CN113604456B - 一种耐碱κ-卡拉胶酶及其应用 - Google Patents
一种耐碱κ-卡拉胶酶及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113604456B CN113604456B CN202110962229.3A CN202110962229A CN113604456B CN 113604456 B CN113604456 B CN 113604456B CN 202110962229 A CN202110962229 A CN 202110962229A CN 113604456 B CN113604456 B CN 113604456B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- enzyme
- kappa
- carrageenan
- mutant
- alkali
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 title claims abstract description 84
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 title claims abstract description 83
- ZNOZWUKQPJXOIG-XSBHQQIPSA-L [(2r,3s,4r,5r,6s)-6-[[(1r,3s,4r,5r,8s)-3,4-dihydroxy-2,6-dioxabicyclo[3.2.1]octan-8-yl]oxy]-4-[[(1r,3r,4r,5r,8s)-8-[(2s,3r,4r,5r,6r)-3,4-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)-5-sulfonatooxyoxan-2-yl]oxy-4-hydroxy-2,6-dioxabicyclo[3.2.1]octan-3-yl]oxy]-5-hydroxy-2-( Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](OS([O-])(=O)=O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H]2OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](CO)O[C@@H](O[C@@H]3[C@@H]4OC[C@H]3O[C@H](O)[C@@H]4O)[C@@H]1O)OS([O-])(=O)=O)[C@@H]2O ZNOZWUKQPJXOIG-XSBHQQIPSA-L 0.000 title claims abstract description 48
- 239000003513 alkali Substances 0.000 title claims abstract description 23
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 10
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 7
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 13
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 abstract description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 15
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 13
- 229920001525 carrageenan Polymers 0.000 description 11
- 235000010418 carrageenan Nutrition 0.000 description 11
- 229940113118 carrageenan Drugs 0.000 description 9
- 239000000679 carrageenan Substances 0.000 description 9
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 8
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 6
- UHVMMEOXYDMDKI-JKYCWFKZSA-L zinc;1-(5-cyanopyridin-2-yl)-3-[(1s,2s)-2-(6-fluoro-2-hydroxy-3-propanoylphenyl)cyclopropyl]urea;diacetate Chemical compound [Zn+2].CC([O-])=O.CC([O-])=O.CCC(=O)C1=CC=C(F)C([C@H]2[C@H](C2)NC(=O)NC=2N=CC(=CC=2)C#N)=C1O UHVMMEOXYDMDKI-JKYCWFKZSA-L 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 101710184220 Kappa-carrageenase Proteins 0.000 description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- -1 Carrageenan oligosaccharides Chemical class 0.000 description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 3
