CN116410960B - 嗜盐适冷及pH适应性改良的β-木糖苷酶突变体D41G及其应用 - Google Patents
嗜盐适冷及pH适应性改良的β-木糖苷酶突变体D41G及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种嗜盐适冷及pH适应性改良的β‑木糖苷酶突变体D41G及其应用，涉及基因工程技术领域。该突变体D41G的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。该突变体D41G的最适pH为5.0，最适温度为30℃，其活性可以被NaCl和NaBr激活，且在转化三七皂苷R1的酶解体系中添加NaCl能提高转化速率。该突变体D41G在0℃有26.03％的酶活，与氨基酸序列如SEQ IDNO.7所示的重组野生β‑木糖苷酶JB13GH39P28相比，在50℃的热稳定性显著降低，有利于酶的安全使用，可应用于低温含盐环境要求下的生物技术领域，尤其可应用于食品、酿造、洗涤、造纸、污水处理等行业。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种嗜盐适冷及pH适应性改良的β-木糖苷酶突变体D41G及其应用。
背景技术
木聚糖是半纤维素的主要组成成分，是自然界中除纤维素之外最丰富的多糖，作为第二大丰富的可再生资源，其来源丰富，在农、林等副产品中广泛存在并被利用。由于木聚糖来源丰富，其结构包括主链聚合度、侧链聚合度会随着木聚糖来源的不同有所不同，因此，木聚糖的降解需要一系列酶的参与，其中内切-1,4-β-D-木聚糖酶(EC 3.2.1.8)和β-木糖苷酶(EC 3.2.1.37)在木聚糖的降解中起关键作用。内切-1,4-β-D-木聚糖酶降解木聚糖的主链，水解木糖主链的糖苷键产生寡糖，β-木糖苷酶与外切酶相互促进，同时切割木寡糖产生木糖。
近年来，包含β-木糖苷酶在内的木聚糖酶系因其在食品、纸浆漂白、生物燃料生产、农业废弃物生物转化等工业生产中的应用潜力而引起广泛关注。然而，大多数工业的操作工艺都不是在单一条件下开展，这就要求酶同时具有耐热、耐酸碱、耐盐、耐冷等特性中的几种性质，例如，在食品行业中，β-木糖苷酶应用可以作为改良剂提高面包的品质，面包烘焙食品的新半成品——冷冻面团，不仅能加工成特色食品，还有保证新鲜度和容易加工的优势，而面团准备一般在35℃的条件下进行(Collins T,Gerday C,FellerG.Xylanases,xylanase families and extremophilic xylanases[J].Fems MicrobiolReviews,2005,29(1):3-23.)这就需要应用于此操作工艺的酶是较低温度下有最大活性的冷适应酶。另外，会根据需要在冷冻面团中添加调味剂、着色剂、维生素和矿物质等，盐是调味剂之一，在含盐环境中能保持稳定催化活性的酶才能发挥催化作用。因此，嗜盐适冷的酶才能在这个行业有更大的应用价值。
适冷酶在0℃仍有活性，但普遍耐热性低，能在低温要求的生物技术领域表现出强活性，同时又能提高温度以温和的条件使酶失活而控制工业生产过程；嗜盐酶不仅能在高盐环境保持活性，其受盐激活的特点也有利于通过调整盐浓度来控制催化反应；pH适应性改良的酶应用在工业上可降低调pH的酸碱溶液的耗费。因此，开发出一种嗜盐适冷和pH适应性改良的木糖苷酶有利于其在食品、酿造、洗涤、造纸、污水处理等行业中的应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种嗜盐适冷及pH适应性改良的β-木糖苷酶突变体D41G及其应用，该突变体的最适pH为5.0，在0℃仍有26.03％的酶活，最适温度为30℃，与氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示的重组野生β-木糖苷酶JB13GH39P28相比，最适温度下降了20℃，当温度高于50℃时，其酶活迅速降低，这种特性有利于酶的安全使用。本发明提供的D41G可应用于低温含盐环境要求下的生物技术领域，尤其可应用于食品、酿造、洗涤、造纸、污水处理等行业。
