CN115806963A - 一种褐藻酸裂解酶突变体及其制备方法与应用以及一种重组表达载体和重组表达菌株 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种褐藻酸裂解酶突变体及其制备方法与应用以及一种重组表达载体和重组表达菌株，属于基因工程技术领域。本发明涉及一种褐藻酸裂解酶突变体，包括褐藻酸裂解酶突变体FlAlyA‑H71K或褐藻酸裂解酶突变体FlAlyA‑H176D；所述褐藻酸裂解酶突变体FlAlyA‑H71K的氨基酸序列如SEQIDNO：1所示；所述褐藻酸裂解酶突变体FlAlyA‑H176D的氨基酸序列如SEQIDNO：3所示。本发明的褐藻酸裂解酶突变体较野生型褐藻酸裂解酶的热稳定性提高。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种褐藻酸裂解酶突变体及其制备方法与应用以及一种重组表达载体和重组表达菌株。
背景技术
褐藻酸是一种主要由褐藻以及细菌产生的线性酸性多糖，是褐藻门植物如海带、裙带菜等细胞壁的主要成分。主要由两种单体，β-D-甘露糖醛酸(M)和α-L-古罗糖醛酸(G)组成。各个单体之间通过1→4糖苷键相连，可在褐藻酸中形成三个不同的嵌段：均聚甘露糖醛酸片段(polyM)、均聚古罗糖醛酸片段(polyG)、以及由两个单体交替连接形成杂合片段(polyMG)。
褐藻酸因聚合度高、分子量大、粘度高等很难被机体吸收利用，限制了其应用。褐藻酸寡糖(AOs)是褐藻酸的降解产物，具有显著的生理活性，如免疫调节、抗菌、抗氧化、益生元、抗高血压、抗糖尿病、抗肿瘤和抗凝血活性等。同时AOs可加速微生物代谢、促进根的生长、提高植物的产量和质量、提高植物的抗病性、诱导植物免疫性，可用于制备生物肥料。
现在制备AOs的方法主要包括物理降解法、化学法和酶法。与物理和化学方法相比，酶法生产AOs更环保、更节能、可持续发展潜力大。目前褐藻酸裂解酶已成为研究的热点。褐藻胶酸裂解酶属于多糖裂解酶家族(polysaccharidelyasefamily，PLs)，可通过β-消除来降解褐藻酸产生AOs。然而褐藻酸裂解酶在生产AOs时需要经过高温处理环节，这样导致酶活大大降低。因此需要开发一种热稳定性优良的褐藻酸裂解酶来满足市场的需求。
发明内容
本发明的目的在于提供一种褐藻酸裂解酶突变体及其制备方法与应用以及一种重组表达载体和重组表达菌株。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种褐藻酸裂解酶突变体，包括褐藻酸裂解酶突变体FlAlyA-H71K或褐藻酸裂解酶突变体FlAlyA-H176D；
所述褐藻酸裂解酶突变体FlAlyA-H71K的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；
编码所述褐藻酸裂解酶突变体FlAlyA-H71K的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；
所述褐藻酸裂解酶突变体FlAlyA-H176D的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；
编码所述褐藻酸裂解酶突变体FlAlyA-H176D的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
本发明还提供了一种所述褐藻酸裂解酶突变体的制备方法，所述褐藻酸裂解酶突变体FlAlyA-H71K的制备方法为：将褐藻酸裂解酶FlAlyA的第71位氨基酸进行突变得到褐藻酸裂解酶突变体FlAlyA-H71K；
所述褐藻酸裂解酶突变体FlAlyA-H176D的制备方法为：将褐藻酸裂解酶FlAlyA的第176位氨基酸进行突变得到褐藻酸裂解酶突变体FlAlyA-H176D。
作为优选，所述褐藻酸裂解酶FlAlyA的第71位氨基酸为组氨酸；
所述褐藻酸裂解酶突变体FlAlyA-H71K的第71位氨基酸为赖氨酸；
所述褐藻酸裂解酶FlAlyA的第176位氨基酸为组氨酸；
所述褐藻酸裂解酶突变体FlAlyA-H176D的第176位氨基酸为天冬氨酸。
本发明还提供了一种重组表达载体，包括编码所述褐藻酸裂解酶突变体FlAlyA-H71K或FlAlyA-H176D的核苷酸序列以及空载载体pET22b(+)。