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 3
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 3
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 3
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 3
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 3
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 3
- 238000000034 method Methods 0.000 description 3
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 2
- 239000007986 glycine-NaOH buffer Substances 0.000 description 2
- 239000002440 industrial waste Substances 0.000 description 2
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M sodium hydroxide Inorganic materials [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000206572 Rhodophyta Species 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000003796 beauty Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000007363 ring formation reaction Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000004753 textile Substances 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2468—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1) acting on beta-galactose-glycoside bonds, e.g. carrageenases (3.2.1.83; 3.2.1.157); beta-agarase (3.2.1.81)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
- C12Y302/01083—Kappa-carrageenase (3.2.1.83)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
本发明提供了一种耐碱κ‑卡拉胶酶及其应用，该耐碱κ‑卡拉胶酶是由如SEQ ID NO.1所示序列编码的野生型κ‑卡拉胶酶经过其第237位氨基酸突变而产生的突变体。与野生型κ‑卡拉胶酶相比，该突变体的耐碱性得到了一定的提高，野生型酶在pH为11.0下处理30min后仅保留19.9％的相对酶活力，而突变酶E237R保留了36.0％的相对酶活力，从而使该突变κ‑卡拉胶酶在碱性条件下水解κ‑卡拉胶的工业生产中具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种耐碱κ-卡拉胶酶及其应用。
背景技术
卡拉胶是由α-1,3-D-半乳糖和β-1,4-D-半乳糖作为基本骨架，交替连接而成的线性硫酸多糖。卡拉胶寡糖是卡拉胶的降解产物，与多糖相比，分子量更低，溶解度更高，更易被人体吸收，对它们的研究逐渐成为食品、医药等领域的研究热点。而使用卡拉胶酶降解卡拉胶具有反应条件温和、底物特异性高的特点，被认为是制备卡拉胶寡糖的一种有前景的方法。与此同时，卡拉胶酶还被发现可用于其他领域，例如纺织工业、洗涤剂的成分、生物乙醇生产中的糖化剂、预防红藻爆发和藻类生物量的再利用。
在工业生产中，酶往往应用在极端的环境，需要酶具有优良的热稳定性、耐酸碱、耐盐等特性。目前已报道的κ-卡拉胶酶的耐碱性较差，如何对κ-卡拉胶酶进行合理的改良，优化酶的耐碱性，使κ-卡拉胶酶在碱性条件下水解κ-卡拉胶的工业生产中具有良好的应用前景有待研究。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决上述技术中的技术问题之一。为此，本发明提出了一种耐碱κ-卡拉胶酶，其耐碱性得到一定的提高，在卡拉胶工业废渣的处理中有良好的应用潜力。
为此，在本发明的第一个方面中，提供了一种耐碱κ-卡拉胶酶，其由如SEQ IDNO.1所示序列编码的野生型κ-卡拉胶酶经过其第237位氨基酸突变而产生的突变体。
根据本发明的实施例的耐碱κ-卡拉胶酶，其将野生型κ-卡拉胶酶的第237位氨基酸进行突变。与野生型κ-卡拉胶酶相比，突变体的耐碱性得到了一定的提高，野生型酶在pH为11.0下处理30min后仅保留19.9％的相对酶活力，而突变酶E237R保留了36.0％的相对酶活力，从而使该突变κ-卡拉胶酶具有在卡拉胶工业废渣处理的应用前景。
可选地，所述野生型κ-卡拉胶酶的第237位氨基酸由Glu变为Arg。
可选地，所述突变方式为定点突变。
在本发明的第二方面中，提供了一种编码上述耐碱κ-卡拉胶酶的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
