嗜碱木聚糖酶处理纸浆，不仅可以减少含氯漂白剂的用量及有毒化学物质的排放，同时还可以改善纸张性能，简化了工艺流程、减少了工艺能耗。
本发明人前期研究的嗜热嗜碱木聚糖酶基因来源于Bacillus halodurans S7，含有1119bp的开放阅读框，编码373个氨基酸，将该基因xyn10A在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达，所得嗜热嗜碱木聚糖酶酶经纯化后再进行酶学性质分析的研究表明，该酶的最适温度为70℃，最适pH为10.0，比酶活为110.00U/mg，可以有效地降解木聚糖，但是其比酶活较低，离工业应用要求还有较大差距，因此通过分子改造方法获得比酶活明显提高的嗜热嗜碱木聚糖酶，对其在工业应用上的推广有重要意义。
发明内容
鉴于现有技术的不足，本发明的目的是提供一种嗜热嗜碱木聚糖酶突变体，尤其是一种与嗜热嗜碱木聚糖酶的比酶活显著关联的突变位点，以及一种具有更高比酶活的嗜热嗜碱木聚糖酶突变体及其编码基因和制备方法与应用。
为了实现本发明的技术目的，发明人通过大量试验摸索和研究，最终以野生型嗜热嗜碱木聚糖酶的基因为模板，采用倾向错误PCR、4点饱和突变和定点突变技术获得编码突变体的基因，随后将编码突变体的基因位点进行重组表达，最终获得了一种比酶活提高的嗜热嗜碱木聚糖酶突变体。
具体来说，本发明是以来源于Bacillus halodurans S7的野生型嗜热嗜碱木聚糖酶基因(SEQ ID NO.7)为模板，采用error-prone PCR进行随机突变，用96孔板筛选得到比酶活提高的嗜热嗜碱木聚糖酶突变体1；突变体1是将核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的野生嗜热嗜碱木聚糖酶的第262位的丙氨酸A突变为苏氨酸T而得。
以来源于Bacillus halodurans S7的野生型嗜热嗜碱木聚糖酶基因(SEQ IDNO.7)为模板，采用4点饱和突变和组合突变，用96孔板筛选得到比酶活提高的嗜盐嗜碱木聚糖酶突变体2；突变体2是将核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的野生嗜热嗜碱木聚糖酶的第220位的缬氨酸Val突变成天冬酰胺Asn,第251位的谷氨酰胺Gln突变成丝氨酸Ser，第254位的色氨酸Try突变为精氨酸Arg而得。
以上述突变体2基因为模板，采用定点突变的方法获得嗜热嗜碱木聚糖酶突变体3；突变体3是将上述嗜热嗜碱木聚糖酶突变体2的第262位的丙氨酸Ala定点突变为苏氨酸Thr而得。
进一步地，本发明的技术方案概况如下：
一种与嗜热嗜碱木聚糖酶的比酶活显著关联的突变位点，该突变位点位于野生型嗜热嗜碱木聚糖酶的262氨基酸处，所述位点是将第262位的丙氨酸突变为苏氨酸，突变后嗜热嗜碱木聚糖酶的比酶活显著提高。
一种与嗜热嗜碱木聚糖酶的比酶活显著关联的突变位点，该突变位点位于野生型嗜热嗜碱木聚糖酶的220、251和254氨基酸处，所述位点是将第220位的缬氨酸突变成天冬酰胺,第251位的谷氨酰胺突变成丝氨酸，以及第254位的色氨酸突变为精氨酸，突变后嗜热嗜碱木聚糖酶的比酶活显著提高。
一种与嗜热嗜碱木聚糖酶的比酶活显著关联的突变位点，该突变位点位于野生型嗜热嗜碱木聚糖酶的220、251、254和262氨基酸处，所述位点是将第220位的缬氨酸突变成天冬酰胺,第251位的谷氨酰胺突变成丝氨酸，第254位的色氨酸突变为精氨酸，以及第262位的丙氨酸突变为苏氨酸，突变后嗜热嗜碱木聚糖酶的比酶活显著提高。
由于按上述突变位点突变后得到的嗜热嗜碱木聚糖酶的比酶活显著提高，因此本发明还保护上述的突变位点在提高野生型嗜热嗜碱木聚糖酶的比酶活中的应用。
一种比酶活提高的嗜热嗜碱木聚糖酶突变体，所述突变体具有：
(1)SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列；或
(2)在SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列基础上缺失、替换、插入或/和添加一个至几个氨基酸的保守性突变而获得的具有嗜热嗜碱木聚糖酶活性的氨基酸序列；或
(3)在SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列基础上缺失、替换、插入或/和添加一个至几个氨基酸的保守性突变而获得的具有嗜热嗜碱木聚糖酶活性的氨基酸序列；或
(4)在SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列基础上缺失、替换、插入或/和添加一个至几个氨基酸的保守性突变而获得的具有嗜热嗜碱木聚糖酶活性的氨基酸序列。
在本发明的具体实施例中，氨基酸序列如SEQ ID NO.1的突变体是将核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的野生嗜热嗜碱木聚糖酶的第262位的丙氨酸A突变为苏氨酸T。所得突变体命名为A262T。
在本发明的具体实施例中，氨基酸序列如SEQ ID NO.2的突变体是将核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的野生嗜热嗜碱木聚糖酶的第220位的缬氨酸Val突变成天冬酰胺Asn,第251位的谷氨酰胺Gln突变成丝氨酸Ser，第254位的色氨酸Try突变为精氨酸Arg。所得突变体命名为V220N Q251S W254R。
在本发明的具体实施例中，氨基酸序列如SEQ ID NO.3的突变体是将核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的嗜热嗜碱木聚糖酶突变体的第262位的丙氨酸Ala突变为苏氨酸Thr。所得突变体命名为V220N Q251S W254R A262T。
一种嗜热嗜碱木聚糖酶突变体的编码基因，该基因编码具有SEQ IDNO.1、SEQ IDNO.2或SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列的蛋白质。