为了达到上述目的，本发明提供了一种嗜盐适冷及pH适应性改良的β-木糖苷酶突变体D41G，该突变体D41G的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，该突变体D41G在0℃有26.03％的酶活，在转化三七皂苷R1的酶解体系中添加NaCl可提高转化速率。
本发明提供了上述嗜盐适冷及pH适应性改良的β-木糖苷酶突变体D41G的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供了一种包含上述编码基因的重组质粒。
优选地，上述重组质粒选自pET-28a(+)。
本发明还提供了一种包含上述编码基因的重组菌。
优选地，上述重组菌选自大肠杆菌BL21(DE3)。
本发明提供的嗜盐适冷及pH适应性改良的β-木糖苷酶突变体D41G可应用在低温含盐环境要求下的生物技术领域中，尤其可用于食品、酿造、洗涤、造纸或污水处理中。
本发明提供的嗜盐适冷及pH适应性改良的β-木糖苷酶突变体D41G，解决了野生β-木糖苷酶低温活性差，且pH适应性低等问题，具有以下优点：
本发明提供的突变体D41G与重组野生β-木糖苷酶JB13GH39P28相比，突变体D41G热性质、pH适应性、在3.0～30.0％(w/v)NaCl和NaBr中的活性及稳定性发生了改变。突变体D41G最适温度为30℃，低温活性提高且在50℃的热稳定降低，其最适pH向碱性区域偏移0.5个单位且在碱性条件下的活性提高，此外，NaCl和NaBr对该酶的酶活有激活作用，且在转化三七皂苷R1的酶解体系中添加终浓度为15.0％(w/v)NaCl能提高转化速率。纯化的重组野生酶JB13GH39P28的最适温度为50℃，在10℃、20℃、30℃、40℃和60℃时分别具有10.67％、23.94％、43.61％、69.58％和77.97％的酶活；突变体D41G的最适温度为30℃，在0℃、10℃、20℃、40℃、50℃和60℃时分别具有26.03％、44.66％、79.56％、56.86％、10.31％、4.02％的酶活；50℃处理60min后，野生酶JB13GH39P28保持83.17％的酶活，而突变体D41G的酶活下降至32.89％。纯化的重组野生酶JB13GH39P28的最适pH为4.5，而突变体D41G的最适pH为5.0；在3.0～30.0％(w/v)NaCl中，突变体D41G的活性能从1.5U/mg提高到接近野生酶JB13GH39P28，突变体D41G经3.0～30.0％(w/v)NaCl处理60min后，酶活提高并超过野生酶JB13GH39P28；突变体D41G在3.0～30.0％(w/v)NaBr中的活性接近野生酶JB13GH39P28，在3.0～30.0％(w/v)NaBr中处理60min后，酶活提高，且在5％(w/v)NaBr中提高最多约7倍。该突变体D41G可应用于低温含盐环境要求下的生物技术领域，尤其可应用于食品、酿造、洗涤、造纸、污水处理等行业。
附图说明
图1为本发明中重组野生酶JB13GH39P28和突变体D41G的SDS-PAGE分析结果。
图2为本发明中重组野生酶JB13GH39P28和突变体D41G在不同pH中活性测定结果。
图3为本发明中重组野生酶JB13GH39P28和突变体D41G在不同pH中稳定性测定结果。
图4为本发明中重组野生酶JB13GH39P28和突变体D41G的热活性测定结果。
图5为本发明中重组野生酶JB13GH39P28和突变体D41G在50℃的热稳定性测定结果。
图6为本发明中重组野生酶JB13GH39P28和突变体D41G在NaCl中的活性测定结果。
图7为本发明中重组野生酶JB13GH39P28和突变体D41G在NaCl中的稳定性测定结果。
图8为本发明中重组野生酶JB13GH39P28和突变体D41G在NaBr中的活性测定结果。
图9为本发明中重组野生酶JB13GH39P28和突变体D41G在NaBr中的稳定性测定结果。
图10为本发明中重组野生酶JB13GH39P28和突变体D41G转化三七皂苷R1的产物的薄层层析结果。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明中所用到的部分实验材料和试剂：
1)菌株及载体：大肠杆菌Escherchia coli BL21(DE3)购于北京博迈德基因技术有限公司；pET-28a(+)表达载体来源于江苏苏州泓迅生物科技有限公司。