在本发明的第三个方面中，提供了一种构建体，其包含编码上述耐碱κ-卡拉胶酶的基因。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
图1为野生型和突变型κ-卡拉胶酶的SDS-PAGE分析；
图2为野生型和突变型κ-卡拉胶酶在碱性条件下的pH稳定性；
图3为野生型和突变型κ-卡拉胶酶在碱性条件下降解κ-卡拉胶的能力。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
下文的公开提供了许多不同的实施例或例子用来实现本发明的不同实施方式。为了简化本发明的公开，下文中对特定实施例或示例进行描述。当然，他们仅仅为示例，并且目的不在于限制本发明。此外，本发明提供的各种特定工艺和材料的例子，本领域普通技术人员可以意识到其他工艺的可应用性和/或其他材料的使用。除非另有说明，本发明的实施将采用本领域技术人员的能力范围之内的化学、分子生物学等领域的传统技术。另外，除非另有说明，在本文中，核酸以5′至3′的方向从左向右书写，氨基酸序列则以氨基端到羧基端的方向从左向右书写。
下面通过说明性的具体实施例对本发明进行描述，这些实施例并不以任何方式限制本发明的范围。特别说明的是：本发明所用到的试剂除特别说明外均有市售。
实施例1构建耐碱κ-卡拉胶酶突变体
突变酶重组表达载体的构建：
以携带野生型κ-卡拉胶酶编码基因(SEQ ID NO.1)的载体为模板进行定点突变，构建突变酶重组表达载体，引物按照突变试剂盒Mut ExpressⅡFast Mutagenesis Kit V2引物设计要求设计定点突变引物，突变引物如表1所示。
表1突变引物表
定点突变参照突变试剂盒Mut ExpressⅡFast Mutagenesis Kit V2的说明书进行操作。包括目标质粒扩增、扩增产物Dpn I消化、重组反应三个步骤；突变获得的突变酶E237R的编码基因如SEQ ID NO.2所示。
目标质粒扩增：
依次加入上述试剂后，混合均匀，然后进行PCR。PCR反应参数：95℃ 30s，95℃15s，62℃ 15s，72℃ 2min30 s，30次循环，72℃ 5min，4℃保存。
扩增产物DpnⅠ消化：
DpnⅠ 1μL
扩增产物 40～50μL
在PCR反应液中加入1uL Dpn I并混匀，37℃反应1h 30min。
重组环化反应：
使用移液枪轻轻吸打混匀，短暂离心将反应液收集至管底。置于37℃恒温反应30min后，降至4℃或立即置于冰上冷却。
重组产物转化表达宿主：
(1)在冰上解冻E.coli BL21感受态细胞。
(2)取10μL重组产物加入到100μL感受态细胞中，轻弹管壁混匀，冰上静置30min。
(3)42℃水浴热激45s后，立即置于冰上冷却2～3min。
(4)加入900μL LB液体培养基(不添加抗生素)，37℃摇菌1h(转速200rpm)。
(5)4℃，5000rpm离心5min，弃掉900μL上清。用剩余培养基将菌体重悬。
(6)菌体涂布于LB固体培养基平板(含50μg/mL卡那霉素)，37℃恒温箱中倒置培养12～16h。
耐碱突变酶阳性重组子的鉴定：
PCR体系：
依次加入上述试剂后，混合均匀，然后进行PCR。PCR反应参数：95℃ 3min，95℃15s，60℃ 15s，72℃ 45s，30次循环，72℃ 5min，4℃保存。使用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。PCR阳性的重组子进行DNA序列分析，确认突变酶的DNA序列。
κ-卡拉胶酶的诱导表达和纯化：
含有突变型或野生型κ-卡拉胶酶基因的基因工程菌菌液按照1％的接种量接种于50mL LB液体培养基(含50μg/mL卡那霉素)，37℃、180rpm培养12h，进行菌种的活化。将活化后的菌液按照1％的接种量转接到200mL LB液体培养基(含卡那霉素50μg/mL)中，37℃、180rpm培养至OD600达到0.6～0.8。加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.5mmol/L，16℃低温诱导表达18～24h。将诱导表达的菌液于5000rpm、4℃下离心15min，去上清，菌体用15mL预冷的缓冲液(50mmol/L NaH2PO4，300mmol/L NaCl，15mmol/L咪唑，pH8.0)重悬。在冰浴条件下，进行超声破碎，将破碎后的裂解液4℃、10000rpm离心20min，获得上清，即为粗酶液。参照GE Healthcare Life Sciences公司的金属镍螯合琼脂糖凝胶6FF使用说明书，利用亲和层析对重组蛋白进行分离纯化。采用SDS-PAGE分析纯化后目标蛋白的分子量及纯度。
利用亲和层析得到野生型酶和突变酶的单一蛋白条带，SDS-PAGE分析如图1所示。突变酶的分子质量与野生型酶一致，大小约为48.8kDa。
实施例2耐碱κ-卡拉胶酶的部分酶学性质测定
将10μL酶液(实施例1获得的)与490μL含有0.5％(w/v)浓度的κ-卡拉胶溶液(以50mmol/L的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液，pH 8.0配制)分别在不同温度下(40、45、50、55、60℃)反应15min后，加500μL的DNS试剂，沸水浴10min后冷却至室温，测定520nm处吸光值。酶活力最高时的温度为最适反应温度，并以此温度下的酶活力为100％。
分别用50mmol/L的NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液(pH 6.0、7.0、8.0)，Tris-HCl缓冲液(pH 8.0、9.0)和甘氨酸-NaOH缓冲液(pH 9.0、10.0、11.0)配制0.5％(w/v)浓度的κ-卡拉胶溶液。取490μL底物溶液，加入10μL酶液，在最适温度下反应15min后，加500μL的DNS试剂，沸水浴10min后冷却至室温，测定520nm处吸光值。酶活力最高时的pH为最适反应pH，并以此pH下的酶活力为100％。野生型和突变型κ-卡拉胶酶的最适反应温度和最适反应pH结果如表2所示。