在具体实施例中，本发明是利用下述突变体编码基因来实现的，当然本领域技术人员也可以通过其他形式的简并密码基因序列来实现。
编码SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的突变体的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。
编码SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的突变体的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列。
编码SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列的突变体的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列。
本发明还提供一种携带上述基因的载体、重组细胞或重组菌。
本发明还提供一种制备嗜热嗜碱木聚糖酶突变体的方法，该方法包括培养上述的重组菌并由培养产物中收集嗜热嗜碱木聚糖酶突变体。具体地，本发明提供应用基因工程重组菌发酵生产所述嗜热嗜碱木聚糖酶突变体的方法，是将含有编码突变嗜热嗜碱木聚糖酶的基因的重组菌(例如：含有编码突变嗜热嗜碱木聚糖酶的基因的BL21(DE3))活化培养后接入50ml含有50μg/ml卡那霉素的LB发酵培养基中，于37℃，220rpm培养，菌体生长到一定阶段(OD600＝0.6-0.8)，加入终浓度为0.4mM IPTG进行诱导，继续37℃诱导发酵4h。将所得菌液离心后收集菌体，用破菌buffer重悬后，利用超声波破菌仪进行破菌处理。接着将破菌混合液离心后收集上清，即为嗜热嗜碱木聚糖酶粗酶液，该粗酶液中含有嗜热嗜碱木聚糖酶突变体。
所述活化培养是从甘油管中将重组菌划线于含有50μg/ml卡那霉素的LB固体平板中，37℃培养箱过夜培养。
将上述获得的破菌上清通过镍柱对其进行His纯化后所得纯化溶液，即为含有嗜热嗜碱木聚糖酶突变体的酶液。
由于本发明提供的嗜热嗜碱木聚糖酶突变体的比酶活有很大幅度的提高，更加适合低聚木糖制备和造纸工艺工业化生产的需要，因此本发明还保护上述比酶活提高的嗜热嗜碱木聚糖酶突变体在低聚木糖制备和工业造纸中的应用。
另外，本发明还提供一种获得上述嗜热嗜碱木聚糖酶突变体的方法，是以野生型嗜热嗜碱木聚糖酶Xyn10A的基因为模板，采用倾向错误PCR(error-prone PCR)、4点饱和突变和定点突变获得编码突变体的基因，随后将编码突变体的基因位点进行重组表达获得突变体。
具体来说，是将来源于Bacillus halodurans S7的野生型嗜热嗜碱木聚糖酶基因(SEQ ID NO.7)为模板，先采用error-prone PCR进行随机突变，用96孔板筛选得到比酶活提高的编码嗜盐嗜碱木聚糖酶突变体的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；采用4点饱和突变和组合突变，用96孔板筛选得到比酶活提高的编码嗜盐嗜碱木聚糖酶突变体的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；采用定点突变的方法获得编码嗜热嗜碱木聚糖酶突变体的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。经过测序鉴定所有突变位点均已成功按照预设目标得到突变。
所述重组表达优选以pET28a为表达载体，以大肠杆菌BL21(DE3)为表达宿主构建重组菌。
所述用于error-prone PCR的引物是：
正向引物Xyl-F：5'CGGGATCCATGAACGTTGCTGCTGCTCAAGG 3'；
反向引物Xyl-R：5'CCCAAGCTTTTAATCGATGATTCTCCAATAAGCTGGC 3'；
所述用于4点饱和突变的引物是：
F2 NDT：5'TTGGTCACCAATCCCACATTNDTATTGGTNNKCCATCCATCGAGGACACTAGAGCTT 3'
F2 VMA：5'TTGGTCACCAATCCCACATTVMAATTGGTNNKCCATCCATCGAGGACACTAGAGCTT 3'
F2 ATG：5'TTGGTCACCAATCCCACATTATGATTGGTNNKCCATCCATCGAGGACACTAGAGCTT 3'
F2 TGG：5'TTGGTCACCAATCCCACATTTGGATTGGTNNKCCATCCATCGAGGACACTAGAGCTT 3'
F3：5'CCACCAACTGGTGCTTACACTTCTTA 3'
R1：5'AACCAAATTGTACAAGTCATCTCTCTTGGATGGKNNCTCAGTGTTGTAGTCGTTGATGT 3'
R2：5'CCATCAATTGGAACACCCTGCTCCAACAAGTCCTTAACCAAATTGTACAAGTCATCTCT 3'
R3：5'AATGTGGGATTGGTGACCAACACCATCAATTGGAACACCCTGCTC 3'
R4 NDT：5'AGTGTAAGCACCAGTTGGTGGAHNACCGTACAAGGACATATCCAACTCA 3'
R4 VMA：5'AGTGTAAGCACCAGTTGGTGGTKBACCGTACAAGGACATATCCAACTCA 3'
R4 ATG：5'AGTGTAAGCACCAGTTGGTGGCATACCGTACAAGGACATATCCAACTCA 3'
R4 TGG：5'AGTGTAAGCACCAGTTGGTGGCCAACCGTACAAGGACATATCCAACTCA 3'
所述用于定点突变的引物是：
A262T-F:5'GACACTAGAACTTCTTTCGAGAAGTTCACTTC 3'
A262T-R:5'GAAGTGAACTTCTCGAAAGAAGTTCTAGTGTC 3'
