CN116555229A - N-乙酰氨基葡萄糖苷酶突变体、重组表达载体及菌和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了N‑乙酰氨基葡萄糖苷酶突变体、重组表达载体及菌和应用，属于基因工程技术领域，所述的N‑乙酰氨基葡萄糖苷酶突变体MutNΔ4的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。通过上述方式，本发明提供了一种催化效率提高的N‑乙酰氨基葡萄糖苷酶突变体，该突变体命名为MutNΔ4；本发明利用基因工程技术，删除野生酶JB10NagA‑opt的N端氨基酸序列“ELAL”，获得了突变体MutNΔ4，其最适温度为50℃，最适pH为7.0，其催化效率为874.6s‑1mM‑1，相比野生N‑乙酰氨基葡萄糖苷酶(野生酶JB10NagA‑opt)催化效率提高了4倍，为其在医学或功能性食品生产提供了有效保障。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及N-乙酰氨基葡萄糖苷酶突变体、重组表达载体及菌和应用。
背景技术
氨基葡萄糖苷及其衍生物食用安全性已得到广泛认可，主要用于预防和治疗骨关节炎等慢性炎症，也是生产唾液酸的前体(Ma et al.Appl Microbiol Biot，2019，103(19):7883–7889)。
N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(GlcNAcases，N-acetyl-glucosaminidases，EC3.2.1.52)可协同几丁质酶降解富含几丁质的环境废弃物(如虾壳或真菌菌丝体等)，从几丁寡糖非还原末端逐个切割生产功能性乙酰氨基葡萄糖苷。β-乙酰氨基葡萄糖苷酶是完全降解几丁质生产氨基葡萄糖苷及其衍生物的关键酶制剂之一。已报导N-乙酰氨基葡萄糖苷酶的数量很多，主要归属于GH3、GH20和GH84家族。GH20家族β-乙酰氨基葡萄糖苷酶对几丁寡糖的催化活性普遍高于其他家族酶，是所有家族中最具产业化应用潜力一类酶(Zhanget al.Appl Microbiol Biot，2018，102(1):93–103)，但仍普遍存在酶活力偏低，亟需提高催化效率。
基于此，本发明设计了N-乙酰氨基葡萄糖苷酶突变体、重组表达载体及菌和应用以解决上述问题。
发明内容
针对现有技术所存在的上述缺点，本发明提供了N-乙酰氨基葡萄糖苷酶突变体、重组表达载体及菌和应用。
为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：
N-乙酰氨基葡萄糖苷酶突变体，所述的N-乙酰氨基葡萄糖苷酶突变体MutNΔ4的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
更进一步的，N-乙酰氨基葡萄糖苷酶突变体MutNΔ4的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还公开了一种重组表达载体，包括所述的N-乙酰氨基葡萄糖苷酶突变体MutNΔ4的编码基因。
更进一步的，所述的重组表达载体选自pET-22b(+)。
本发明还公开了一种重组表达菌，包括所述的N-乙酰氨基葡萄糖苷酶突变体MutNΔ4的编码基因。
更进一步的，所述的重组表达菌选自BL21(DE3)。
本发明还公开了一种所述的N-乙酰氨基葡萄糖苷酶突变体在医学或功能性食品领域中的应用。
本发明还公开了一种所述的重组表达载体在医学或功能性食品领域中的应用。
本发明还公开了一种所述的重组表达菌在医学或功能性食品领域中的应用。
有益效果
本发明利用基因工程技术，删除野生酶JB10NagA-opt的N端氨基酸序列“ELAL”，获得了突变体MutNΔ4，该突变体催化效率为874.6s-1mM-1，相比野生N-乙酰氨基葡萄糖苷酶催化效率提高了4倍，为其在医学或功能性食品生产提供了有效保障。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为野生酶JB10NagA-opt和突变体MutNΔ4的SDS-PAGE分析结果；
图2为野生酶JB10NagA-opt和突变体MutNΔ4的pH活性测定结果；
图3为野生酶JB10NagA-opt和突变体MutNΔ4的热活性测定结果；
图4为野生酶JB10NagA-opt和突变体MutNΔ4的动力学参数测定结果。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
重组表达的酶或多或少都会在N末端和C末端携带表达载体的部分序列；这部分序列的差异与载体和酶基因插入载体中酶切位点有关；如前所述，酶结构中N末端和C末端通常是热因子最高的区域；许多研究表明，改变酶的N末端和C末端氨基酸残基会影响其功能和稳定性；
说明：本发明实施例中提到的重组N-乙酰氨基葡萄糖苷酶是野生型N-乙酰氨基葡萄糖苷酶JB10NagA(GenBank登录号为AQM74372)插入pEasy-E2表达载体的重组区域的表达产物，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；
本发明以下实施例中的部分实验材料和试剂：
1、菌株及载体：大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)和表达载体pET-22b(+)购于Novagen公司；
2、酶类及其它生化试剂：Nickel-NTA Agarose购自QIAGEN公司，DNA聚合酶、dNTP及II试剂盒购自南京诺唯赞公司，对硝基苯酚-β-N-乙酰氨基葡萄糖苷(pNPGlcNAc)购自上海源叶公司，其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)；