本发明还提供了所述的重组表达载体的制备方法，包括如下步骤：将编码所述褐藻酸裂解酶突变体FlAlyA-H71K或FlAlyA-H176D的核苷酸序列与pET22b(+)连接，得到重组表达载体；
所述连接的位点为限制性内切酶Nde I和Xho I双酶切后的位点。
本发明还提供了一种重组表达菌株，包括所述重组表达载体以及出发菌株；
所述出发菌株为大肠杆菌BL21-CodonPlus-RIL。
本发明还提供了所述的重组表达菌株的制备方法，包括如下步骤：将所述的重组表达载体导入出发菌株中，诱导表达得到重组表达菌株。
作为优选，所述诱导的诱导剂为异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)；
所述异丙基-β-D-硫代半乳糖苷的终浓度为0.1mM；
所述诱导的温度为23～27℃；
所述诱导的时间为22～26h。
本发明还提供了所述褐藻酸裂解酶突变体在制备热稳定性高的产品方面的应用。
本发明还提供了所述重组表达载体或所述重组表达菌株在制备热稳定性高的产品方面的应用。
本发明提供了一种褐藻酸裂解酶突变体及其制备方法与应用以及一种重组表达载体和重组表达菌株。
本发明的褐藻酸裂解酶突变体具有热稳定性高，产量高的特性，可以进行工业生产。
本发明提供的褐藻酸裂解酶突变体FlAlyA-H71K的酶活可达到1.11×105U/mg，最适pH8.0，在pH 7.0～9.0条件下具有80％以上的酶活力，具有良好的pH稳定性；最适温度50℃，且在40-55℃时酶活力仍保留80％以上。与野生型褐藻酸裂解酶FlAlyA相比，ΔTm为0.33℃。褐藻酸裂解酶突变体FlAlyA-H176D的酶活可达到0.95×105U/mg，最适温度50℃，最适pH8.0；与野生型褐藻酸裂解酶FlAlyA相比，ΔTm为1.26℃且在50℃时的半衰期显著延长，表明其热稳定性提高。此外，1L发酵液可获得600±50mg FlAlyA-H71K和FlAlyA-H176D纯酶，远高于现有水平，为褐藻酸裂解酶的工业化生产提供了可能。
附图说明
图1为野生型褐藻酸裂解酶和褐藻酸裂解酶突变体不同pH下的酶活(其中●代表FlAlyA-H71K，■代表野生型褐藻酸裂解酶AL，▲代表FlAlyA-H176D)。
图2为野生型褐藻酸裂解酶和褐藻酸裂解酶突变体不同温度下的酶活(其中●代表野生型褐藻酸裂解酶AL，■代表FlAlyA-H71K，▲代表FlAlyA-H176D)。
图3为野生型褐藻酸裂解酶和褐藻酸裂解酶突变体的Tm测定。
图4为野生型褐藻酸裂解酶和褐藻酸裂解酶突变体不同温度下的残留酶活(其中，●代表野生型褐藻酸裂解酶AL，■代表FlAlyA-H71K，▲代表FlAlyA-H176D)。
具体实施方式
本发明提供了一种褐藻酸裂解酶突变体，包括褐藻酸裂解酶突变体FlAlyA-H71K或褐藻酸裂解酶突变体FlAlyA-H176D；所述褐藻酸裂解酶突变体FlAlyA-H71K的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；编码所述褐藻酸裂解酶突变体FlAlyA-H71K的核苷酸序列如SEQ IDNO：2所示；所述褐藻酸裂解酶突变体FlAlyA-H176D的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；编码所述褐藻酸裂解酶突变体FlAlyA-H176D的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
本发明还提供了一种所述褐藻酸裂解酶突变体的制备方法，所述褐藻酸裂解酶突变体FlAlyA-H71K的制备方法为：将褐藻酸裂解酶FlAlyA的第71位氨基酸进行突变得到褐藻酸裂解酶突变体FlAlyA-H71K；所述褐藻酸裂解酶突变体FlAlyA-H176D的制备方法为：将褐藻酸裂解酶FlAlyA的第176位氨基酸进行突变得到褐藻酸裂解酶突变体FlAlyA-H176D。
在本发明中，所述褐藻酸裂解酶FlAlyA的第71位氨基酸为组氨酸；所述褐藻酸裂解酶突变体FlAlyA-H71K的第71位氨基酸为赖氨酸；所述褐藻酸裂解酶FlAlyA的第176位氨基酸为组氨酸；所述褐藻酸裂解酶突变体FlAlyA-H176D的第176位氨基酸为天冬氨酸。
本发明还提供了一种重组表达载体，包括编码所述褐藻酸裂解酶突变体FlAlyA-H71K或FlAlyA-H176D的核苷酸序列以及空载载体pET22b(+)。