与现有技术相比，本发明通过随机突变、4点饱和突变、定点突变的方法改造嗜热嗜碱木聚糖酶基因，使所编码的木聚糖酶比酶活大幅度提高。具体试验数据显示，突变后的三种嗜热嗜碱木聚糖酶突变体比酶活提高为221.1、375.1、486.2U/mg，是野生型的2.01、3.41、4.42倍。因此，本发明提供的嗜热嗜碱木聚糖酶的比酶活有很大幅度的提高，更加适合造纸工艺工业化生产的需要，满足社会生产的需求。
附图说明
图1：平板功能筛选图；
图2：96孔板酶活测定筛选图；
图3：以含有原始木聚糖酶基因xyn10A的质粒为模板，用设计的引物对进行重叠延伸PCR扩增方法示意图；
具体实施方式
以下对本发明的原理和特征进行更为详细的描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、嗜热嗜碱木聚糖酶突变体的获得
一、随机突变得到A262T
通过error-prone PCR构建嗜热嗜碱木聚糖酶基因xyn10A突变体库，根据嗜热嗜碱木聚糖酶基因xyn10A的核苷酸序列设计PCR引物对如下：
正向引物Xyl-F：5'CGGGATCCATGAACGTTGCTGCTGCTCAAGG 3'；
反向引物Xyl-R：5'CCCAAGCTTTTAATCGATGATTCTCCAATAAGCTGGC 3'；
正向引物的下划线部分为BamH I的酶切位点，反向引物的下划线部分为HindIII酶切位点。
以原始基因xyn10A为模板(序列信息如SEQ ID NO.7所示)，用设计的引物对进行error-prone PCR扩增。
PCR反应体系：
Figure BDA0001674550970000091
PCR反应条件：94℃预变性5min，然后91℃变性1min，55℃退火30s，72℃延伸70s，25个循环，最后72℃延伸5min。PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测产量和特异性，并用DNA纯化试剂盒纯化。
将PCR产物片段和pET28a载体(购自Stratagene)用BamHI和HindIII双酶切，琼脂糖电泳回收酶切产物，酶连后电转化入大肠杆菌BL21(DE3)细胞(购自Transgene)，涂布于含有50μg/ml卡那霉素以及1％木聚糖底物的LB平板(每个平板上涂布2μl 0.5M的IPTG)，37℃过夜培养。平板上得到的菌株即为嗜热嗜碱木聚糖酶基因突变体库(图1)，将每个平板上含有较大水解圈的单菌落接种于含有200μl(含有50μg/ml卡那霉素)LB的96孔板中37℃培养12h，用终浓度为0.4mM IPTG诱导2h，用破菌缓冲液(购自GBCBIO technology)破菌后取上清测酶活(图2)，用这些方法筛选出酶活提高的菌株后，通过基因测序确定突变体突变位点后，再和野生型一起单独摇瓶诱导发酵纯化出相应蛋白，计算比酶活，最后我们得到比酶活明显提高的突变体A262T。从该突变体菌株中得到的质粒为pET28a-A262T，该质粒携带有SEQ ID NO.4所示的序列。
二、4点饱和库得到V220N Q251S W254R
通过设计蛋白底物进口处4个位点V220Q251W254W286的饱和突变简并引物，从而筛选更好的突变体。根据嗜热嗜碱木聚糖酶基因xyn10A的核苷酸序列设计简并引物对如下：
F2 NDT：5'TTGGTCACCAATCCCACATTNDTATTGGTNNKCCATCCATCGAGGACACTAGAGCTT 3'
F2 VMA：5'TTGGTCACCAATCCCACATTVMAATTGGTNNKCCATCCATCGAGGACACTAGAGCTT 3'
F2 ATG：5'TTGGTCACCAATCCCACATTATGATTGGTNNKCCATCCATCGAGGACACTAGAGCTT 3'
F2 TGG：5'TTGGTCACCAATCCCACATTTGGATTGGTNNKCCATCCATCGAGGACACTAGAGCTT 3'
F3：5'CCACCAACTGGTGCTTACACTTCTTA 3'
R1：5'AACCAAATTGTACAAGTCATCTCTCTTGGATGGKNNCTCAGTGTTGTAGTCGTTGATGT 3'
R2：5'CCATCAATTGGAACACCCTGCTCCAACAAGTCCTTAACCAAATTGTACAAGTCATCTCT 3'
R3：5'AATGTGGGATTGGTGACCAACACCATCAATTGGAACACCCTGCTC 3'
R4 NDT：5'AGTGTAAGCACCAGTTGGTGGAHNACCGTACAAGGACATATCCAACTCA 3'
R4 VMA：5'AGTGTAAGCACCAGTTGGTGGTKBACCGTACAAGGACATATCCAACTCA 3'
R4 ATG：5'AGTGTAAGCACCAGTTGGTGGCATACCGTACAAGGACATATCCAACTCA 3'
R4 TGG：5'AGTGTAAGCACCAGTTGGTGGCCAACCGTACAAGGACATATCCAACTCA 3'
以含有原始木聚糖酶基因xyn10A的质粒为模板，用设计的引物对进行重叠延伸PCR扩增。
PCR反应体系：
Figure BDA0001674550970000111
PCR反应条件：94℃预变性5min，然后94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸(延伸时间按1min/1kb计算)，20个循环，最后72℃延伸10min。
PCR方法如图3所示(如果一个位点有4对引物，把引物混在一起进行PCR)，由图中可以看出整个基因被分成3段，即第一段是由开始到753(即氨基酸位点251)前面，第二段由753到858(即氨基酸位点286)后面，剩下的为另一段。对于基因第一段的扩增，首先以Xyl-F和R1为引物对，以基因xyn10A为模板扩增10个循环，回收后以回收产物为模板以Xyl-F和R2为引物对扩增10个循环，回收后再以回收产物为模板以Xyl-F和R3为引物对扩增20个循环，回收即得到基因第一段。对于基因第二段和第三段的扩增，分别以混合F2和混合R4、F3和Xyl-R为引物对，以基因xyn10A为模板扩增20个循环，回收后即得到相应基因片段。3段分别得到后，利用重叠延伸PCR连接成整个基因。