3、培养基
LB培养基：蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，加蒸馏水至1000mL，pH自然(约为7)；固体培养基在此基础上加2.0％(w/v)琼脂；
说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。
下面结合实施例对本发明作进一步的描述。
实施例1突变体MutNΔ4表达载体的构建和转化
N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因jb10nagA的核苷酸序列，其GenBank登录号为KX014621，GC含量高达69％且有较多的发卡结构，进行密码子优化，同时在其起始密码子之后引入编码序列7，其核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示，在其终止密码子之前引入编码序列8，其核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示；
因本实施例中所用的N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因jb10nagA是构建在载体pET-22b(+)中的NdeI和XhoI酶切位点之间，引入的编码序列7和8分别对应为氨基酸片段‘ELAL和KGQF’的核苷酸片段，以消除原载体pEasy-E2更换为本实施例中现用载体pET-22b(+)对重组N-乙酰氨基葡萄糖苷酶表达序列的改变；优化后得到核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的N-乙酰氨基葡萄糖苷酶优化基因jb10nagA-opt，该优化基因jb10nagA-opt由苏州泓迅生物科技股份有限公司合成，并构建了包含该优化基因jb10nagA-opt的重组表达质粒pET22b-jb10nagA-opt，并将该重组表达质粒pET22b-jb10nagA-opt转入了BL21(DE3)中，获得包含该优化基因的重组表达菌；该优化基因所表达的蛋白即为优化后的野生酶JB10NagA-opt，与在pEasy-E2载体中重组N-乙酰氨基葡萄糖苷酶氨基酸JB10NagA序列相同，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；
引入的编码序列如下所示(5’→3’)：
编码序列7(SEQ ID NO.7)：GAATTGGCACTT；
编码序列8(SEQ ID NO.8)：AAGGGACAATTC；
SEQ ID NO.3：
SEQ ID NO.4：
1)根据核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的野生酶优化基因jb10nagA-opt的序列和质粒pET-22b-jb10nagA-opt，使用CE Design软件设计重组引物F和R，具体序列如下：
其中，重组引物序列如下所示(5’→3’)：
F(SEQ ID NO.5)：
TACATATGCCGGCCTTAGAAACCATGTTTGTTC；
R(SEQ ID NO.6)：
CTAAGGCCGGCATATGTATATCTCCTTCTTAAAGTTAAACAAA；
以质粒pET-22b-jb10nagA-opt为模板进行PCR扩增，获得线性化pET-22b-mutNΔ4的PCR产物；其中，该PCR扩增的反应程序为：95℃变性30sec；然后95℃变性15sec，64℃退火15sec，72℃延伸3min 30sec，共30个循环；72℃保温5min；
2)在50μL线性化pET-22b-mutNΔ4的PCR产物中，加入1μLDpnI，于37℃消化1h；
3)根据II试剂盒的说明书，在步骤2)中的消化产物加入2μL ExnasⅡ，于37℃下重组连接30min，即可获得含有突变体MutNΔ4编码基因的重组表达载体pET-22b-mutNΔ4，通过测序进一步确认可知，突变体MutNΔ4编码基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示，同时可知，突变体MutNΔ4的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
SEQ ID NO.1：
/>
SEQ ID NO.2：
/>
可知，突变体MutNΔ4的氨基酸序列与优化后的野生酶JB10NagA-opt(SEQ IDNO.3)氨基酸序列相比，MutNΔ4不含有位于重组N-乙酰氨基葡萄糖苷酶JB10NagA-optN端氨基酸序列“ELAL”；
4)将步骤3)中的重组表达载体通过热激方式转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，获得包含表达载体pET-22b-mutNΔ4的重组表达菌。
实验例2野生酶JB10NagA-opt和突变体MutNΔ4的制备
将含野生酶JB10NagA-opt和突变体MutNΔ4编码基因的重组表达菌株分别以0.1％的接种量，接种于LB(含100μgmL-1氨苄青霉素)培养液中，于37℃快速振荡16h，对菌株进行活化；
将上述活化的菌液以1％接种量分别接种到新鲜的LB(含100μg mL-1氨苄青霉素)培养液中，快速振荡培养约2-3h(OD600达到0.6-1.0)后，加入终浓度0.7mM的IPTG进行诱导，于20℃继续振荡培养约20h；12000rpm离心5min，收集菌体；用适量的pH＝6.0McIlvainebuffer悬浮菌体后，于低温水浴下超声波破碎菌体；以上胞内浓缩的粗酶液经13000rpm离心10min后，吸取上清并用Nickel-NTAAgarose和0-500mM的咪唑分别亲和和纯化目的蛋白；SDS-PAGE分析结果如图1所示，其中，M为蛋白质Marker；JB10NagA-opt为纯化的野生酶JB10NagA-opt；MutNΔ4为纯化的突变体MutNΔ4；