2)酶类及其它生化试剂：pNPX购自Sigma公司；Nickel-NTA蛋白纯化树脂购自QIAGEN公司；QuickMutationTM基因定点突变试剂盒购自碧云天生物技术公司；Dpn1消化酶购自Takara生物技术公司。
3)培养基：LB培养基：Peptone 10g，Yeast extract 5g。NaCl l0 g，加蒸馏水至1000mL，pH自然(约为7)。固体培养基在此基础上加2.0％(w/v)琼脂。
说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。
实验例1重组野生β-木糖苷酶JB13GH39P28表达载体的构建和转化
1)从GenBank中下载氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的β-木糖苷酶JB13GH39(编号为AZC12019.1)及其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的编码基因jb13gh39(编号为MG838204.1)，去除jb13gh39编码信号肽的序列(第1-57位核苷酸)后，委托苏州泓迅生物科技股份有限公司对jb13gh39编码成熟肽的序列(第58-1614位核苷酸)进行密码子优化，结果序列的GC含量由60％降低至48％，将优化后所获得的目的片段命名为jb13gh39p28，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，其长度为1557bp，也可以通过基因合成得到jb13gh39p28。
2)通过PCR的方式在jb13gh39p28的5’和3’端分别引入限制性酶切位点NcoⅠ(5’CCATGG 3’)和XhoⅠ(5’CTCGAG 3’)，得到序列nxjb13gh39p28，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，通过限制性酶酶切上述产物和表达载体pET-28a(+)，将nxjb13gh39p28和pET-28a(+)的酶切产物通过连接酶连接，获得包含nxjb13gh39p28的重组质粒nxjb13gh39p28-pET-28a(+)。
3)以nxjb13gh39p28-pET-28a(+)为模板，设计2条突变引物(F1和R1)，具体序列如下所示。通过PCR去除重组时在C端组氨酸标签前引入的1个亮氨酸和1个谷氨酸序列，PCR反应参数为：95℃变性30sec；然后95℃变性15sec，70℃退火15sec，72℃延伸3min 30sec，30个循环；72℃保温5min。最终获得包含jb13gh39p28的重组质粒jb13gh39p28-pET-28a(+)，重组后的jb13gh39p28形成的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，编码重组野生酶JB13GH39P28的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。
突变引物序列如下(5’→3’):
F1(SEQ ID NO.9)：
GAACGTAAACACCACCACCACCACCACTGAGAT；
R1(SEQ ID NO.10)：
GTGGTGGTGTTTACGTTCTTTCGGTGCAATACT。
4)将重组质粒jb13gh39p28-pET-28a(+)通过热激方式转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，获得包含jb13gh39p28的重组菌株BL21(DE3)/jb13gh39p28。
实验例2突变体D41G表达载体的构建和转化
1)将实验例1中所得包含重组质粒jb13gh39p28-pET-28a(+)的重组菌株以0.1％含量接种于LB培养基中(含50μg/mL卡那霉素)，37℃下过夜培养，通过试剂盒提取质粒。