最终PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测产量和特异性，并用DNA纯化试剂盒纯化。
将PCR产物回收片段和pET28a载体(购自Stratagene)分别用BamHI和HindIII双酶切，琼脂糖电泳回收酶切产物，酶连后电转化入大肠杆菌BL21(DE3)细胞(购自Transgene)，涂布于含有50g/ml卡那霉素以及1％木聚糖底物的LB平板(每个平板上涂布2μl 0.5M的IPTG)，37℃过夜培养。平板上得到的菌株即为嗜热嗜碱木聚糖酶基因突变体库(图1)，将每个平板上含有较大水解圈的单菌落接种于含有200μl(含有50μg/ml卡那霉素)LB的96孔板中37℃培养12h，用终浓度为0.4mM IPTG诱导2h，用破菌缓冲液(购自GBCBIO technology)破菌后取上清测酶活(图2)，用这些方法筛选出酶活提高的菌株后，通过基因测序确定突变体突变位点后，再和野生型一起单独摇瓶诱导发酵纯化出相应蛋白，计算比酶活，最后我们通过突变分析以及组合突变得到比酶活明显提高的突变体V220N Q251S W254R。从该突变体菌株中质粒pET28a-V220N Q251S W254R携带有SEQ ID NO.5所示的序列。
三、定点突变得到突变体V220N Q251S W254R A262T
在突变体V220N Q251S W254R的基础上，将262位的丙氨酸A突变为苏氨酸T，根据嗜热嗜碱木聚糖酶突变体V220N Q251S W254R的核苷酸序列设计点突变引物对如下：
A262T-F:5'GACACTAGAACTTCTTTCGAGAAGTTCACTTC 3'
A262T-R:5'GAAGTGAACTTCTCGAAAGAAGTTCTAGTGTC 3'
以带有突变体V220N Q251S W254R基因的质粒为模板，用设计的引物对进行PCR扩增，PCR反应体系：
PrimeSTAR Max DNA聚合酶
(购自TAKARA公司，货号Code 25μL
No.:R045A)
Figure BDA0001674550970000131
PCR反应条件：98℃预变性30s，然后98℃变性10s，55℃退火5s，72℃延伸40s(该酶延伸时间5s/kb)，25个循环，最后72℃延伸5min。
PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测产量和特异性，并用DNA纯化试剂盒纯化。将纯化后的PCR产物用DpnI进行去模板处理，转化到大肠杆菌Gold克隆感受态细胞中，挑选两个转化子进行测序得到正确的点突变的重组载体pET28a-V220N Q251S W254R A262T。
重组载体pET28a-V220N Q251S W254R A262T含有SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列。
实施例2、嗜热嗜碱木聚糖酶的表达纯化
将4种重组菌BL21(DE3)/pET28a-xyn10A、BL21(DE3)/pET28a-A262T、BL21(DE3)/pET28a-V220N Q251S W254R、BL21(DE3)/pET28a-V220N Q251S W254R A262T分别培养于50μg/ml卡那霉素的LB培养基中，37℃培养3h；OD600＝0.6-0.8时，加入I PTG至其在LB培养基中的终浓度0.4mM，37℃继续培养4h。
5000rpm、10min离心收集菌体，悬浮于溶液A(50mM Tris-HCl，pH8.5，150mM NaCl，20mM咪唑)中，于冰浴中超声破碎(60w，8min；超声2s，停止4s)，之后12000rpm离心10min除去细胞碎片，取上清液；将上清液过Ni-IDA His·Bind Superflow纯化柱，用5ml溶液A冲洗，再用10ml溶液B(50mM Tris-HCl，pH8.5，150mM NaCl，35m M咪唑)漂洗，最后用5ml溶液C(50mM Tris-HCl，pH8.5，150mM NaCl，500mM咪唑)洗脱，收集洗脱液，获得纯化的4种嗜热嗜碱木聚糖酶的溶液。
SDS-PAGE电泳显示纯化的Xyn10A、A262T、V220N Q251S W254R、V220N Q251SW254R A262T蛋白的分子量均约为43kDa。
实施例3、四种嗜热嗜碱木聚糖酶的比酶活比较
一、木聚糖酶酶活的测定方法
绘制木糖浓度标准曲线：
取Gly-NaOH缓冲液200μL，加入DNS试剂250μL，沸水浴加热5min，冷却至室温，加500μL水定溶，制成标准空白样。取10.0mg/mL木糖溶液2.00、3.00、4.00、5.00、6.00、7.00、8.00、9.00、10.00mL，分别加Gly-NaOH缓冲液定溶至100mL，配制成浓度为0.20-1.00mg/mL木糖标准溶液。吸取以上浓度系列木糖标准溶液各200μL(三个平行)，分别加入到EP管中，随后加入250μL DNS试剂。振荡5s混匀后沸水浴加热5min，迅速冷却到室温，最后加500μL水定溶。以标准空白样为对照标零，测量540nm处的溶液吸光值。Y轴为木糖浓度、X轴为吸光值，绘制标准曲线。
木聚糖酶酶活测定：取100μL稀释到适当倍数的酶液，加入到冰上的EP管中，再向其中加入100μL 1％木聚糖底物(pH 10)，震荡混匀，70℃水浴锅中反应10min后，立即将EP插入冰中，迅速向EP管中加入250μL DNS试剂，震荡5s混匀后100℃金属浴6min，迅速冷却至室温后，加入500μL水，用酶标仪测定样品A540处吸光值。
酶活力的计算公式：
Figure BDA0001674550970000151
A 测量的酶反应液的吸光度A540
K 标准曲线的斜率
CO 标准曲线的截距
M 木糖的摩尔质量(150.2)
t 酶解反应时间，min
Df 酶反应液的总稀释倍数
1000转化因子，1mmol＝1000μmol