本发明还提供了所述的重组表达载体的制备方法，包括如下步骤：将编码所述褐藻酸裂解酶突变体FlAlyA-H71K或FlAlyA-H176D的核苷酸序列与pET22b(+)连接，得到重组表达载体；所述连接的位点为限制性内切酶Nde I和Xho I双酶切后的位点。
本发明还提供了一种重组表达菌株，包括所述重组表达载体以及出发菌株；所述出发菌株为大肠杆菌BL21-CodonPlus-RIL。
本发明还提供了所述的重组表达菌株的制备方法，包括如下步骤：将所述的重组表达载体导入出发菌株中，诱导表达得到重组表达菌株。在本发明中，所述诱导的诱导剂为异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)；所述异丙基-β-D-硫代半乳糖苷的终浓度为0.1mM；所述诱导的温度为23～27℃；所述诱导的时间为22～26h。
本发明还提供了所述褐藻酸裂解酶突变体在制备热稳定性高的产品方面的应用。在本发明中，所述应用为将褐藻酸裂解酶突变体构建重组表达载体，在将所述重组表达载体导入出发菌株中得到重组表达菌株，培养所述的重组表达菌株，收集菌体，破碎菌体得到褐藻酸裂解酶突变体粗提取酶液，Ni柱纯化所述褐藻酸裂解酶突变体粗提取酶液，收集洗脱液得到褐藻酸裂解酶突变体酶液。
本发明还提供了所述重组表达载体或所述重组表达菌株在制备热稳定性高的产品方面的应用。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
在本发明实施例中所述的LB液体培养基包括如下浓度的组分：酵母提取物5g/L、蛋白胨10g/L、NaCl 10g/L。
在本发明实施例中所述的LB固体培养基包括如下浓度的组分：酵母提取物5g/L、蛋白胨10g/L、NaCl 10g/L、琼脂2g/L。
实施例1
褐藻酸裂解酶突变体基因序列的克隆
以野生型褐藻酸裂解酶FlAlyA基因如SEQ ID NO:6所述的序列为模板，设计引物FlAlyA-H71K-F及FlAlyA-H71K-R，PCR扩增得到突变体FlAlyA-H71K基因序列如SEQ ID NO:2所示；以野生型褐藻酸裂解酶FlAlyA基因为模板，设计引物FlAlyA-H176D-F及FlAlyA-H176D-R，PCR扩增得到突变体FlAlyA-H176D基因序列如SEQ ID NO:4所示；SEQ ID NO:6编码的野生型褐藻酸裂解酶FlAlyA的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。
FlAlyA-H71K-F(SEQ ID NO:7)：5'-CACGGCTAATACGAAGTATTCTCGTTCTGAGCTAAGAGAGACA-3'
FlAlyA-H71K-R(SEQ ID NO:8):5'-ACTTCGTATTAGCCGTGGTCACTCCCGAAGGA-3'
FlAlyA-H176D-F(SEQ ID NO:9):5'-TTCAGAAGATGCTTGGGGTGATGATGAAGGTC-3'
FlAlyA-H176D-R(SEQ ID NO:10):5'-CCCAAGCATCTTCTGAAAGCATTTCTTTATAAGGCG-3'
本实施例所述的野生型褐藻酸裂解酶FlAlyA的基因序列由上海生工生物工程股份有限公司完成。
实施例2
褐藻酸裂解酶突变体的表达
将藻酸裂解酶突变体FlAlyA-H71K的基因片段和空载载体pET22b(+)分别用限制性内切酶Nde I和Xho I双酶切，得到具有粘性末端的载体pET22b(+)片段；将所述具有相同粘性末端的褐藻酸裂解酶基因片段和载体pET22b(+)片段通过同源重组连接，获得褐藻酸裂解酶重组表达载体，并转化大肠杆菌DH5α，用氨苄青霉素进行选择，并对克隆进行测序验证。测序正确后，即得到含有褐藻酸裂解酶基因的重组载体pET22b(+)-FlAlyAH71K。
按照上述同样的方法构建含有褐藻酸裂解酶突变体FlAlyA-H176D的重组载体pET22b(+)-FlAlyAH176D。
将重组载体pET22b(+)-FlAlyAH71K和重组载体pET22b(+)-FlAlyAH176D分别导入出发菌株BL21-CodonPlus-RIL中，得到重组表达菌株BL21-pET22b(+)-FlAlyAH71K和BL21-pET22b(+)-FlAlyAH176D。