2)以重组质粒jb13gh39p28-pET-28a(+)为模板，设计2条突变引物(F2和R2)，具体序列如下所示。利用QuickMutationTM基因定点突变试剂盒进行突变，PCR反应参数为：95℃变性30sec；然后95℃变性15sec，70℃退火15sec，72℃延伸3min 30sec，30个循环；72℃保温5min。PCR扩增得到包含核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的编码基因d41g的线性化重组质粒d41g-pET-28a(+)，该编码基因编码的突变体D41G，其氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。d41g和d41g-pET-28a(+)也可以通过基因合成得到。
突变引物序列如下(5’→3’):
F2(SEQ ID NO.11)：
TTGGCAGCGGTTATCCGGGTACCCTGATTCGT；
R2(SEQ ID NO.12)：
CGGATAACCGCTGCCAACGCTAAAATTATAAAA。
3)对PCR产物进行Dpn1酶消化，于37℃消化3h。
4)将消化产物通过热激方式转入大肠杆菌BL21(DE3)中，得到包含D41G编码基因d41g的重组菌株BL21(DE3)/d41g。
实验例3重组野生β-木糖苷酶JB13GH39P28和突变体D41G的制备
1)将实验例1和2中所得的重组菌株BL21(DE3)/jb13gh39p28和BL21(DE3)/d41g以0.1％的接种量分别接种于LB(含50μg/mL卡那霉素)培养液中，37℃、180rpm/min摇床中振荡16h进行活化。
2)将1)中活化的菌液以1％接种量分别接种到新鲜的LB(含50μg/mL卡那霉素)培养液中，于37℃、180rpm/min摇床中振荡培养约2～3h(OD600达到0.6～1.0)后，加入终浓度0.7mM的IPTG进行诱导，于20℃、160rpm/min摇床中继续振荡培养约20h诱导重组蛋白产生。
3)于4℃、6000rpm/min离心8min，收集菌体。用适量的pH＝7.0McIlvaine buffer悬浮菌体后，于低温水浴下超声波破碎菌体。以上胞内浓缩的粗酶液经12000rpm/min离心l0 min后，吸取上清并用Nickel-NTAAgarose和0-500mM的咪唑分别亲和和纯化目的蛋白。两个纯化所得的蛋白SDS-PAGE结果如图1所示，其中M为蛋白质Marker，W为野生酶，D41G为突变体。结果表明，重组野生酶JB13GH39P28和突变体D41G得到了表达和纯化，产物为单一条带。
4)把上述纯化得到的蛋白样品体积量100倍的透析液(pH 7.0McIlvaine buffer)加入透析装置。将透析袋(mw:14000)剪成适当长度(10-20cm)的小段，在沸水中煮沸30min后，用蒸馏水彻底清洗透析袋，将3)中得到的纯化的重组野生酶JB13GH39P28和突变体D41G分别装入透析袋，透析袋两端预留3-5cm的长度用透析夹夹住。将透析样品放在透析缓冲液中，置于4℃透析，每隔2小时更换透析液，更换3次。
实验例4重组野生β-木糖苷酶JB13GH39P28及突变体D41G的性质测定
酶活性测定方法采用PNP法：以对硝基苯基-β-D-吡喃木糖苷(pNPX)为底物测定重组野生酶JB13GH39P28及突变体D41G的活性。将pNPX溶于缓冲液中，使其终浓度为2mM；反应体系含50μL酶液，450μL的含底物的缓冲液；底物在反应温度下预热5min后，加入酶液后再反应10min，然后加2mL 1M Na2CO3终止反应，冷却至室温后在405nm波长下测定释放出的pNP的量；1个酶活单位(U)定义为每分钟分解底物产生1μmol pNP所需的酶量。
酶比活力的测定方法：酶活(A)以及酶比活力(B)的计算公式如下：
A(U/mL)＝c×N/(t×V)
B(U/mg)＝A/C
式中：c为由对硝基苯酚标准方程计算出的酶反应后的对硝基苯酚的量(μmol)；N为酶液稀释倍数；t为酶与底物反应时间(min)；V为参与反应的酶液体积(mL)；C为蛋白质质量浓度(mg/mL，使用雅酶BCA蛋白定量试剂盒测蛋白质质量浓度)。
1)重组野生酶JB13GH39P28及突变体D41G在不同pH中的活性测定