二、蛋白浓度测定方法
根据考马斯亮蓝G-250有红、蓝两种不同颜色的形式。在一定浓度的乙醇及酸性条件下，可配成淡红色的溶液，当与蛋白质结合后，产生蓝色化合物，反应迅速而稳定。反应化合物在465-595nm处有最大光吸收值，化合物颜色的深浅与蛋白浓度的高低成正比关系。取纯的BSA小牛血清蛋白，根据其纯度同0.05mol/L Tris-HCl C缓冲液配制成0.5mg/ml蛋白溶液。吸取标准蛋白溶液0、1、2、4、8、12、16和20μl，用Tris-HCl C缓冲液定容至20μl；样品蛋白与Gly-NaOH缓冲液以一定比例混合，总体积为20μl。在595nm处测定吸光度OD值，绘制蛋白浓度与OD595的标准曲线。
利用标准曲线测得各个酶液中的蛋白浓度。
三、比酶活比较
利用测得酶活除以蛋白浓度得到比酶活，实验结果列于表1，将野生酶与突变酶相比，可以发现三株突变酶的比酶活和野生酶相比有大幅度的提高，突变后的嗜热嗜碱木聚糖酶突变体比酶活分别提高至221.1、375.1、486.2U/mg，是野生型的2.01、3.41、4.42倍。
表1野生酶与嗜热嗜碱木聚糖酶突变体的比酶活比较
Figure BDA0001674550970000161
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 湖北大学
<120> 一种比酶活提高的嗜热嗜碱木聚糖酶突变体及其在工业中的应用
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 373
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Asn Val Ala Ala Ala Gln Gly Gly Pro Pro Lys Ser Gly Val Phe
1 5 10 15
Gly Glu Asn Gln Lys Arg Asn Asp Gln Pro Phe Ala Trp Gln Val Ala
20 25 30
Ser Leu Ser Glu Arg Tyr Gln Glu Gln Phe Asp Ile Gly Ala Ala Val
35 40 45
Glu Pro Tyr Gln Leu Glu Gly Arg Gln Ala Gln Ile Leu Lys His His
50 55 60
Tyr Asn Ser Leu Val Ala Glu Asn Ala Met Lys Pro Val Ser Leu Gln
65 70 75 80
Pro Arg Glu Gly Glu Trp Asn Trp Glu Gly Ala Asp Lys Ile Val Glu
85 90 95
Phe Ala Arg Lys His Asn Met Glu Leu Arg Phe His Thr Leu Val Trp
100 105 110
His Ser Gln Val Pro Glu Trp Phe Phe Ile Asp Glu Asn Gly Asn Arg
115 120 125
Met Val Asp Glu Thr Asp Pro Glu Lys Arg Lys Ala Asn Lys Gln Leu
130 135 140
Leu Leu Glu Arg Met Glu Asn His Ile Lys Thr Val Val Glu Arg Tyr
145 150 155 160
Lys Asp Asp Val Thr Ser Trp Asp Val Val Asn Glu Val Ile Asp Asp
165 170 175
Gly Gly Gly Leu Arg Glu Ser Glu Trp Tyr Gln Ile Thr Gly Thr Asp
180 185 190
Tyr Ile Lys Val Ala Phe Glu Thr Ala Arg Lys Tyr Gly Gly Glu Glu
195 200 205
Ala Lys Leu Tyr Ile Asn Asp Tyr Asn Thr Glu Val Pro Ser Lys Arg
210 215 220
Asp Asp Leu Tyr Asn Leu Val Lys Asp Leu Leu Glu Gln Gly Val Pro
225 230 235 240
Ile Asp Gly Val Gly His Gln Ser His Ile Gln Ile Gly Trp Pro Ser
245 250 255
Ile Glu Asp Thr Arg Thr Ser Phe Glu Lys Phe Thr Ser Leu Gly Leu
260 265 270
Asp Asn Gln Val Thr Glu Leu Asp Met Ser Leu Tyr Gly Trp Pro Pro
275 280 285
Thr Gly Ala Tyr Thr Ser Tyr Asp Asp Ile Pro Glu Glu Leu Phe Gln
290 295 300
Ala Gln Ala Asp Arg Tyr Asp Gln Leu Phe Glu Leu Tyr Glu Glu Leu
305 310 315 320
Ser Ala Thr Ile Ser Ser Val Thr Phe Trp Gly Ile Ala Asp Asn His
325 330 335
Thr Trp Leu Asp Asp Arg Ala Arg Glu Tyr Asn Asn Gly Val Gly Val
340 345 350
Asp Ala Pro Phe Val Phe Asp His Asn Tyr Arg Val Lys Pro Ala Tyr
355 360 365
Trp Arg Ile Ile Asp
370
<210> 2
<211> 373
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Asn Val Ala Ala Ala Gln Gly Gly Pro Pro Lys Ser Gly Val Phe