由图1可以看出，野生酶JB10NagA-opt和突变体MutNΔ4都获得了纯化，产物为单一条带。
实验例3野生酶JB10NagA-opt和突变体MutNΔ4的性质测定
1)纯化的野生酶JB10NagA-opt和突变体MutNΔ4的活性分析
活性测定方法采用对硝基苯酚(pNP)法：将底物pNPGlcNAc溶于缓冲液中，使其终浓度为2mM；反应体系含50μL的酶液(该酶液的浓度为0.1mg/mL)，450μL底物；底物在反应温度下预热5min，随后加入酶液反应10min，然后加2mL的1MNa2CO3终止反应，冷却至室温后在405nm波长下测定OD值；1个酶活单位(U)定义为在给定的条件下每分钟分解底物产生1μmolpNP所需的酶量；
2)纯化的野生酶JB10NagA-opt和突变体MutNΔ4的最适pH测定
采取两步法测定野生酶和突变体的最适pH，第一次在每间隔1个pH单位点进行活性测定，第二次在活性最高的pH单位点左和右0.5个pH单位所在的点进行测定，可以在测定的样本量基本不变的情况下，精确和验证测定结果；在37℃下，缓冲液为0.1M McIlvainebuffer(pH＝5.0-8.0)和0.1M glycine–NaOH(pH＝9.0)；以pNPGlcNAc为底物，反应10min，测定纯化的N-乙酰氨基葡萄糖苷酶的酶学性质；首先将酶液置pH＝5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的缓冲液中进行上述条件酶促反应；得出野生酶JB10NagA-opt和突变体MutNΔ4的分别pH6.0和7.0的酶活性最高；再测定野生酶和突变体分别在pH＝5.5、6.0、6.5和6.5、7.0、7.5的缓冲液中在进行酶活测定；野生酶JB10NagA-opt和突变体MutNΔ4的pH活性测定结果如图2所示；
由图2可以看出，野生酶JB10NagA-opt的最适pH为6.0，突变体MutNΔ4的最适pH为7.0，在pH 6.0可以保持80％以上酶活力；
3)纯化的野生酶JB10NagA-opt和突变体MutNΔ4的热活性测定
采取两步法测定野生酶和突变体的最适温度，第一次在每间隔10℃的温度点进行活性测定，第二次在活性最高的温度点左和右5℃所在的温度点进行测定，可以在测定的样本量基本不变的情况下，精确和验证测定结果；在pH＝6.0的缓冲液中，先于0-60℃下进行酶促反应，从0℃开始每隔10℃测一次酶活，得出野生酶JB10NagA-opt和突变体MutNΔ4在50℃时的酶活性最高；再在pH＝6.0的缓冲液中，测定野生酶和突变体在45℃、50℃和55℃时进行酶活测定；野生酶JB10NagA-opt和突变体MutNΔ4的热活性测定结果如图3所示；
由图3可以看出，野生酶JB10NagA-opt和突变体MutNΔ4的最适温度均为50℃；
4)野生酶JB10NagA-opt和突变体MutNΔ4的动力学参数测定
在30℃和pH＝6.0条件下，以pNPGlcNAc为底物测定野生酶和突变体的动力学参数，底物浓度在0.1mM～2mM之间，反应时间6min；野生酶JB10NagA-opt和突变体MutNΔ4的动力学参数测定结果如图4所示；根据反应测定结果，计算每毫克酶的酶活力单位，根据非线性拟合的方法计算动力学参数；
结果如表1所示，突变体MutNΔ4与野生酶相比Km降低，Kcat升高，催化效率提高了约4倍；
表1野生酶JB10NagA-opt和MutNΔ4的动力学参数
综上可知，本发明提供了一种催化效率提高的N-乙酰氨基葡萄糖苷酶突变体，该突变体命名为MutNΔ4；本发明利用基因工程技术，删除野生酶JB10NagA-opt的N端氨基酸序列“ELAL”，获得了突变体MutNΔ4，其最适温度为50℃，最适pH为7.0，其催化效率为874.6s-1mM-1，相比野生N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(野生酶JB10NagA-opt)催化效率提高了4倍，为其在医学或功能性食品生产提供了有效保障。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不会使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (9)
1.N-乙酰氨基葡萄糖苷酶突变体，其特征在于，所述的N-乙酰氨基葡萄糖苷酶突变体MutNΔ4的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的N-乙酰氨基葡萄糖苷酶突变体，其特征在于，N-乙酰氨基葡萄糖苷酶突变体MutNΔ4的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.一种重组表达载体，包括权利要求2所述的N-乙酰氨基葡萄糖苷酶突变体MutNΔ4的编码基因。
4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，所述的重组表达载体选自pET-22b(+)。
5.一种重组表达菌，包括权利要求2所述的N-乙酰氨基葡萄糖苷酶突变体MutNΔ4的编码基因。
6.根据权利要求5所述的重组表达菌，其特征在于，所述的重组表达菌选自BL21(DE3)。
7.一种如权利要求1或2所述的N-乙酰氨基葡萄糖苷酶突变体在医学或功能性食品领域中的应用。
8.一种如权利要求3或4所述的重组表达载体在医学或功能性食品领域中的应用。
9.一种如权利要求5或6所述的重组表达菌在医学或功能性食品领域中的应用。
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