将实验例3中纯化的酶置于pH＝3.0-9.0缓冲液中(pH＝3.0、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、7.0、8.0：McIlvaine buffer；pH＝9.0：1mol/L Glycine-NaOH Buffer)，于37℃的条件下进行酶促反应，测定重组野生酶JB13GH39P28及突变体D41G的酶活。
重组野生酶JB13GH39P28和突变体D41G在不同pH中活性测定结果如图2所示，结果表明，与重组野生酶JB13GH39P28相比，重组突变体D41G的最适pH值向碱性区域偏移0.5个单位。重组野生酶JB13GH39P28最适pH为4.5，其在pH为3.0、4.0、5.0、5.5、6.0、7.0分别具有21.14％、91.02％、89.93％、66.01％、47.99％、10.01％的酶活；重组突变体D41G的最适pH为5.0，其在pH为3.0、4.0、4.5、5.5、6.0、7.0、8.0和9.0时分别具有6.20％、47.70％、74.96％、92.98％、76.93％、61.22％、48.14％和15.86％的酶活。突变体D41G在pH为7.0的酶活显著提高，比野生酶JB13GH39P28高约51％，pH为8.0时，野生酶JB13GH39P28无活性，而突变体D41G还有48.14％的酶活。
2)重组野生酶JB13GH39P28及突变体D41G在不同pH中的稳定性测定
将实验例3中纯化的酶置于pH＝3.0-10.0缓冲液中(pH＝3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0：McIlvaine buffer，pH＝9.0、10.0：1mol/L Glycine-NaOH Buffer)，在37℃下处理60min。按照酶活力测定方法，分别在对应的最适pH(pH 4.5或pH 5.0)及37℃条件下进行酶促反应，以pNPX为底物，反应10min，测定重组野生酶JB13GH39P28及突变体D41G的酶活。
重组野生酶JB13GH39P28和突变体D41G在不同pH中稳定性测定结果如图3所示，结果表明，重组野生酶JB13GH39P28和突变体D41G能在较大的pH范围内保持较高的酶活，在pH＝5.0-9.0下处理60min，野生酶JB13GH39P28和突变体D41G均能保持80％以上的酶活。
3)重组野生酶JB13GH39P28及突变体D41G的热活性测定
分别在pH＝4.5或pH＝5.0的缓冲液中，分别于0、10、20、30、40、50、60、70℃下进行酶促反应。以pNPX为底物，反应10min，测定重组野生酶JB13GH39P28及突变体D41G的酶活。
重组野生酶JB13GH39P28和突变体D41G的热活性测定结果如图4所示，结果表明，与重组野生酶JB13GH39P28相比，突变体D41G最适温度下降到30℃，且突变体D41G在0℃下仍有26.03％的酶活。野生酶JB13GH39P28的最适温度为50℃，在10℃、20℃、30℃、40℃和60℃时分别具有10.67％、23.94％、43.61％、69.58％和77.97％的酶活；突变体D41G的最适温度为30℃，在0℃、10℃、20℃、40℃、50℃和60℃时分别具有26.03％、44.66％、79.56％、56.86％、10.31％、4.02％的酶活。
4)重组野生酶JB13GH39P28及突变体D41G的热稳定性测定
将同样酶量的两个酶液置于50℃处理60min，分别在最适pH(pH＝4.5与pH＝5.0)及37℃条件下进行酶促反应，以未处理的酶液作为对照。以pNPX为底物，反应l0min，每隔10min测定重组野生酶JB13GH39P28和突变体D41G的酶活。
重组野生酶JB13GH39P28和突变体D41G在50℃的热稳定性测定结果如图5所示，结果表明，50℃处理60min后，纯化的重组野生酶JB13GH39P28仍有83.17％的酶活，而突变体D41G的酶活则下降至32.89％。
5)重组野生酶JB13GH39P28及突变体D41G在NaCl中的活性测定
在酶促反应体系中加入3.0～30.0％(3.0、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0、30.0)(w/v)的NaCl，分别在pH＝4.5或pH＝5.0及37℃下进行酶促反应。以pNPX为底物，反应10min，测定纯化的重组野生酶JB13GH39P28和突变体D41G的酶学性质。