1 5 10 15
Gly Glu Asn Gln Lys Arg Asn Asp Gln Pro Phe Ala Trp Gln Val Ala
20 25 30
Ser Leu Ser Glu Arg Tyr Gln Glu Gln Phe Asp Ile Gly Ala Ala Val
35 40 45
Glu Pro Tyr Gln Leu Glu Gly Arg Gln Ala Gln Ile Leu Lys His His
50 55 60
Tyr Asn Ser Leu Val Ala Glu Asn Ala Met Lys Pro Val Ser Leu Gln
65 70 75 80
Pro Arg Glu Gly Glu Trp Asn Trp Glu Gly Ala Asp Lys Ile Val Glu
85 90 95
Phe Ala Arg Lys His Asn Met Glu Leu Arg Phe His Thr Leu Val Trp
100 105 110
His Ser Gln Val Pro Glu Trp Phe Phe Ile Asp Glu Asn Gly Asn Arg
115 120 125
Met Val Asp Glu Thr Asp Pro Glu Lys Arg Lys Ala Asn Lys Gln Leu
130 135 140
Leu Leu Glu Arg Met Glu Asn His Ile Lys Thr Val Val Glu Arg Tyr
145 150 155 160
Lys Asp Asp Val Thr Ser Trp Asp Val Val Asn Glu Val Ile Asp Asp
165 170 175
Gly Gly Gly Leu Arg Glu Ser Glu Trp Tyr Gln Ile Thr Gly Thr Asp
180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
Asp Asp Leu Tyr Asn Leu Val Lys Asp Leu Leu Glu Gln Gly Val Pro
225 230 235 240
Ile Asp Gly Val Gly His Gln Ser His Ile Ser Ile Gly Arg Pro Ser
245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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290 295 300
Ala Gln Ala Asp Arg Tyr Asp Gln Leu Phe Glu Leu Tyr Glu Glu Leu
305 310 315 320
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340 345 350
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355 360 365
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370
<210> 3
<211> 373
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Met Asn Val Ala Ala Ala Gln Gly Gly Pro Pro Lys Ser Gly Val Phe
1 5 10 15
Gly Glu Asn Gln Lys Arg Asn Asp Gln Pro Phe Ala Trp Gln Val Ala
20 25 30
Ser Leu Ser Glu Arg Tyr Gln Glu Gln Phe Asp Ile Gly Ala Ala Val
35 40 45
Glu Pro Tyr Gln Leu Glu Gly Arg Gln Ala Gln Ile Leu Lys His His
50 55 60
Tyr Asn Ser Leu Val Ala Glu Asn Ala Met Lys Pro Val Ser Leu Gln
65 70 75 80
Pro Arg Glu Gly Glu Trp Asn Trp Glu Gly Ala Asp Lys Ile Val Glu
85 90 95
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100 105 110
His Ser Gln Val Pro Glu Trp Phe Phe Ile Asp Glu Asn Gly Asn Arg
115 120 125
Met Val Asp Glu Thr Asp Pro Glu Lys Arg Lys Ala Asn Lys Gln Leu
130 135 140
Leu Leu Glu Arg Met Glu Asn His Ile Lys Thr Val Val Glu Arg Tyr
145 150 155 160
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165 170 175
Gly Gly Gly Leu Arg Glu Ser Glu Trp Tyr Gln Ile Thr Gly Thr Asp
180 185 190
Tyr Ile Lys Val Ala Phe Glu Thr Ala Arg Lys Tyr Gly Gly Glu Glu
195 200 205
Ala Lys Leu Tyr Ile Asn Asp Tyr Asn Thr Glu Asn Pro Ser Lys Arg
210 215 220
Asp Asp Leu Tyr Asn Leu Val Lys Asp Leu Leu Glu Gln Gly Val Pro