表2κ-卡拉胶酶的最适反应温度和最适反应pH
将10μL酶液(实施例1获得，蛋白含量400ng)分别在90μL 50mmol/L的Gly-NaOH缓冲液(pH 8.0、9.0、10.0、11.0、12.0)下25℃处理30min后，立即置于冰上，加入400μL含有0.5％(w/v)浓度的卡拉胶底物溶液(pH 8.0)，测定酶的残余活力，研究酶在不同pH下的稳定性，以未经缓冲液处理的酶活力为100％。
将野生型和突变型酶分别在pH 8.0～12.0处理30min后，残余酶活力如图2所示。野生型酶在pH为11.0，处理30min后仅保留了19.9％的相对酶活力，而突变酶E237R保留了36.0％的相对酶活力。由此可见，与野生型酶相比，突变酶在碱性条件下的pH稳定性有一定的提高。耐碱性的κ-卡拉胶酶在碱性条件下水解κ-卡拉胶的工业生产中具有良好的应用前景。
实施例3κ-卡拉胶酶在碱性条件下降解κ-卡拉胶
用50mmol/L的甘氨酸-NaOH缓冲液(pH分别为8.0、9.0、10.0)制备0.5％(w/v)的κ-卡拉胶底物溶液。取490μL底物，加入10μL酶液(蛋白含量400ng)，在45℃下分别反应15、30、60、90、120min后，加500μL的DNS试剂，沸水浴10min冷却，测定520nm处吸光值。根据半乳糖标曲计算野生型及突变酶的还原糖生成量。
将野生型酶和突变酶分别与不同pH底物在45℃反应2h后，还原糖含量变化如图3所示。图A、B、C分别代表pH为8.0、9.0、10.0的κ-卡拉胶底物溶液。当卡拉胶底物溶液在pH为8.0时，野生型酶对κ-卡拉胶的降解率高于突变型；在pH为9.0时，突变酶水解κ-卡拉胶90min后，得到的还原糖含量为57μg/mL，明显高于野生型酶。在pH为10.0的情况下也是如此，表明突变酶在碱性环境下对κ-卡拉胶的降解能力高于野生型酶。
综上，根据本发明的实施例，采用定点突变技术将野生型酶进行定点突变，通过将其第237位氨基酸由Glu变为Arg，相较于野生型酶，该突变酶的耐碱性得到了一定的提高，在碱性条件下提高了对κ-卡拉胶的降解能力，这些优点使突变酶在碱性条件下水解κ-卡拉胶的工业生产中具有良好的应用前景。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不应理解为必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例进行接合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
SEQUENCE LISTING
<110> 集美大学
<120> 一种耐碱κ-卡拉胶酶及其应用
<130> 无
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1194
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atgaaaccta aaaatattgt gatattccct ctatcagcat taagtatgct tatattaaat 60
tcagcagctc aagcggctga tatacaacca cctattgcaa aaccaggcga aacatggatt 120
ttacaagcga agcgctcaga tgagtttgat ataaaagatg ctacaaagtg gaactttcaa 180
accgaaaact atggtgtatg gtcgtggaaa aatgaaaatg cgacagtatc aaacggaaaa 240
ctaaaattaa ccactaaaag agagtctcat aaacgtacat tttgggacgg ttgtaaccag 300
cagcaagtta caaattatcc actttattat acctcgggtg ttgctaaatc aagagctaca 360
ggtaactacg gttattacga agcaagaatt aagggagcga gcacatttcc tggtgtatct 420
cctgcgtttt ggatgtatag caccattgac cgttcattaa cgaaagaagg ggatgtccaa 480
tatagcgaaa tagacgtagt agaacttact caaaaaagtg ccgtgagaga gtctgatcat 540
gacttacata atattgtggt aaaaaatggc aaaccaacat ggatgcgccc aggctcgttt 600
cctcagacaa accataacgg ataccatcta cctttcgatc ctcgaaatga ctttcacacc 660
tatggtgtca atgtgactaa agacaaaatc acttggtacg tagatggtga aattgtgggc 720
gaaaaggata acttatactg gcatcgtcaa atgaatctca cattatcaca aggcctacgc 780
gcgccgcata cacaatggaa atgtaatcaa ttttacccat cagcgaataa atcagccgaa 840
ggcttcccaa catcaatgga agttgattat gtaagaacgt gggtaaaggt gggcaataac 900
aactctgatc caggcgaggg gcagtcatgt cctaacacct ttgtagctgt taatagtgtt 960