重组野生酶JB13GH39P28和突变体D41G在NaCl中的活性测定结果如图6所示，结果表明，在反应体系中加入3.0～30.0％(w/v)NaCl，重组野生酶JB13GH39P28的酶活变化不大，而突变体D41G的酶活显著提高。反应体系中不含NaCl时，野生酶JB13GH39P28和突变体D41G的比活分别为11.89U/mg和1.51U/mg，反应体系中加入3.0～30.0％(w/v)NaCl后，野生酶JB13GH39P28酶活提高且在15.0％(w/v)NaCl中有最大比活14.70U/mg，随着反应体系中NaCl的加入，突变体D41G的活性被激活，加入3％(w/v)NaCl后比活从1.51U/mg提高到14.05U/mg，而后在5.0～25.0％(w/v)NaCl中突变体D41G的酶活几乎不变且在15％(w/v)NaCl中具有最高比活力15.05U/mg。
6)重组野生酶JB13GH39P28及突变体D41G在NaCl中的稳定性测定将纯化的酶液置于3.0～30.0％(3.0、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0、30.0)(w/v)的NaCl水溶液中，在37℃下处理60min，然后分别在pH＝4.5或pH＝5.0及37℃下进行酶促反应，以未处理的酶液作为对照。以pNPX为底物，反应10min，测定纯化的重组野生酶JB13GH39P28和突变体D41G的酶活。
重组野生酶JB13GH39P28和突变体D41G在NaCl中的稳定性测定结果如图7所示，结果表明，经3.0～30.0％(w/v)NaCl处理60min后，NaCl对重组野生酶JB13GH39P28的酶活有一定的激活作用，且在3.0％(w/v)NaCl中有最大比活力14.07U/mg；在3.0～30.0％(w/v)NaCl中处理60min后，突变体D41G的比活力明显提高且高于野生酶JB13GH39P28，在不加入NaCl的条件下，野生酶JB13GH39P28的比活力为11.29U/mg，而突变体D41G的比活仅为1.51U/mg，在反应体系中加入3.0～30.0％(w/v)NaCl后，突变体D41G的比活提高且在15.0％(w/v)NaCl中有最大比活17.02U/mg。
7)重组野生酶JB13GH39P28及突变体D41G在NaBr中的活性测定
在酶促反应体系中加入3.0～30.0％(w/v)NaBr，于pH＝4.5或pH＝5.0及37℃下进行酶促反应。以pNPX为底物，反应10min，测定纯化的重组野生酶JB13GH39P28和突变体D41G的酶学性质。
重组野生酶JB13GH39P28和突变体D41G在NaBr中的活性测定结果如图8所示，结果表明，在反应体系中加入3.0～30.0％(w/v)NaBr，野生酶JB13GH39P28的酶活受到抑制，而突变体D41G的酶活受到激活。在3.0％(w/v)NaBr中野生酶JB13GH39P28比活力下降至2.12U/mg，随着盐浓度的增加，酶活有所提高并在30.0％(w/v)NaBr中提高到3.61U/mg；突变体D41G在反应体系中添加3.0～30.0％(w/v)的NaBr后，比活力从1.51U/mg提高到3.31U/mg。
8)重组野生酶JB13GH39P28及突变体D41G在NaBr中的稳定性测定
将纯化的酶液置于3.0～30.0％(w/v)的NaBr水溶液中，在37℃下处理60min，然后在pH＝4.5或pH＝5.0及37℃下进行酶促反应，以未处理的酶液作为对照。以pNPX为底物，反应10min，测定纯化的重组野生酶JB13GH39P28和突变体D41G的酶学性质。
重组野生酶JB13GH39P28和突变体D41G在NaBr中的稳定性测定结果如图9所示，结果表明，经3.0～30.0％(w/v)的NaBr处理60min后，野生酶JB13GH39P28的酶比活下降到7.44U/mg，而突变体D41G的酶活经3.0～30.0％(w/v)NaBr处理60min后酶比活提高，且在5.0％(w/v)NaBr处理60min后有最高酶比活6.97U/mg。
9)重组野生酶JB13GH39P28和突变体D41G转化三七皂苷R1的产物分析