225 230 235 240
Ile Asp Gly Val Gly His Gln Ser His Ile Ser Ile Gly Arg Pro Ser
245 250 255
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260 265 270
Asp Asn Gln Val Thr Glu Leu Asp Met Ser Leu Tyr Gly Trp Pro Pro
275 280 285
Thr Gly Ala Tyr Thr Ser Tyr Asp Asp Ile Pro Glu Glu Leu Phe Gln
290 295 300
Ala Gln Ala Asp Arg Tyr Asp Gln Leu Phe Glu Leu Tyr Glu Glu Leu
305 310 315 320
Ser Ala Thr Ile Ser Ser Val Thr Phe Trp Gly Ile Ala Asp Asn His
325 330 335
Thr Trp Leu Asp Asp Arg Ala Arg Glu Tyr Asn Asn Gly Val Gly Val
340 345 350
Asp Ala Pro Phe Val Phe Asp His Asn Tyr Arg Val Lys Pro Ala Tyr
355 360 365
Trp Arg Ile Ile Asp
370
<210> 4
<211> 1119
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atgaacgttg ctgctgctca aggtggtcca ccaaagtctg gtgtttttgg tgagaaccag 60
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cagttcgaca ttggtgctgc tgttgagcca taccaattgg agggtagaca ggctcagatt 180
ttgaagcacc actacaattc cttggttgct gagaacgcta tgaagccagt ttccttgcaa 240
cctagagaag gtgaatggaa ctgggaaggt gctgacaaga tcgttgagtt cgctagaaag 300
cacaacatgg aattgagatt ccacactttg gtttggcact cccaagttcc agagtggttc 360
ttcattgacg agaacggtaa cagaatggtt gacgagactg acccagaaaa gagaaaggct 420
aacaagcagt tgttgttgga gagaatggaa aaccacatca agactgttgt tgaaagatac 480
aaggacgacg ttacttcctg ggacgttgtt aacgaggtta ttgatgacgg tggtggtttg 540
agagaatccg agtggtatca gatcactggt actgactaca tcaaggttgc tttcgagact 600
gctagaaagt acggtggtga agaggctaag ttgtacatca acgactacaa cactgaggtt 660
ccatccaaga gagatgactt gtacaatttg gttaaggact tgttggagca gggtgttcca 720
attgatggtg ttggtcacca atcccacatt cagattggtt ggccatccat cgaggacact 780
agaacttctt tcgagaagtt cacttccttg ggtttggaca accaggttac tgagttggat 840
atgtccttgt acggttggcc accaactggt gcttacactt cttacgacga catcccagaa 900
gagttgttcc aagctcaagc tgacagatac gaccagttgt tcgagttgta cgaggaattg 960
tccgctacta tctcctccgt tacattctgg ggtattgctg acaaccacac ttggttggat 1020
gacagagcta gagagtacaa caacggagtt ggtgttgacg ctccattcgt tttcgaccac 1080
aactacagag ttaagccagc ttattggaga atcatcgat 1119
<210> 5
<211> 1119
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atgaacgttg ctgctgctca aggtggtcca ccaaagtctg gtgtttttgg tgagaaccag 60
aagagaaacg accagccatt tgcttggcaa gttgcttctt tgtccgagag ataccaagag 120
cagttcgaca ttggtgctgc tgttgagcca taccaattgg agggtagaca ggctcagatt 180
ttgaagcacc actacaattc cttggttgct gagaacgcta tgaagccagt ttccttgcaa 240
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<210> 6
<211> 1119
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
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ccatccaaga gagatgactt gtacaatttg gttaaggact tgttggagca gggtgttcca 720
