CN117050974A - 一种耐热κ-卡拉胶酶及其应用 - Google Patents

一种耐热κ-卡拉胶酶及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种耐热κ‑卡拉胶酶及其应用，耐热κ‑卡拉胶酶是由如SEQ ID NO.1所示序列的野生型κ‑卡拉胶酶经过其第154位氨基酸突变而成。与野生型κ‑卡拉胶酶相比，突变酶在50℃的残余活力比野生型酶高出50％左右，在55℃的残余活力比野生型高出10％左右，从而使该耐热κ‑卡拉胶酶在卡拉胶寡糖工业生产中具有良好的应用前景。

Description

一种耐热κ-卡拉胶酶及其应用
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种耐热κ-卡拉胶酶及其应用。
背景技术
卡拉胶是一种由α-1,3-D-半乳糖和β-1,4-D-半乳糖组成的线性硫酸化多糖，具有成胶能力，可作为食品增稠剂、凝胶剂、澄清剂等。根据结构中是否含有3，6-脱水-D-半乳糖，以及半乳糖上硫酸基团的位置和数量，卡拉胶主要分为κ-、ι-和λ-卡拉胶三种类型，其中κ-型应用最为广泛。κ-卡拉胶分子量大、粘度高、溶解性差，生物利用度低，其应用受到了限制。κ-卡拉胶的降解产物为κ-卡拉胶寡糖，具有抗炎、抗凝血、抗肿瘤和抗血栓形成等作用，广泛应用在食品、医药等领域。卡拉胶寡糖的制备方法有物理法、化学法和酶解法。其中，酶解法由于条件温和、反应特异性好等特点，应用最为广泛。κ-卡拉胶酶可用于寡糖的制备，该酶的来源广泛，主要来源于海洋细菌，如假单胞菌属(Pseudomonas sp.)、弧菌属(Vibrio sp.)、希瓦氏菌属(Shewanella sp.)等。高温可以降低κ-卡拉胶的粘度，促进κ-卡拉胶酶处理κ-卡拉胶，因此提高κ-卡拉胶酶的耐热性对于κ-卡拉胶的高值资源化利用具有重要意义。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决上述技术中的技术问题之一。为此，本发明提出了一种耐热κ-卡拉胶酶，其具有较高的热稳定性和水解卡拉胶能力。
为此，在本发明的第一个方面中，提供了一种耐热κ-卡拉胶酶，其由如SEQ ID NO：1所示序列的野生型κ-卡拉胶酶(WT)经过其第154位氨基酸突变而成。
根据本发明的实施例，所述耐热κ-卡拉胶酶是将野生型κ-卡拉胶酶的第154位氨基酸进行突变。与野生型κ-卡拉胶酶相比，突变酶在50℃的残余活力比野生型酶高出50％左右，在55℃的残余活力比野生型高出10％左右，从而使κ-卡拉胶酶在卡拉胶寡糖工业生产中具有良好的应用前景。
可选地，所述野生型κ-卡拉胶酶的第154位氨基酸由Glu变为Ala。
可选地，所述突变方式为定点突变。
在本发明的第二方面中，提供了一种编码上述耐热κ-卡拉胶酶的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
在本发明的第三个方面中，提供了一种构建体，其包含编码上述耐热κ-卡拉胶酶的基因。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
图1为野生型和突变型κ-卡拉胶酶的SDS-PAGE分析；
图2为野生型和突变型κ-卡拉胶酶的催化活性分析；
图3为野生型和突变型κ-卡拉胶酶的热稳定性分析；
图4为野生型和突变型κ-卡拉胶酶水解κ-卡拉胶的能力。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
下文的公开提供了许多不同的实施例或例子用来实现本发明的不同实施方式。为了简化本发明的公开，下文中对特定实施例或示例进行描述。当然，他们仅仅为示例，并且目的不在于限制本发明。此外，本发明提供的各种特定工艺和材料的例子，本领域普通技术人员可以意识到其他工艺的可应用性和/或其他材料的使用。除非另有说明，本发明的实施将采用本领域技术人员的能力范围之内的化学、分子生物学等领域的传统技术。另外，除非另有说明，在本文中，核酸以5′至3′的方向从左向右书写，氨基酸序列则以氨基端到羧基端的方向从左向右书写。