挑取单克隆重组表达菌株BL21-pET22b(+)-FlAlyAH71K和BL21-pET22b(+)-FlAlyAH176D分别接种于LB固体培养基中，37℃，220rpm过夜，然后转接至LB液体培养基中，37℃，220rpm摇至OD600到0.8时，添加IPTG至终浓度0.1mM，25℃，220rpm诱导24h。诱导结束后，在4℃条件下，8000rpm，离心20min，收集菌体。每1g湿菌体加入25mL(20mM Tris，300mMNaCl(pH 7.0))混合液重悬菌体得到菌液，每50mL菌液于100mL烧杯中，冰水浴条件下，以600W功率，超声2s，间歇2s，破碎10min以裂解菌体细胞。在4℃条件下，7200rpm，15min离心后，弃去沉淀，保留上清即为褐藻酸裂解酶突变体的粗提取酶溶液。用上述所述的混合液重悬粗提取酶溶液，得到粗酶液，用购自上海翊圣的Ni柱纯化粗酶液，20mM咪唑洗杂，500mM咪唑洗脱，收集洗脱液，进行蛋白SDS-PAGE电泳检测。得到纯化的褐藻酸裂解酶突变体酶液。
实施例3
褐藻酸裂解酶突变体的表达
褐藻酸裂解酶突变体酶活力测定时的底物配置方法为：称取0.5g海藻酸钠至100mL10mM的磷酸钠缓冲液中，100℃加热搅拌至溶解，然后添加NaCl至其终浓度为100mM，添加BSA至其终浓度为0.1mg/mL。
酶活力单位为每分钟水解使吸光度增加0.01所需的酶量。
酶活的测定方法为：900μL 0.5％底物+100μL稀释的酶液(0.01mg/mL)，混合后于30℃反应10min后，100℃煮沸10min，终止反应，得到样品。将所述的样品稀释20倍后用酶标仪测235nm波长处的吸光度，并换算成相应酶活单位。
取实施例2的得到的纯化的褐藻酸裂解酶突变体酶液，在温度为30℃条件下，分别测定pH值为6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0条件下的褐藻酸裂解酶突变体的酶活力，测定结果如图1所示。
图1显示褐藻酸裂解酶突变体FlAlyA-H71K和FlAlyA-H176D的最适pH均为8.0，突变体FlAlyA-H71K在pH 7.0～9.0条件下具有80％以上的酶活力，具有良好的pH稳定性。
取实施例2的得到的纯化的褐藻酸裂解酶突变体酶液，在pH值为8.0时，分别检测30、40、45、50、55、60、70℃条件下褐藻酸裂解酶突变体的酶活力，测定结果如图2所示。
图2显示，突变体FlAlyA-H71K的最适温度为50℃，且在40～55℃时酶活力保持在80％以上。FlAlyA-H176D的最适反应温度为50℃。由此可见，突变体FlAlyA-H71K和FlAlyA-H176D在较高温度下可保持较高酶活。
取实施例2的得到的纯化的褐藻酸裂解酶突变体酶液稀释至0.4mg/mL，通过圆二色谱仪测定蛋白在216nm处的椭圆度变化，经Boltzman equation拟合后求得Tm值。圆二色谱仪参数设置:温度范围：20～90℃，温度间隔：5℃，波长范围：190～260nm，波长间隔：1nm。结果如图3所示。
图3显示，突变体FlAlyA-H71K的Tm为50.57℃，突变体FlAlyA-H176D的Tm为51.50℃。由此可见，本发明的褐藻酸裂解酶突变株具有较好的热稳定性。
取实施例2的得到的纯化的褐藻酸裂解酶突变体酶液，在温度为50℃时，保温5、10、15、20、25、30min，分别检测褐藻酸裂解酶突变体的残留酶活力，测定结果如图4所示。
图4显示，在温度为50℃时，保温不同的时间，突变体FlAlyA-H71K和突变体FlAlyA-H176D的残留酶活要高，表明其温度稳定性增强。
实施例4
使用赛默飞NanoDrop2000C超微量分光光度计测量蛋白浓度。经过检测得到1L重组表达菌株BL21-pET22b(+)-FlAlyAH71K和BL21-pET22b(+)-FlAlyAH176D的发酵液经过分离纯化后可以获得600±50mg的FlAlyA-H71K和FlAlyA-H176D纯酶。远高于其他褐藻酸裂解酶，为褐藻酸裂解酶的工业化生产提供了可能。
对比例1
利用实施例2的方案设置野生型褐藻酸裂解酶重组表达载体和重组表达菌株，利用实施例3的方案设置野生型褐藻酸裂解酶的pH稳定性、温度稳定性、Tm以及不同时间内的残留酶活力与实施例3的褐藻酸裂解酶突变体进行比较。结果如图1～4所示。
图1～4所述，野生型褐藻酸裂解酶的最适pH为8.0，在30～70℃温度范围内野生型褐藻酸裂解酶的酶活低于褐藻酸裂解酶的突变体FlAlyA-H71K。野生型褐藻酸裂解酶的Tm为50.24℃，低于褐藻酸裂解酶突变体。