attgatggtg ttggtcacca atcccacatt tcgattggtc ggccatccat cgaggacact 780
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<210> 7
<211> 1119
<212> DNA
<213> 嗜碱芽孢杆菌S7(Bacillus halodurans S7)
<400> 7
atgaacgttg ctgctgctca aggtggtcca ccaaagtctg gtgtttttgg tgagaaccag 60
aagagaaacg accagccatt tgcttggcaa gttgcttctt tgtccgagag ataccaagag 120
cagttcgaca ttggtgctgc tgttgagcca taccaattgg agggtagaca ggctcagatt 180
ttgaagcacc actacaattc cttggttgct gagaacgcta tgaagccagt ttccttgcaa 240
cctagagaag gtgaatggaa ctgggaaggt gctgacaaga tcgttgagtt cgctagaaag 300
cacaacatgg aattgagatt ccacactttg gtttggcact cccaagttcc agagtggttc 360
ttcattgacg agaacggtaa cagaatggtt gacgagactg acccagaaaa gagaaaggct 420
aacaagcagt tgttgttgga gagaatggaa aaccacatca agactgttgt tgaaagatac 480
aaggacgacg ttacttcctg ggacgttgtt aacgaggtta ttgatgacgg tggtggtttg 540
agagaatccg agtggtatca gatcactggt actgactaca tcaaggttgc tttcgagact 600
gctagaaagt acggtggtga agaggctaag ttgtacatca acgactacaa cactgaggtt 660
ccatccaaga gagatgactt gtacaatttg gttaaggact tgttggagca gggtgttcca 720
attgatggtg ttggtcacca atcccacatt cagattggtt ggccatccat cgaggacact 780
agagcttctt tcgagaagtt cacttccttg ggtttggaca accaggttac tgagttggat 840
atgtccttgt acggttggcc accaactggt gcttacactt cttacgacga catcccagaa 900
gagttgttcc aagctcaagc tgacagatac gaccagttgt tcgagttgta cgaggaattg 960
tccgctacta tctcctccgt tacattctgg ggtattgctg acaaccacac ttggttggat 1020
gacagagcta gagagtacaa caacggagtt ggtgttgacg ctccattcgt tttcgaccac 1080
aactacagag ttaagccagc ttattggaga atcatcgat 1119

Claims (9)

1.一种提高野生型嗜热嗜碱木聚糖酶的比酶活的方法，其特征在于，该方法包括将野生型嗜热嗜碱木聚糖酶第262位的丙氨酸突变为苏氨酸，所述野生型嗜热嗜碱木聚糖酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
2.一种提高野生型嗜热嗜碱木聚糖酶的比酶活中的方法，其特征在于，该方法包括将野生型嗜热嗜碱木聚糖酶第220位的缬氨酸突变成天冬酰胺,第251位的谷氨酰胺突变成丝氨酸，以及第254位的色氨酸突变为精氨酸，所述野生型嗜热嗜碱木聚糖酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
3.一种提高野生型嗜热嗜碱木聚糖酶的比酶活中的方法，其特征在于，该方法包括将野生型嗜热嗜碱木聚糖酶第220位的缬氨酸突变成天冬酰胺,第251位的谷氨酰胺突变成丝氨酸，第254位的色氨酸突变为精氨酸，以及第262位的丙氨酸突变为苏氨酸，所述野生型嗜热嗜碱木聚糖酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
4.一种比酶活提高的嗜热嗜碱木聚糖酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示。
5.一种嗜热嗜碱木聚糖酶突变体的编码基因，其特征在于，该基因编码SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列的蛋白质。
6.根据权利要求5所述的嗜热嗜碱木聚糖酶突变体的编码基因，其特征在于，所述基因为(i)、(ii)或(iii)的DNA分子：
(i)SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列；
(ii)SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列；
(iii)SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列。
7.一种携带权利要求5或6所述基因的载体、重组细胞或重组菌。
8.一种制备突变嗜热嗜碱木聚糖酶的方法，其特征在于，该方法包括培养权利要求7所述的重组菌并由培养产物中收集突变嗜热嗜碱木聚糖酶。
9.权利要求4所述比酶活提高的嗜热嗜碱木聚糖酶突变体在制备低聚木糖或工业造纸中的应用。
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