下面通过说明性的具体实施例对本发明进行描述，这些实施例并不以任何方式限制本发明的范围。特别说明的是：本发明所用到的试剂除特别说明外均有市售。
实施例1构建κ-卡拉胶酶突变体
突变酶重组表达载体的构建：
以携带野生型κ-卡拉胶酶编码基因(SEQ ID NO：1)的载体为模板进行定点突变，构建突变酶重组表达载体，引物按照突变试剂盒Mut ExpressⅡFast Mutagenesis Kit V2引物设计要求设计定点突变引物，突变引物如表1所示。其中，定点突变参照突变试剂盒MutExpressⅡFast Mutagenesis Kit V2的说明书进行操作。
表1突变引物表
突变位点 序列(5′-3′)
E154A-F AACTgcgAATGGTGATGTACAGTACAGTGAAATTG SEQ ID NO:3
E154A-R CATCACCATTcgcAGTTAATGTGCGATCTATTGTGCTATAC SEQ ID NO:4
包括目标质粒扩增、扩增产物Dpn I消化、重组反应三个步骤。
目标质粒扩增：
依次加入上述试剂后，混合均匀，然后进行PCR。PCR反应参数：95℃ 30s，95℃15s，60℃ 15s，72℃ 2min，30次循环，72℃ 5min，4℃保存。
扩增产物DpnⅠ消化：
DpnⅠ 1μL
扩增产物 40～50μL
在PCR反应液中加入1μL Dpn I并混匀，37℃反应1h 30min。
重组反应：
置于37℃恒温反应30min后，降至4℃或立即置于冰上冷却。
重组产物转化表达宿主：
(1)在冰上解冻E.coli BL21感受态细胞。
(2)取10μL重组产物加入到100μL感受态细胞中，轻弹管壁混匀，冰上静置30min。
(3)42℃水浴热激45s后，立即置于冰上冷却2～3min。
(4)加入900μL LB液体培养基(不添加抗生素)，37℃摇菌1h(转速200rpm)。
(5)将卡那霉素抗性的LB固体培养基平板在37℃培养箱中预热。
(6)4,000rpm离心5min，弃掉900μL上清。用剩余培养基将菌体重悬，在37℃恒温箱中倒置培养12～16h。利用菌落PCR进行重组质粒鉴定，并经测序验证突变酶的基因序列。
κ-卡拉胶酶的诱导表达和纯化：
从LB平板(含卡那霉素100μg/mL)挑取阳性克隆的单菌落移至5mL LB培养基(含卡那霉素100μg/mL)，37℃摇动(180rpm)培养过夜。将过夜培养物按照1％的接种量接种于300mL LB液体培养基(含100μg/mL卡那霉素)，转接完后在37℃继续振摇培养至细菌OD600值达1.0～1.2。加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度0.5mmol/L，16℃低温诱导表达，用于后续的亲和层析纯化。诱导表达的菌液于5000rpm离心5min，细胞重悬于10～20mL预冷的溶解缓冲液(50mmol/L NaH2PO4，300mmol/L NaCl，15mmol/L咪唑；pH8.0)。冰浴条件下进行超声波破菌(处理总时间约15min；每次可以处理5s，间隔5s后再处理，间隔的时间内摇动菌液使其混匀)，4℃下15000rpm离心20min。适量Ni-NTA agarose用预冷的溶解缓冲液平衡后，与上清(上清用0.22微米滤膜过滤)混匀，4℃下摇动反应0.5～1h。用预冷的洗涤缓冲液(50mmol/L NaH2PO4，300mmol/L NaCl，30mmol/L咪唑；pH8.0)洗去杂蛋白，至流出液的OD280趋近于零。用预冷的洗脱缓冲液(50mmol/L NaH2PO4，300mmol/L NaCl，250mmol/L咪唑；pH8.0)洗脱目的蛋白。利用亲和层析对重组蛋白进行分离纯化。采用SDS-PAGE分析纯化后目标蛋白的分子量及其纯度。
SDS-PAGE分析如图1所示，图中，泳道M为蛋白质分子量标准，1为WT，2为E154A。突变酶的分子质量与野生型酶一致，大小约为35.0kDa。