caactaagtg cagcaaaaca aacacttcga aagggccagt ctacaacgct agaaagcaca 1020
gttcttccaa actgtgcaac caacaagaaa gtcatttatt catcaagcaa taagaacgtg 1080
gcaactgtga acagtgctgg agttgtaaaa gcgaggagca aaggcacagc gactattacg 1140
gttaaaacta agaacaaagg gaaagtagat aaattaacca taacggttaa ttaa 1194
<210> 2
<211> 1194
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atgaaaccta aaaatattgt gatattccct ctatcagcat taagtatgct tatattaaat 60
tcagcagctc aagcggctga tatacaacca cctattgcaa aaccaggcga aacatggatt 120
ttacaagcga agcgctcaga tgagtttgat ataaaagatg ctacaaagtg gaactttcaa 180
accgaaaact atggtgtatg gtcgtggaaa aatgaaaatg cgacagtatc aaacggaaaa 240
ctaaaattaa ccactaaaag agagtctcat aaacgtacat tttgggacgg ttgtaaccag 300
cagcaagtta caaattatcc actttattat acctcgggtg ttgctaaatc aagagctaca 360
ggtaactacg gttattacga agcaagaatt aagggagcga gcacatttcc tggtgtatct 420
cctgcgtttt ggatgtatag caccattgac cgttcattaa cgaaagaagg ggatgtccaa 480
tatagcgaaa tagacgtagt agaacttact caaaaaagtg ccgtgagaga gtctgatcat 540
gacttacata atattgtggt aaaaaatggc aaaccaacat ggatgcgccc aggctcgttt 600
cctcagacaa accataacgg ataccatcta cctttcgatc ctcgaaatga ctttcacacc 660
tatggtgtca atgtgactaa agacaaaatc acttggtacg tagatggtcg tattgtgggc 720
gaaaaggata acttatactg gcatcgtcaa atgaatctca cattatcaca aggcctacgc 780
gcgccgcata cacaatggaa atgtaatcaa ttttacccat cagcgaataa atcagccgaa 840
ggcttcccaa catcaatgga agttgattat gtaagaacgt gggtaaaggt gggcaataac 900
aactctgatc caggcgaggg gcagtcatgt cctaacacct ttgtagctgt taatagtgtt 960
caactaagtg cagcaaaaca aacacttcga aagggccagt ctacaacgct agaaagcaca 1020
gttcttccaa actgtgcaac caacaagaaa gtcatttatt catcaagcaa taagaacgtg 1080
gcaactgtga acagtgctgg agttgtaaaa gcgaggagca aaggcacagc gactattacg 1140
gttaaaacta agaacaaagg gaaagtagat aaattaacca taacggttaa ttaa 1194
Claims (3)
1.一种耐碱κ-卡拉胶酶，其特征在于，由如SEQ ID NO.1所示序列编码的野生型κ-卡拉胶酶经过其第237位氨基酸由Glu突变为Arg而产生的突变体。
2.一种编码权利要求1所述的耐碱κ-卡拉胶酶的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.一种构建体，其特征在于，包含如权利要求2所述的基因。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110962229.3A CN113604456B (zh) | 2021-08-20 | 2021-08-20 | 一种耐碱κ-卡拉胶酶及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110962229.3A CN113604456B (zh) | 2021-08-20 | 2021-08-20 | 一种耐碱κ-卡拉胶酶及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN113604456A CN113604456A (zh) | 2021-11-05 |
| CN113604456B true CN113604456B (zh) | 2024-01-05 |
Family
ID=78309065