由以上实施例可知，本发明提供了一种褐藻酸裂解酶突变体及其制备方法与应用以及一种重组表达载体和重组表达菌株。褐藻酸裂解酶突变体FlAlyA-H71K的酶活可达到1.11×105U/mg，最适pH8.0；最适温度50℃，在pH 7.0～9.0条件下具有80％以上的酶活力，具有良好的pH稳定性；最适温度50℃，且在40～55℃时酶活力保持在80％以上。与野生型褐藻酸裂解酶FlAlyA相比，ΔTm为0.33℃。褐藻酸裂解酶突变体FlAlyA-H176D的酶活可达到0.95×105U/mg，最适pH8.0，与野生型褐藻酸裂解酶FlAlyA相比，ΔTm为1.26℃，表明其热稳定性提高。此外，1L发酵液可获得600±50mg FlAlyA-H71K和FlAlyA-H176D纯酶，远高于现有水平，为褐藻酸裂解酶的工业化生产提供了可能。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种褐藻酸裂解酶突变体，其特征在于，包括褐藻酸裂解酶突变体FlAlyA-H71K或褐藻酸裂解酶突变体FlAlyA-H176D；
所述褐藻酸裂解酶突变体FlAlyA-H71K的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；
编码所述褐藻酸裂解酶突变体FlAlyA-H71K的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；
所述褐藻酸裂解酶突变体FlAlyA-H176D的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；
编码所述褐藻酸裂解酶突变体FlAlyA-H176D的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
2.一种权利要求1所述褐藻酸裂解酶突变体的制备方法，其特征在于，所述褐藻酸裂解酶突变体FlAlyA-H71K的制备方法为：将褐藻酸裂解酶FlAlyA的第71位氨基酸进行突变得到褐藻酸裂解酶突变体FlAlyA-H71K；
所述褐藻酸裂解酶突变体FlAlyA-H176D的制备方法为：将褐藻酸裂解酶FlAlyA的第176位氨基酸进行突变得到褐藻酸裂解酶突变体FlAlyA-H176D。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述褐藻酸裂解酶FlAlyA的第71位氨基酸为组氨酸；
所述褐藻酸裂解酶突变体FlAlyA-H71K的第71位氨基酸为赖氨酸；
所述褐藻酸裂解酶FlAlyA的第176位氨基酸为组氨酸；
所述褐藻酸裂解酶突变体FlAlyA-H176D的第176位氨基酸为天冬氨酸。
4.一种重组表达载体，其特征在于，包括编码权利要求1所述褐藻酸裂解酶突变体FlAlyA-H71K或FlAlyA-H176D的核苷酸序列以及空载载体pET22b(+)。
5.权利要求4所述的重组表达载体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将编码权利要求1所述褐藻酸裂解酶突变体FlAlyA-H71K或FlAlyA-H176D的核苷酸序列与pET22b(+)连接，得到重组表达载体；
所述连接的位点为限制性内切酶Nde I和Xho I双酶切后的位点。
6.一种重组表达菌株，其特征在于，包括权利要求4所述重组表达载体以及出发菌株；
所述出发菌株为大肠杆菌BL21-CodonPlus-RIL。
7.权利要求6所述的重组表达菌株的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将权利要求4所述的重组表达载体导入出发菌株中，诱导表达得到重组表达菌株。
8.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述诱导的诱导剂为异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)；
所述异丙基-β-D-硫代半乳糖苷的终浓度为0.1mM；
所述诱导的温度为23～27℃；
所述诱导的时间为22～26h。
9.权利要求1所述褐藻酸裂解酶突变体在制备热稳定性高的产品方面的应用。
10.权利要求4所述重组表达载体或权利要求6所述重组表达菌株在制备热稳定性高的产品方面的应用。
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