实施例2耐热κ-卡拉胶酶的酶学性质测定
κ-卡拉胶酶活力的测定：将WT和突变体E154A的蛋白质浓度稀释至相同浓度水平。将10酶液与490μL含有0.5％(w/v)浓度的卡拉胶底物溶液(以50mmol/L NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液配制，pH 8.0)在40℃下反应15min，加入500μL DNS试剂终止反应，沸水浴10min冷却，测定520nm处吸光值。利用半乳糖标准曲线，确定产生的还原糖含量。每分钟释放1μmoL还原糖(以半乳糖计)所需的酶量为一个酶活力单位(U)。酶活性分析结果如图2所示，突变酶的比活力比野生型高出29％左右。
κ-卡拉胶酶的最适反应温度和最适反应pH测定：将WT和突变体E154A的蛋白质浓度稀释至相同浓度水平。在30–60℃的温度范围内，以5℃的间隔，分别测定野生型和突变体在不同温度下的活力，分析酶的最适反应温度。在6.0–10.0的pH范围内，以1.0的间隔，分布测定野生型和突变体在不同pH下的活力，分析酶的最适反应pH。
κ-卡拉胶酶的耐热性测定：将纯化的酶在45-60℃处理30min后，测定酶的残留活性，分析酶的耐热性。蛋白质在X分钟(T50 X)后保持一半剩余活性的温度是蛋白质失活的常用指标，计算酶的T50 30值。将酶在50℃和60℃下分别处理不同时间后，测定酶的残余活力，计算酶在50℃和60℃下的酶活性的半衰期(t1/2)。
耐热性分析结果如图3所示，突变酶在50℃的残余活力比野生型酶高出50％左右，在55℃的残余活力比野生型高出10％左右。其他酶学性质的分析结果表2所示，突变酶和野生型酶的最适反应温度和pH不变，分别为40℃和pH8.0。在50℃，野生型酶的半衰期是原始型酶的15.4倍。突变酶的T50比原始酶高出4.0℃。
表2κ-卡拉胶酶突变体E54A的部分酶学性质
实施例3κ-卡拉胶酶降解κ-卡拉胶
用50mmol/L的NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液(pH 8.0)制备15mL含有0.5％(w/v)的κ-卡拉胶底物溶液，加入2U酶，40℃恒温反应2h，分别于15、30、60、90、120min取样500μL，沸水浴灭活10min，利用DNS法测定野生型酶及突变酶的还原糖生成量。
结果如图4所示，在40℃下，15–90min时，突变酶对κ-卡拉胶的降解率高于野生型，表明突变酶对κ-卡拉胶的降解能力高于野生型酶，能够使κ-卡拉胶酶更好的应用于卡拉胶寡糖工业生产。
综上，根据本发明的实施例，采用定点突变技术将野生型酶进行定点突变，通过将其第154位氨基酸由Glu变为Ala，突变酶的热稳定性得到了一定的提高，在一定程度上提高了对卡拉胶的降解，在卡拉胶寡糖的工业生产中有良好的应用潜力。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不应理解为必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例进行接合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (5)

1.一种耐热κ-卡拉胶酶，其特征在于，由如SEQ ID NO 1：所示序列的野生型κ-卡拉胶酶经过其第154位氨基酸突变而成。
2.如权利要求1所述的耐热κ-卡拉胶酶，其特征在于，所述野生型κ-卡拉胶酶的第154位氨基酸由Glu变为Ala。
3.如权利要求1所述的耐热κ-卡拉胶酶，其特征在于，所述突变方式为定点突变。
4.一种编码权利要求1所述的耐热κ-卡拉胶酶的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO 2：所示。
5.一种构建体，其特征在于，包含如权利要求4所述的基因。
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