酶解反应体系共250μL，具体如下表1所示，其中，D41G(+)为在酶解反应体系中添加了NaCl的反应体系：
表1酶解反应体系
在37℃和pH＝7.0下，酶促反应10min、30min后加250μL饱和正丁醇(正丁醇：水＝4:1)终止反应。反应产物分析采用薄层层析法(使用青岛海洋化工有限公司的高效薄层层析硅胶板G型)。
其中，薄层层析步骤如下：
配制展开剂(正丁醇：乙酸乙酯：水＝4：4：1，混匀)，取适量倒入展开槽，静置30min左右；将硅胶板放在110℃电热板上活化30min，冷却后划线，点样(每次0.5μL，吹干，共点3次)；将点样的一端硅胶板朝下放入展开槽中，点样点不要没入展开剂；待展开剂到距硅胶板上沿1.5cm时，取出硅胶板，吹干后将硅胶板直接浸入适量显色剂(无水乙醇：浓硫酸＝9：1，混匀)；几秒钟后，立即取出硅胶板并放置于110℃电热板上直到斑点显色。
重组野生酶JB13GH39P28和突变体D41G转化三七皂苷R1的产物的薄层层析结果如图10所示，其中，R1、Rg1分别为三七皂苷R1和人参皂苷Rg1的标准品；W10、W30分别为野生酶JB13GH39P28转化三七皂苷R1酶解体系反应10min和30min的产物分析；G10、G30分别为突变酶D41G转化三七皂苷R1酶解体系反应10min和30min的产物分析；G10(+)、G30(+)分别为突变酶D41G转化三七皂苷R1酶解体系中添加终浓度为15％(w/v)的NaCl溶液后反应10min和30min的产物分析。结果表明，纯化的重组野生酶JB13GH39P28和突变体D41G能将三七皂苷R1转化为人参皂苷Rg1，在突变体D41G转化三七皂苷R1的体系中添加终浓度为15％(w/v)的NaCl溶液，可明显提高转化三七皂苷R1的速率。酶解反应体系反应10min后，野生酶JB13GH39P28和含NaCl的突变体D41G酶解体系中部分三七皂苷R1转化为人参皂苷Rg1，而不含NaCl的突变体D41G酶解体系中还没有产生人参皂苷Rg1；反应30min后，含NaCl的突变体D41G酶解体系将三七皂苷R1完全转化为人参皂苷Rg1。
综上可知，本发明提供的嗜盐适冷及pH适应性改良的β-木糖苷酶突变体D41G，其最适pH为5.0，最适温度为30℃，其活性可以被NaCl和NaBr激活，在转化三七皂苷R1的酶解体系中添加NaCl能提高转化速率。在正常反应体系中，该突变体比野生酶的酶比活低很多，而在加入NaCl后，突变体的酶比活迅速提升，且处理60min后，突变体的酶比活均高于野生酶，这种特性使得在实际应用中，可以通过调整添加的盐的浓度来控制这个酶的反应速率，有利于实时调控酶促反应。该突变体D41G在0℃有26.03％的酶活，相比野生酶JB13GH39P28更适冷。与重组野生β-木糖苷酶JB13GH39P28相比，该突变体在50℃的热稳定性显著降低，有利于酶的安全使用，可应用于低温含盐环境要求下的生物技术领域，尤其可应用于食品、酿造、洗涤、造纸、污水处理等行业。
尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。
Claims (7)
1.一种嗜盐适冷及pH适应性改良的β-木糖苷酶突变体D41G，其特征在于，该突变体D41G的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，该突变体D41G在0℃有26.03％的酶活，在转化三七皂苷R1的酶解体系中添加NaCl可提高转化速率。
2.如权利要求1所述嗜盐适冷及pH适应性改良的β-木糖苷酶突变体D41G的编码基因，其特征在于，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.包含如权利要求2所述编码基因的重组质粒。
4.根据权利要求3所述的重组质粒，其特征在于，所述的质粒选自pET-28a(+)。
5.包含如权利要求2所述编码基因的重组菌。
6.根据权利要求5所述的重组菌，其特征在于，所述的菌选自BL21(DE3)。
7.如权利要求1所述嗜盐适冷及pH适应性改良的β-木糖苷酶突变体D41G在食品、酿造、洗涤、造纸或污水处理中的应用。
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