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202110962229.3A Active CN113604456B (zh) | 2021-08-20 | 2021-08-20 | 一种耐碱κ-卡拉胶酶及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN113604456B (zh) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115725548A (zh) * | 2022-10-26 | 2023-03-03 | 集美大学 | 一种κ-卡拉胶酶Pcar16突变体及其制备方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101784660A (zh) * | 2007-08-15 | 2010-07-21 | 丹尼斯科美国公司 | κ-卡拉胶酶和包含κ-卡拉胶酶的组合物 |
| CN109762799A (zh) * | 2018-12-26 | 2019-05-17 | 青岛大学 | 一种κ-卡拉胶酶及其应用 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7951561B2 (en) * | 2006-03-28 | 2011-05-31 | Council Of Scientific And Industrial Research | Method for the preparation of κ-carrageenase |
-
2021
- 2021-08-20 CN CN202110962229.3A patent/CN113604456B/zh active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101784660A (zh) * | 2007-08-15 | 2010-07-21 | 丹尼斯科美国公司 | κ-卡拉胶酶和包含κ-卡拉胶酶的组合物 |
| CN109762799A (zh) * | 2018-12-26 | 2019-05-17 | 青岛大学 | 一种κ-卡拉胶酶及其应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| kappa-carrageenase [Pseudoalteromonas tetraodonis];Kobayashi,T.等;GENBANK;1 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN113604456A (zh) | 2021-11-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN112646794B (zh) | 低温活性提高的外切菊粉酶突变体MutY119V | |
| CN112646793B (zh) | 低温适应性和盐适应性改良的菊粉酶突变体MutS120D及其应用 | |
| CN111647579B (zh) | 一种不耐热的外切菊粉酶突变体MutQ23Δ9及其制备和应用 | |
| CN112813051B (zh) | 热适应性改良的低温外切菊粉酶突变体MutP124G及应用 | |
| CN112852782B (zh) | 一种低温适应性改良的低温外切菊粉酶突变体MutDL121EK5及应用 | |
| CN116355881B (zh) | 酸耐受性提高的β-木糖苷酶突变体D395G及其应用 | |
| CN116410960B (zh) | 嗜盐适冷及pH适应性改良的β-木糖苷酶突变体D41G及其应用 | |
| CN117070500A (zh) | 热稳定性提高的β-木糖苷酶突变体D485G及其应用 | |
| CN117625581B (zh) | 一种N-乙酰氨基葡萄糖苷酶突变体Ea2F及其应用 | |
| CN113444709B (zh) | 一种κ-卡拉胶酶突变体及其应用 | |
| CN113604456B (zh) | 一种耐碱κ-卡拉胶酶及其应用 | |
| CN116555233A (zh) | 热不稳定的β-木糖苷酶突变体E179GD182G及其应用 | |
| CN117737038B (zh) | 一种N-乙酰氨基葡萄糖苷酶突变体De254PΔ5及其制备与应用 | |
| CN111394374A (zh) | 一种编码纤维素酶家族GH30的纤维素酶基因gk2691及其应用 | |
| CN112921025B (zh) | 一种差向异构酶的突变体，其编码基因、氨基酸序列及其应用 | |
| CN113481186B (zh) | 一种GH18几丁质酶ChiA及其应用 | |
| CN112626051B (zh) | 一种1,3/1,4-木聚糖酶mlx1034及其编码基因与应用 | |
| CN114214302A (zh) | 琼胶酶、编码基因、重组载体和宿主细胞及其应用以及新琼寡糖及其制备方法 | |
| CN114574511B (zh) | 极耐热木聚糖酶基因、极耐热木聚糖酶及其应用 | |
| CN105483108B (zh) | 一种l-阿拉伯糖异构酶及其在l-核酮糖生产中的应用 | |
| AU2021100409A4 (en) | Recombinant low-temperature catalase, recombinant vector and engineered strain thereof | |
| CN117050974A (zh) | 一种耐热κ-卡拉胶酶及其应用 | |
| CN111690628B (zh) | 一种中温下不稳定的外切菊粉酶突变体MutQ23Δ2 | |
| CN110982831B (zh) | 基因AlgL23具有冷适应性的用途 | |
| CN117737039B (zh) | 一种N-乙酰氨基葡萄糖苷酶突变体De259AΔ7及其制备与应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |